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사람 핵DNA로부터 FosB 유전자 프로모터 클로닝 및 활성도 분석

Cloning and Activity Analysis of the FosB Promoter Region from Human Genomic DNA

생명과학회지 = Journal of life science, v.27 no.8 = no.208, 2017년, pp.857 - 863  

나한흠 (강원대학교 자연과학대학 생명과학과) ,  강윤성 (유디피아 분자진단 연구소) ,  김근철 (강원대학교 자연과학대학 생명과학과)

초록
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FosB (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B) 유전자는 사람의 19번 염색체에 위치하고 있으며 약 43 KD의 단백질을 코딩하며, 발생 및 분화과정, 개체 유지, 발병 진행 등을 조절한다고 알려져 왔다. 본 연구에서는 바이오 마커 등의 가능성이 있다고 보고된 FosB 유전자의 프로모터를 클로닝하여 활성도를 분석하고자 하였다. FosB genomic DNA 서열을 확인한 결과, TSS upstream 방향의 약 1 Kb 안쪽 부위에 FosB 유전자 발현을 위한 중요한 요소들이 있을 것으로 추정하였고, 따라서 FosB genomic DNA의 upstream -1,555 부위부터 exon 1의 +73까지 부위에 대한 PCR 증폭을 수행하였다. 또한 클로닝 성공을 높이기 위하여 일차로 $TA-1^{st}FosBp$ plasmid를 얻은 후, 다시 $TA-1^{st}FosBp$ plasmid를 template로 Kpn1과 Nhe1 제한 효소 절단부위를 프라이머에 삽입한 후 제작하여 2차 PCR을 수행하였으며, $TA-2^{nd}FosBp$ 플라스미드를 제작한 후 제한 효소로 절단하여 pGL3-luc vector로 subcloning하였다. 제작된 pGL3-FosBp-luc를 이용하여 항암제에 대한 활성도를 분석하고자 A549 사람 폐암세포주에 pGL3-FosBp-luc 플라스미드를 transfection 한 후 luciferase 활성도 분석을 수행하였다. Luciferase 활성도 증가는 doxorubicin, taxol 등을 처리한 후 단백질 발현 양상과 비교 하였을 때도 일치되는 결과를 얻을 수 있었다. 그러므로 FosB프로모터 클로닝은 향후 유전자 발현 연구, 마커분석 등에 유용할 것으로 사료된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

The FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B (FosB) gene is located at chromosome 19, and encodes 43 Kda protein. Functionally, the FosB gene is important for differentiation, development, and pathogenesis. Furthermore, the FosB gene is suggested as possible biomarker for tracing disease pro...

주제어

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문제 정의

  • 특히, 1 Kb upstream 부위에는 약 20여개의 p53 결합 부위가 존재할 수 있을 것으로 분석되어지며, GATA-1, NF-kB, sp1 등과 같은 주요전사 인자들이 결합할 수 있는 부위도 다수 존재하는 것으로 확인 되었다. 그러므로 우리는 이 부위를 포함하여 FosB genomic DNA의 upstream -1,555 부위부터 exon 1의 +73 까지 약 1.6 kb의 FosB 프로모터 부위를 동정하고자 하였다(Fig. 1C).
  • 본 연구에서는 생물정보학 프로그램들을 활용하여 FosB의 프로모터 부위를 동정한 후, 이를 클로닝하고자 하였으며, 항암제 처리에 따른 활성도를 측정하여 향후 바이오 마커 분석 등에 적용하고자 하였다.
  • 본 연구에서는 여러가지 약제 조절 기작과 관련된 FosB 유전자의 프로모터를 클로닝하여 항암제 조절기작을 분석하는데 사용하고자 하였다. 우리는 정상세포를 이용하여 PCR 증폭을 이용하여 FosB genomic DNA의 upstream -1555 부위부터 exon 1의 +73 까지 약 1.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
유전자 클로닝은 어떤 용도로 사용되고 있는가? 유전자 클로닝은 필요한 단백질을 발현시켜 특성을 조사하는데 널리 이용 되고 있다. 목적에 따라 다양한 클로닝 전략이 있겠지만, 유전자의 프로모터 지역을 LacZ 또는 luciferase 등의 reporter 유전자에 결합시켜 효소 활성도를 측정하는 실험 방법은 유전자 발현 조절 기작을 조사하는데 정확도가 높기 때문에 매우 유용하다[4].
FosB 유전자에 대해 알려진 일반적 특성은 무엇인가? FosB (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B) 유전자는 사람의 19번 염색체에 위치하고 있으며 약 43 KD의 단백질을 코딩하며, 발생 및 분화과정, 개체 유지, 발병 진행 등을 조절한다고 알려져 왔다. 본 연구에서는 바이오 마커 등의 가능성이 있다고 보고된 FosB 유전자의 프로모터를 클로닝하여 활성도를 분석하고자 하였다.
Fos family에 속하는 모든 유전자와 Jun family와 결합으로 형성된 AP-1 전사인자는 세포 내에서 어떤 역할을 하는가? Fos family에 속하는 모든 유전자들은 Jun family와 결합하여 AP-1 전사인자를 형성할 수 있다[9]. AP-1 전사인자의 활성 증가는 세포내에서 특정 단백질들이 생산될 수 있도록 표적유전자에 대한 전사를 조절할 수 있으며, 발생 및 분화과정, 개체 유지, 발병 진행 등을 위해 중요한 기작이다[16, 23]. FosB 단백질에 대한 연구는 신경계통 질환 등에서 그 기능에 대한 많은 보고들이 있으며, 외부자극, 또는 환경적 변화, 특히 신경중심계(CNS; Central Nerve System)에서 고통 등을 조절하는 다양한 신호전달 기작에 의해 발현이 급격하게증가된다고 알려져 있다[8].
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참고문헌 (25)

  1. Chandra, R., Francis, T. C., Konkalmatt, P., Amgalan, A., Gancarz, A. M., Dietz, D. M. and Lobo, M. K. 2015. Opposing role for Egr3 in nucleus accumbens cell subtypes in cocaine action. J. Neurosci. 35, 7927-7937. 

  2. Chen, D. and Yang, H. 2015. Integrated analysis of differentially expressed genes in breast cancer pathogenesis. Oncol. Lett. 9, 2560-2566. 

  3. Gajewski, P. A., Turecki, G. and Robison, A. J. 2016. Differential expression of FosB proteins and potential target genes in select brain regions of addiction and depression patients. PLoS One 11, e0160355. 

  4. Halder, K., Benzler, M. and Hartig, J. S. 2012. Reporter assays for studying quadruplex nucleic acids. Methods 57, 115-121. 

  5. Imbe, H. and Kimura, A. 2016. Repeated forced swim stress affects the expression of pCREB and DeltaFosB and the acetylation of histone H3 in the rostral ventromedial medulla and locus coeruleus. Brain Res. Bull. 127, 11-22. 

  6. Jurado, J., Fuentes-Almagro, C. A., Prieto-Alamo, M. J. and Pueyo, C. 2007. Alternative splicing of c-fos pre-mRNA: contribution of the rates of synthesis and degradation to the copy number of each transcript isoform and detection of a truncated c-Fos immunoreactive species. BMC Mol. Biol. 8, 83. 

  7. Jurzak, M. and Adamczyk, K. 2013. Influence of genistein on c-Jun, c-Fos and Fos-B of AP-1 subunits expression in skin keratinocytes, fibroblasts and keloid fibroblasts cultured in vitro. Acta. Pol. Pharm. 70, 205-213. 

  8. Knight, W. D., Little, J. T., Carreno, F. R., Toney, G. M., Mifflin, S. W. and Cunningham, J. T. 2011. Chronic intermittent hypoxia increases blood pressure and expression of FosB/DeltaFosB in central autonomic regions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301, R131-139. 

  9. Lazenka, M. F., David, B. G., Lichtman, A. H., Nestler, E. J., Selley, D. E. and Sim-Selley, L. J. 2014. Delta FosB and AP-1-mediated transcription modulate cannabinoid CB(1) receptor signaling and desensitization in striatal and limbic brain regions. Biochem. Pharmacol. 91, 380-389. 

  10. Lobo, M. K., Zaman, S., Damez-Werno, D. M., Koo, J. W., Bagot, R. C., DiNieri, J. A., Nugent, A., Finkel, E., Chaudhury, D., Chandra, R., Riberio, E., Rabkin, J., Mouzon, E., Cachope, R., Cheer, J. F., Han, M. H., Dietz, D. M., Self, D. W., Hurd, Y. L., Vialou, V. and Nestler, E. J. 2013. DeltaFosB induction in striatal medium spiny neuron subtypes in response to chronic pharmacological, emotional, and optogenetic stimuli. J. Neurosci. 33, 18381-18395. 

  11. Martin, T. A., Jayanthi, S., McCoy, M. T., Brannock, C., Ladenheim, B., Garrett, T., Lehrmann, E., Becker, K. G. and Cadet, J. L. 2012. Methamphetamine causes differential alterations in gene expression and patterns of histone acetylation/hypoacetylation in the rat nucleus accumbens. PLoS One 7, e34236. 

  12. Martin-Gallardo, A., McCombie, W. R., Gocayne, J. D., FitzGerald, M. G., Wallace, S., Lee, B. M., Lamerdin, J., Trapp, S., Kelley, J. M. and Liu, L. I. 1992. Automated DNA sequencing and analysis of 106 kilobases from human chromosome 19q13.3. Nat. Genet. 1, 34-39. 

  13. Milde-Langosch, K., Roder, H., Andritzky, B., Aslan, B., Hemminger, G., Brinkmann, A., Bamberger, C. M., Loning, T. and Bamberger, A. M. 2004. The role of the AP-1 transcription factors c-Fos, FosB, Fra-1 and Fra-2 in the invasion process of mammary carcinomas. Breast Cancer Res. Treat. 86, 139-152. 

  14. Na, H. H., Noh, H. J., Cheong, H. M., Kang, Y. and Kim, K. C. 2016. SETDB1 mediated FosB expression increases the cell proliferation rate during anticancer drug therapy. BMB Rep. 49, 238-243. 

  15. Nestler, E. J. 2015. FosB: a transcriptional regulator of stress and antidepressant responses. Eur. J. Pharmacol. 753, 66-72. 

  16. Park, S. J., Bae, H. S. and Park, J. C. 2015. Osteogenic differentiation and gene expression profile of human dental follicle cells induced by human dental pulp cells. J. Mol. Histol. 46, 93-106. 

  17. Ting, C. H., Chen, Y. C., Wu, C. J. and Chen, J. Y. 2016. Targeting FOSB with a cationic antimicrobial peptide, TP4, for treatment of triple-negative breast cancer. Oncotarget 7, 40329-40347. 

  18. Torres, O. V., McCoy, M. T., Ladenheim, B., Jayanthi, S., Brannock, C., Tulloch, I., Krasnova, I. N. and Cadet, J. L. 2015. CAMKII-conditional deletion of histone deacetylase 2 potentiates acute methamphetamine-induced expression of immediate early genes in the mouse nucleus accumbens. Sci. Rep. 5, 13396. 

  19. Ulery, P. G., Rudenko, G. and Nestler, E. J. 2006. Regulation of DeltaFosB stability by phosphorylation. J. Neurosci. 26, 5131-5142. 

  20. Vialou, V., Bagot, R. C., Cahill, M. E., Ferguson, D., Robison, A. J., Dietz, D. M., Fallon, B., Mazei-Robison, M., Ku, S. M., Harrigan, E., Winstanley, C. A., Joshi, T., Feng, J., Berton, O. and Nestler, E. J. 2014. Prefrontal cortical circuit for depression- and anxiety-related behaviors mediated by cholecystokinin: role of DeltaFosB. J. Neurosci. 34, 3878-3887. 

  21. Vialou, V., Thibault, M., Kaska, S., Cooper, S., Gajewski, P., Eagle, A., Mazei-Robison, M., Nestler, E. J. and Robison, A. J. 2015. Differential induction of FosB isoforms throughout the brain by fluoxetine and chronic stress. Neuropharmacology 99, 28-37. 

  22. Wang, H., Tao, X., Huang, S. T., Wu, L., Tang, H. L., Song, Y., Zhang, G. and Zhang, Y. M. 2016. Chronic Stress Is Associated with Pain Precipitation and Elevation in Delta Fosb Expression. Front. Pharmacol. 7, 138. 

  23. Yoon, J., Kim, J. H., Lee, O. J., Lee, S. Y., Lee, S. H., Park, J. B., Lee, J. Y., Kim, S. C. and Kim, J. 2013. AP-1(c-Jun/FosB) mediates xFoxD5b expression in Xenopus early developmental neurogenesis. Int. J. Dev. Biol. 57, 865-872. 

  24. Zhang, H., Korenkova, V., Sjoback, R., Svec, D., Bjorkman, J., Kruhoffer, M., Verderio, P., Pizzamiglio, S., Ciniselli, C. M., Wyrich, R., Oelmueller, U., Kubista, M., Lindahl, T., Lonneborg, A. and Rian, E. 2014. Biomarkers for monitoring pre-analytical quality variation of mRNA in blood samples. PLoS One 9, e111644. 

  25. Zhang, Q., Liu, Q., Li, T., Liu, Y., Wang, L., Zhang, Z., Liu, H., Hu, M., Qiao, Y. and Niu, H. 2016. Expression and colocalization of NMDA receptor and FosB/DeltaFosB in sensitive brain regions in rats after chronic morphine exposure. Neurosci. Lett. 614, 70-76. 

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