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문제 정의
- 본 연구는 유산발효를 하는 전통식품에서 요구르트 제조에 활용이 가능한 산내성이 있는 유산균을 분리하여 probiotics 기능을 검증하고 이를 이용한 요구르트 제조 중발효특성 및 품질 특성을 검토하였다.
가설 설정
- 1) Value are means±SD of triplicate determinations.
- 2) Value are means±SD of triplicate determinations except viscosity (n=6).
- 2) Value are means±SD of triplicate determinations.
제안 방법
- 10% 멸균 환원탈지유에 분리균주를 단독 및 혼합 접종하여 48시간 배양한 후 4℃에 10일간 저장하면서 저장 중 pH, 산도, 생균수의 변화를 비교하였다.
- vulnificus에 대한 항균활성과 인공 위액과 담즙액에 대한 내성이 우수한 4 균주를 선발하였다. 4균주의 환원탈지유에서 배양특성 비교. 항균활성과 인공 위액과 담즙에서의 내성 등을 고려하여 KM24(구균)와 KM32(간균)을 최종 선발하여 동정한 결과 각각 Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum 로 동정되었다.
- Blois의 방법(18)을 변형하여 발효가 완료된 요구르트와 95% ethanol를 1:1로 비율로 혼합, 24시간 추출한 후 4℃, 3,500 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 21k, Hanil science industrial Co., Ltd., Incheon, Korea)한 후 얻은 상등액을 여과지(Whatman No. 2, Maidstone, England)로 여과시켜 사용하였다. 시료 0.
- KM24(구균) 균주만 단독으로 요구르트 제조용 starter로 사용이 가능할 것으로 사료되었으나, 내산성과 담즙액 내성 그리고 환원탈지유에서의 양호한 성장을 나타낸 KM32(간균)가 KM24와 발효 중 구균인 S, thermophilus 와 간균인 L. bulgaricus와 같은 상호작용이 가능할 것으로 판단되어 두 균주를 선발하여 단독 및 혼합배양 효과를 검토하였다.
- 78)을 나타내어 소화기관을 통과하는 동안 우수한 생존율을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다. 내산성이 매우 강하고 담즙액에 대한 내성이 우수한 KM2, KM24, KM32 그리고 KM 72 균주를 선발하여 환원탈지유 에서 배양특성을 비교하였다.
- 분리 유산균 중 항균활성, 내산성과 내담즙성이 있는 균주를 선발하여 24시간 배양한 배양액을 각각 고형분 함량 10% 멸균 환원탈지유에 3%(v/v) 접종하여 4일간 배양하면서 1일 간격으로 pH, 산도, 생균수를 측정비교 하였다.
- )에 접종, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 colony수를 계측하였다. 분리균주의 인공담즙 액에 대한 내성은 Lee 등(15)의 방법으로 MRS broth에 pancreatin(Kanto Chemical, Tokyo, Japan) 1%를 첨가한 후 pH 8.3으로 조정하여 멸균시킨 후, 멸균된 10% Oxgall(Difco Co.) 용액 1%를 첨가한 배지를 사용하였으며, 인공위액에서 3시간 배양 후 원심분리하여 상등액을 제거한 균체에 인공담즙 액을 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다.
- 비교적 산 생성이 완만한 요구르트 starter로 사용되는 Lactobacillus casei(대조구), 분리균주인 P. pentosaseus KM32와 L. plantarum KM24 균주를 단독(단독접종구) 및 혼합접종(혼합 접종구)하여 요구르트 제조 중 발효특성을 비교하였다(Table 5). 유산균수는 모든 처리구에서 배양 24시간째 108 CFU/mL이상이었으며 배양 72시간까지 동일한 수준을 유지하였다.
- , Detroit, MI, USA)에 pepsin 1%를 첨가한 인공 위액을 사용하였다. 선발 균주를 상기 인공위액에 접종하여 37℃에서 3시간 배양 후 1 mL을 취하여 0.1% pepton 용액으로 적정 희석하여 MRS agar(Difco Co.)에 접종, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 colony수를 계측하였다. 분리균주의 인공담즙 액에 대한 내성은 Lee 등(15)의 방법으로 MRS broth에 pancreatin(Kanto Chemical, Tokyo, Japan) 1%를 첨가한 후 pH 8.
- 선발된 균주에 대한 항균활성은 Listeria monocytogenus ATCC19115, Staphylococcus aureus ATCC2937, Bacillus cereus ATCC14581, Escherichia coli ATCC11775, Salmonella entritidis KCTC12400, Vibrio vulnificus ATCC 17802에 대해 paper disc method로 생육 억제환 생성 유무를 비교 측정 하였다.
- 시료 0.4 mL에 0.4 mM DPPH 에탄올 용액 0.8 mL를 가하여 진탕 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후, 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 계산식, DPPH radical scavenging activity(%)=100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하여 활성을 산출하였다.
- 최종 선별된 균주를 Gram 염색, catalase test, API 50 CHL kit(BioMerieux Co., Marcy L’Etoile, France)간이 동정한 후 Zhang 등(16)의 27F(5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3')와 1429R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 RNA를 증폭 후 16S rRNA 염기서열 분석을 통해(Solgent Co., Daejeon, Korea)확인하였다.
대상 데이터
- vulnificusicus에 대한 항균활성을 측정한 결과(Table 1) KM32 균주가 가장 우수한 항균활성을 나타내었다. 공시 균주 중 항균 spectrum이 비교적 넓은 9균주를 선발하여 다음 실험에 사용하였다.
- 균주의 분리원은 대구 경북지역에서 수집한 김치, 식혜, 막걸리, 물김치 등 전통 발효식품을 사용하였으며, 각 샘플을 직접 또는 적정 희석하여 0.02% sodium azide가 포함된 MRS Agar(Difco Co. Detroit, MI, USA)에 도말하고, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 특징적인 colony를 취하여 순수 분리한 50균주를 10% 탈지분유에 접종하여 37℃에서 48-72시간동안 배양한 후 응고현상을 보인 16균주를 선발하였다. 선발 균주는 MRS 사면배지에 접종하여 24시간 배양한 후 4℃에 보관하면서 사용하였다.
- 내산성, 내담즙성, 항균활성, 환원탈지유에서 성장능 등이 우수한 2균주를 선발, 단독 및 혼합 starter로 10% 멸균 환원탈지유에 각각 3%(v/v) 접종한 후 4일간 배양하였으며, 대조구로 발효가 비교적 완만하게 진행되는 요구르트 제조에 starter로 사용되는 Lactobacillus casei(CHR, Hansens Lab., Horsholm, Denmark)를 사용하였다.
- 전통식품에서 요구르트 제조 가능한 유산균을 선발하기 위하여 김치, 식혜 막걸리에서 분리한 유산균 50균주 중 커드 형성 능력이 있는 16균주를 선발, L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, E. coli, S. entritidis, V. vulnificus에 대한 항균활성과 인공 위액과 담즙액에 대한 내성이 우수한 4 균주를 선발하였다. 4균주의 환원탈지유에서 배양특성 비교.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 행하였으며, 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 19.0)를 이용, p<0.05수준으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검증하였다.
이론/모형
- Folin-Denis 법(17)에 따라 발효가 완료된 시료 1 mL에 0.2 N Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후, 7.5% Na2CO3 1 mL을 가하여 암소에서 1시간 동안 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 3)a-d Means within e6ach column with no common superscripts are significantly different (p<0.05).
- 3)a-d Means within each column with no common superscripts are significantly different (p<0.05).
- 3)a-d Means within each row with no common superscripts are significantly different (p<0.05).
- 86 μg/mL이었다. DPPH 라디칼 소거능은 KM24 접종구가 가장 높은 52.54%로, 혼합 접종구(48.57%)와 대조구(48.22%)에 비해 항산화 활성이 우수하였다.
- 28 log CFU/mL이었다. pH는 모든 처리구에서 저장기간 동안 저장 초기와 유사하였으나, KM32 접종구는 점차 증가하여 저장 초기 pH 4.54에서 저장 10일째 5.17로 증가하였다. 이는 저장 중 KM32 균주의 단백질 분해능에 의한 단백질 분해현상에 기인된 것으로 사료된다.
- plantarum을 환원탈지유에서 24시간 배양 후 108 CFU/mL 이었다는 Jeong 등(22)의 결과 보다 양호하였다. 분리 균주를 복합으로 사용할 경우 비교적 유산균을 많이 함유하는 요구르트 제조가 가능할 것으로 판단되었다. pH 변화는 배양 48시간째 대조구(3.
- 분리한 50균주의 유산균중 커드형성 능력이 있는 16균주를 선발하여 그람 양성균인 L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus와 그람 음성균인 E. coli, S. entritidis, V. vulnificusicus에 대한 항균활성을 측정한 결과(Table 1) KM32 균주가 가장 우수한 항균활성을 나타내었다. 공시 균주 중 항균 spectrum이 비교적 넓은 9균주를 선발하여 다음 실험에 사용하였다.
- 25이었다. 산도의 변화는 pH 변화와 유사하여 배양 48시간 후 KM32(0.68%), KM24(0.85%), 혼합 접종구(0.83%), 대조구(0.99%)이었으며, KM32 단독 접종구를 제외하고 각 처리구 공히 배양 72시간후 0.88-1.24%의 범위를 나타내었다. 혼합 접종구는 대조구에 비해 산생성은 완만하였으나 유산균수는 많았다.
- 선발된 2 균주를 16S rRNA 염기서열 분석을 이용하여 동정 결과(Table 4), KM24는 gram positive, cocci, catalase negative였으며, Pediococcus pentosaceus로 동정되었다. KM32는 gram positive, rod, catalase negative로 Lactobacillus plantarum로 동정되었다.
- 요구르트 제조 중 유산균수는 KM24와 KM32균주 혼합 접종구가 가장 높았으며, 배양 48시간째 9.66 log CFU/mL 을 나타내었다. pH는 배양 48시간째 각각 4.
- 04%를 유지하였다. 요구르트내 유산균수는 107 -108 CFU/mL 이상(20), pH는 4.1-4.2(21), 적성산도의 범위는 0.95-1.20%로 제시한 Rasic과 Kurmann(5) 등의 결과와 비교하면 공시균주는 환원탈지유에서 성장은 양호하나 완만하게 산을 생성하여 요구르트 제조를 위해 배양기간이 2일 이상 필요한 것으로 판단되었다. KM24(구균) 균주만 단독으로 요구르트 제조용 starter로 사용이 가능할 것으로 사료되었으나, 내산성과 담즙액 내성 그리고 환원탈지유에서의 양호한 성장을 나타낸 KM32(간균)가 KM24와 발효 중 구균인 S, thermophilus 와 간균인 L.
- 5% 였다는 보고(24)와 비교할 때 혼합 접종구의 항산화활성은 비교적 양호한 것으로 판단된다. 요구르트의 점도는 소비자의 기호성에 영향을 미치는 주요 요인으로 KM24 접종구의 점도(675 cp)가 가장 높았으며, 혼합 접종한 경우 465 cp로 감소하였다. 요구르트의 점도는 요구르트 혼합액의 총 고형분 함량과 단백질 가수분해정도, starter의 산과 slime 생성능력에 의해 영향을 받는다(5).
- 요구르트의 항산화 활성과 점도의 비교는 Table 6에서 보는 바와 같이 KM24 단독 접종구가 총 폴리페놀함량 (41.56 μg/mL)이 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능도 KM24 접종구가 가장 높은 52.54%로 혼합 접종구(48.57%) 와 대조구(48.22%)에 비해 항산화 활성이 가장 우수하였다.
- 혼합 접종구는 대조구에 비해 산생성은 완만하였으나 유산균수는 많았다. 이러한 결과를 김치에서 선발한 유산균을 이용한 요구르트 제조 중 배양 24시간 이후 pH는 4.3이었다는 결과(23)와 탈지유로 제조한 요구르트의 pH 범위는 4.01-4.27, 산도는 0.82-1.15%(24), mild 요구르트와 acid 요구르트의 적정산도 범위는 각각 0.85- 0.95%와 0.951-1.20%(5)라는 결과와 비교해 볼 때 KM32와 KM24혼합균주는 mild요구르트 제조에 적합하다고 판단되며, 산 생성이 완만하여 배양시간이 48시간 이상 필요할 것으로 사료되었다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 김치에서 분리한 P. pentosaceus (KM24)와 L. plantarum(KM32)는 내산성이 강하고 probiotics 기능이 있으며 발효 및 저장 중 높은 수준의 생균수를 유지하므로 요구르트 제조 시 단독 사용보다는 복합 starter로 사용이 가능할 것으로 판단된다. 상업적으로 활용할 경우 당과 고형분 첨가 등 산 생성을 촉진시키는 방안과 발효온도 등 적정 발효조건 구명과 품질 개선 등에 관한 광범위한 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
- 혼합 접종구는 대조구에 비해 유산균수는 높았으나 pH는 높고, 산도는 낮은 경향을 나타내었다. 이상의 결과를 미루어 보아 분리균주인 KM24와 KM32은 요구르트 제조 시 복합 starter로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 4균주의 환원탈지유에서 배양특성 비교. 항균활성과 인공 위액과 담즙에서의 내성 등을 고려하여 KM24(구균)와 KM32(간균)을 최종 선발하여 동정한 결과 각각 Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum 로 동정되었다.
- 구강을 통해 섭취되는 probiotics는 강산성의 위산과 담즙산에서 살아남아 췌장과 십이지장을 통과하여 최종 목적부위인 장에 도달하여야 정장의 효과를 발휘하게 된다(19). 항균활성이 우수한 9균주의 인공위액과 인공 담즙액에서 내성은 양호하였으며(Table 2), KM32는 본 실험에 사용한 pH를 1.5로 조정한 인공 위액에서 log reduction이 1.14를 나타내었고, 인공 담즙액에서는 생균수가 증가하는 경향(log reduction, -0.78)을 나타내어 소화기관을 통과하는 동안 우수한 생존율을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다. 내산성이 매우 강하고 담즙액에 대한 내성이 우수한 KM2, KM24, KM32 그리고 KM 72 균주를 선발하여 환원탈지유 에서 배양특성을 비교하였다.
- 산도의 변화는 저장 5일까지는 다소 증가하다가 그 이후 감소하였다. 혼합 접종구는 대조구에 비해 유산균수는 높고, 산생성 능력이 낮아 pH는 높고, 산도는 낮은 경향을 나타내었다. 유산균의 probiotics 효과를 기대할 수 있는 요구르트의 유산균수는 섭취 전 108 -109 CFU/g이어야 하며, 적어도 106 -107 CFU/g 장에 도달하여야 한다(26).
- pH는 KM32 접종구를 제외하고 저장기간 동안 저장 초기와 유사하였으며, 산도는 저장 5일까지는 다소 증가하다가 그 이후 감소하였다. 혼합 접종구는 대조구에 비해 유산균수는 높았으나 pH는 높고, 산도는 낮은 경향을 나타내었다. 이상의 결과를 미루어 보아 분리균주인 KM24와 KM32은 요구르트 제조 시 복합 starter로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 유산균수는 모든 처리구에서 배양 24시간째 108 CFU/mL이상이었으며 배양 72시간까지 동일한 수준을 유지하였다. 혼합 접종구에서 배양 48시간과 배양 72시간째 각각 9.66 log CFU/mL과 9.58 log CFU/mL을 나타내어 대조구보다 양호하였다. 이 결과는 김치에서 분리한 L.
후속연구
- plantarum(KM32)는 내산성이 강하고 probiotics 기능이 있으며 발효 및 저장 중 높은 수준의 생균수를 유지하므로 요구르트 제조 시 단독 사용보다는 복합 starter로 사용이 가능할 것으로 판단된다. 상업적으로 활용할 경우 당과 고형분 첨가 등 산 생성을 촉진시키는 방안과 발효온도 등 적정 발효조건 구명과 품질 개선 등에 관한 광범위한 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
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