Shewanella oneidensis PKA 1008 유래 조효소 처리에 의한 큰잎모자반(Sargassum coreanum) 추출 분해물의 면역증진 효과 Immuno-Enhancing Effect of Enzymatic Extract of Sargassum coreanum Using Crude Enzyme from Shewanella oneidensis PKA 1008원문보기
큰잎모자반에 함유되어 있는 다당류를 저분자화하기 위해 알긴산분해 효소를 생산하는 Shewanella oneidensis PKA 1008의 조효소액을 첨가하여 저분자화하고 이의 면역증진능을 확인하였다. 먼저 저분자화됨을 확인하기 위하여 TLC를 실시한 결과 분해 24 h 이후부터 분해되기 시작하여 최종 60 h에서 dimers로 분해되었다. 그 후 비장세포에 큰잎모자반의 효소적 추출 분해물을 처리하여 in vitro에서 면역증진능을 확인한 결과 $IFN-{\gamma}$, IL-2, IL-6, IL-10의 경우 분해가 진행될수록 분비량이 많아졌다. 또한, 큰잎모자반의 효소적 추출 분해물을 2주 동안 마우스에 경구투여 한 결과, MTT assay 및 비장세포에서 분비되는 $IFN-{\gamma}$ 및 IL-2의 분비량의 경우 24 h 처리구에서 대조군보다 높은 수치로 농도 의존적으로 증가함을 나타내었다. IgG2a 분비량의 경우 24 h와 48 h 처리구에서 다소 증가하였으며, NK 세포의 경우 24 h 처리구에서 농도 의존적으로 활성이 증가하여 면역력을 증진시키는 결과를 보여주고 있다. 전혈을 이용하여 일반혈액검사의 경우 24 h 및 48 h 처리군에서 대조군보다 높은 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 종합해볼 때 S. oneidensis PKA 1008 유래 조효소에 의한 큰잎모자반 효소적 추출 분해물이 면역 관련 세포증식률을 증가시키고 이에 따른 사이토카인의 분비량을 증가시키며 혈액 내 다양한 면역세포들의 수치를 증가시킴으로써 면역증진능에 탁월한 효과를 나타냄을 확인하였으나, 면역증진 효과에 기여하는 활성물질에 대해서는 밝혀지지 않아 그에 대한 추가적인 연구가 요구된다.
큰잎모자반에 함유되어 있는 다당류를 저분자화하기 위해 알긴산 분해 효소를 생산하는 Shewanella oneidensis PKA 1008의 조효소액을 첨가하여 저분자화하고 이의 면역증진능을 확인하였다. 먼저 저분자화됨을 확인하기 위하여 TLC를 실시한 결과 분해 24 h 이후부터 분해되기 시작하여 최종 60 h에서 dimers로 분해되었다. 그 후 비장세포에 큰잎모자반의 효소적 추출 분해물을 처리하여 in vitro에서 면역증진능을 확인한 결과 $IFN-{\gamma}$, IL-2, IL-6, IL-10의 경우 분해가 진행될수록 분비량이 많아졌다. 또한, 큰잎모자반의 효소적 추출 분해물을 2주 동안 마우스에 경구투여 한 결과, MTT assay 및 비장세포에서 분비되는 $IFN-{\gamma}$ 및 IL-2의 분비량의 경우 24 h 처리구에서 대조군보다 높은 수치로 농도 의존적으로 증가함을 나타내었다. IgG2a 분비량의 경우 24 h와 48 h 처리구에서 다소 증가하였으며, NK 세포의 경우 24 h 처리구에서 농도 의존적으로 활성이 증가하여 면역력을 증진시키는 결과를 보여주고 있다. 전혈을 이용하여 일반혈액검사의 경우 24 h 및 48 h 처리군에서 대조군보다 높은 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 종합해볼 때 S. oneidensis PKA 1008 유래 조효소에 의한 큰잎모자반 효소적 추출 분해물이 면역 관련 세포증식률을 증가시키고 이에 따른 사이토카인의 분비량을 증가시키며 혈액 내 다양한 면역세포들의 수치를 증가시킴으로써 면역증진능에 탁월한 효과를 나타냄을 확인하였으나, 면역증진 효과에 기여하는 활성물질에 대해서는 밝혀지지 않아 그에 대한 추가적인 연구가 요구된다.
The immuno-enhancing effects of alginate oligosaccharides from Sargassum coreanum were investigated. The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from S. oneidensis PKA 1008. The degraded alginate oligosaccharides were visualized by thin-layer chromatography developed ...
The immuno-enhancing effects of alginate oligosaccharides from Sargassum coreanum were investigated. The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from S. oneidensis PKA 1008. The degraded alginate oligosaccharides were visualized by thin-layer chromatography developed using a solvent system of 1-butanol/methanol/water, 4:1:2 (v/v/v). Alginate was degraded into dimmers at 60 h. As a result, the levels of Th1 cytokine [interferon $(IFN)-{\gamma}$ and interleukin (IL)-2] and Th2 cytokine (IL-6 and IL-10) increased with increasing incubation time compared to the control in vitro. Enzymatic extract treatment promoted proliferation of splenocytes at concentrations of 100 and 200 mg/kg at 24 h in vivo. Secretion of $IFN-{\gamma}$ and IL-2 significantly increased in a dose-dependent manner at 24 h as well as induced higher production of IgG2a in serum. Natural killer cell activity was measured and tended to increase. In addition, complete blood cell counts increased in a dose-dependent manner. These results indicate that alginate oligosaccharides produced by crude enzyme from S. oneidensis PKA 1008 may have significant immune activities.
The immuno-enhancing effects of alginate oligosaccharides from Sargassum coreanum were investigated. The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from S. oneidensis PKA 1008. The degraded alginate oligosaccharides were visualized by thin-layer chromatography developed using a solvent system of 1-butanol/methanol/water, 4:1:2 (v/v/v). Alginate was degraded into dimmers at 60 h. As a result, the levels of Th1 cytokine [interferon $(IFN)-{\gamma}$ and interleukin (IL)-2] and Th2 cytokine (IL-6 and IL-10) increased with increasing incubation time compared to the control in vitro. Enzymatic extract treatment promoted proliferation of splenocytes at concentrations of 100 and 200 mg/kg at 24 h in vivo. Secretion of $IFN-{\gamma}$ and IL-2 significantly increased in a dose-dependent manner at 24 h as well as induced higher production of IgG2a in serum. Natural killer cell activity was measured and tended to increase. In addition, complete blood cell counts increased in a dose-dependent manner. These results indicate that alginate oligosaccharides produced by crude enzyme from S. oneidensis PKA 1008 may have significant immune activities.
이를 비장세포에 처리하여 in vitro에서의 면역증진 관련 사이토카인을 측정함으로써 면역증진 효과를 확인하고자 하였다. 그 후 마우스에 경구투여하여 in vivo 실험을 통해 면역증진과 관련된 사이토카인 분비량, immunoglobulin 분비량, NK 세포 활성, 일반 혈액 검사를 측정함으로써 효소적 추출 분해물이 면역증진에 미치는 영향을 규명하고자 한다.
제안 방법
따라서 본 연구에서는 알긴산 분해 효소를 생산하는 S. oneidensis PKA 1008의 조효소액을 큰잎모자반에 처리하여 저분자화된 효소적 추출 분해물을 얻었다. 이를 비장세포에 처리하여 in vitro에서의 면역증진 관련 사이토카인을 측정함으로써 면역증진 효과를 확인하고자 하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 균주는 Sunwoo 등(10)의 연구에서 동정한 S. oneidensis PKA 1008 균주로 부산 연안 송정 앞바다에서 사멸기에 접어들어 분해가 진행 중인 녹조류 구멍갈파래로부터 분리하였다. 이를 16S rRNA sequence analysis로 분석하였고 이후 16S rDNA 염기서열은 blast server를 사용하여 염기서열을 비교 분석하여 균들을 동정하였다.
본 실험에서는 생후 6주령의 수컷, Balb/c 마우스(n=5)를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 마우스는 온도 20±2°C, 습도 50±10%, 12 h 명암주기가 유지되는 동물 사육실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험 결과의 통계처리는 SAS program(Statistical Analytical System V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석한 후, Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 항목들 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
면역증진 활성을 알아보기 위해 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)법을 이용하여 비장세포 배양 상층액의 IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 사이토카인 분비량을 측정하였다. Anti-mouse IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 mAb를 well(Nunc, Roskilde, Denmark)에 넣은 후 4°C에서 하룻밤 동안 코팅시켰다.
성능/효과
100:1, 50:1의 경우도 마찬가지로 control에 비해 농도 의존적으로 증가함을 나타내었다. 따라서 24시간 동안 효소 처리한 추출물은 NK 세포를 농도 의존적으로 증가시켜 면역력을 증진시키는 결과를 보여주고 있다.
이는 Clerici 등(27)의 연구에 따르면 전염증성 사이토카인인 IL-6, IFN-γ 등이 과량 분비되어 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인들과 균형을 잘 이루지 못하게 되면 숙주의 생존력에 크게 영향을 미치게 된다. 따라서 IL-2, IL-6, IFN-γ의 사이토카인이 큰잎모자반의 효소적 추출 분해물에 의해 증가하여 면역반응이 증가하고 과잉된 면역반응은 IL-10의 생성이 함께 증가하면서 항상성을 유지하게 하는 것으로 생각된다.
59 ng/mL로 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 마우스에 효소 처리한 추출물을 경구투여 함으로써 효소 처리한 추출물이 마우스의 IgG2a 분비량을 증가시킴으로써 면역증진 효과를 보여주고 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
해조류의 효능은?
해조류는 나타나는 빛깔에 따라 갈조류(brown algae), 녹조류(green algae) 및 홍조류(red algae)로 나뉘며, 서식 환경의 특이성으로 다양한 생리활성 물질과 신종효소 등을 함유하고 있다(1). 특성 성분에서는 항염증, 항아토피, 항혈액응고 등의 활성에 효과적인 것으로 보고되고 있다. 그중 갈조류에 함유되어있는 탄수화물 중 약 70~80%를 차지하는 알긴산은 갈조류의 세포벽을 이루고 있으며, 2종류의 uronic acid인 β-D-mannuronic acid(M)와 α-L-guluronic acid(G)가 α-1,4 또는 β-1,4 결합으로 형성되어 있다(2,3).
알긴산의 산업적 이용에 있어서 존재하는 한계점은?
알긴산의 겔 형성은 polymannuronate와 polyguluronate의 구성 비율에 따라 강도와 유연성이 달라진다(5). 이처럼 다양한 물성의 알긴산은 식품첨가제, 식품가공용, 의약용 등으로의 연구가 많이 진행되고 있으나 상온에서의 용해시간이 길고 농도가 증가함에 따라 점도가 높아지는 문제 등으로 인한 산업적 이용에서의 한계점이 있다(6). 이러한 문제점을 해결하기 위해 저분자화하는 방법으로 산 또는 알칼리를 이용한 화학적 방법이나 열, 방사선 조사 등의 물리적 방법이 사용되고 있으나 효소를 이용한 효소적 가수분해 방법이 더 효과적이라고 알려져 있다(7).
큰잎모자반이란 무엇인가?
큰잎모자반(Sargassum coreanum)은 모자반과에 속하는 식용 갈조류로 보고된 생리활성 연구로는 일반적으로 유기용매를 이용한 항암(12), 항염증(13), 항응고(14) 등이 있다. 효소를 이용한 항산화 효과(15)에 관한 연구가 보고되어 있으나 미생물 유래의 효소 처리를 통한 생리활성 증진연구는 부족한 실정이다.
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