[논문]경쟁적 ELISA를 이용한 도파민과 세로토닌의 검출

남궁수민; 최정수; 박지향; 양만길; 이민우; 김성욱

doi:10.15324/kjcls.2017.49.3.220

경쟁적 ELISA를 이용한 도파민과 세로토닌의 검출
Detection of Dopamine and Serotonin by Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.49 no.3, 2017년, pp.220 - 226

남궁수민 (고려대학교 대학원 의생명융합과학과) , 최정수 (고려대학교 대학원 의생명융합과학과) , 박지향 (고려대학교 대학원 의생명융합과학과) , 양만길 (서울대학교병원 의생명연구원) , 이민우 (고려대학교 대학원 의생명융합과학과) , 김성욱 (고려대학교 대학원 의생명융합과학과)

초록
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도파민과 세로토닌은 신경전달물질 및 호르몬으로서 미량이지만 체내에서 중요한 기능을 한다. 검체는 혈청과 24시간 뇨를 쓰며, 주로 HPLC-MS를 이용하여 검사한다. 본 연구에서는 항원-항체반응을 이용한 경쟁적 ELISA를 통해 도파민과 세로토닌을 검출하고자 하였다. $5{\mu}g/mL$ BSA conjugate를 96 well 표면에 고정시킨 뒤 각각 농도를 다르게 한 신경전달물질과 1차 항체를 넣어 반응시키고 HRP가 결합된 2차 항체와 TMB를 처리하여 흡광도를 측정하였다. 측정 결과를 토대로 회귀식과 $R^2$값을 구하여 신경전달물질에 대한 항체의 민감도와 신경전달물질 농도와 흡광도 사이의 상관관계를 판단하였다. 도파민은 1차 항체를 6,000배, 7,000배로 희석했을 때 $R^2=0.91$로 신경전달물질 농도와 흡광도의 상관관계가 가장 높게 나타났고, 세로토닌은 3,000배와 6,000배를 제외한 모든 희석배수에서 $R^2{\geq}0.90$의 높은 상관관계를 나타냈다. 도파민과 세로토닌 모두 $1.0{\times}10^{-7}M$ 이하의 저농도에서는 효과적으로 검출되지 않았기 때문에 참고치가 이보다 낮은 혈청 도파민 검출은 HPLC-MS 이용이 필요해 보이지만, 24시간 뇨 도파민과 혈청 및 24시간 뇨 세로토닌의 검출에는 competitive ELISA가 효과적일 것이라 사료된다. 보다 낮은 농도의 신경전달물질도 정확하게 검출하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.

Abstract ▼ AI-Helper

Dopamine (DA) and serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) are neurotransmitters and hormones that exist in small amounts but have important role in the body. Serum and 24-hour urine are used as specimens, and are usually examined by HPLC-MS. In this study, we tried to detect DA and 5-HT by competitive ELISA using antigen-antibody (Ab) reaction. After immobilizing $5{\mu}g/mL$ BSA conjugate on a 96-well surface, hormone and primary Ab, which are respectively diluted to different concentrations, were treated. Then, HRP-conjugated secondary Ab and TMB were added to measure absorbance. The regression equation and $R^2$ value were calculated based on absorbance, and sensitivity of Ab to hormone as well as the correlation between hormone concentration and absorbance were determined. In DA ELISA, $R^2$, the correlation between the concentration of hormone and absorbance, was the highest by 0.91 when anti-dopamine Ab was diluted 6,000 times and 7,000 times. In 5-HT ELISA, $R^2$ was bigger than 0.90 in every concentration except 3,000 times and 6,000 times. Both DA and 5-HT were not effectively detected at low concentrations (less than $1.0{\times}10^{-7}M$); and because reference value of serum DA is lower than this, HPLC-MS was required to detect serum DA. However, competitive ELISA may be effective in detecting 24-hour urine DA, serum, and 24-hour 5-HT. Further studies are needed to detect hormones more accurately at lower concentrations.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

ELISA는 간단하고 항원-항체반응을 이용하기 때문에 특이도가 높다는 장점이 있다. 따라서 본 연구에서는 ELISA를 이용해 도파민과 세로토닌을 검출하고 그 효과를 보고자 하였다.

대상 데이터

Bovine serum albumin (BSA)은 Merck Millipore (Kankakee, Illinois, USA)에서 구입하였고, Pierce SnakeSkin pleated dialysis tubing 7,000 Da은 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 토끼의 도파민에 대한 polyclonal antibody (pAb) (ab8888), 세로토닌에 대한 pAb (ab8882), horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 당나귀의 토끼 IgG에 대한 pAb (ab6802)는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. 또한 도파민과 세로토닌에 대한 토끼의 pAb를 AbClon (Seoul, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.
먼저 각 항원에 대한 항체의 특이성을 보기 위해 교차반응 실험을 3회 진행하였다. 항원은 같은 모노아민 신경전달물질인 히스타민, 도파민, 세로토닌, 에피네프린을 사용하였고, 항체는 도파민과 세로토닌에 대한 것을 사용하였다. 흡광도 측정 결과 목표 항원을 제외한 나머지 항원은 농도에 따른 차등적인 변화를 보이지 않았으며, 항체 희석 배수에 따른 변화 또한 보이지 않았다(Table 1, 2).

데이터처리

항체 희석배수별로 10회씩 반복실험한 후 신경전달물질의 농도에 따라 흡광도 값을 정리하였다. 농도별로 데이터의 상위 10%와 하위 10%를 제외한 나머지 값으로 평균을 냈고, 회귀선과 R²(coefficient of determination, 결정계수)을 통해 농도와 흡광도의 연관성을 확인하였다. R²≥0.

성능/효과

경쟁적 ELISA를 통해 신경전달물질의 농도 변화에 따른 흡광도 차이를 확인할 수 있었다. 항체 희석배수에 따라 연관성의 정도는 다르게 나타났지만 도파민과 세로토닌 모두 전반적으로 0.
1359 범위로 나왔으므로, 시판 제품보다 제작 항체가 항원인 세로토닌에 대해 훨씬 높은 민감도를 갖고 있다고 판단하였다. 도파민과 마찬가지로 1.0×10⁻⁷M 이하의 저농도에서는 세로토닌을 효과적으로 검출하지 못하였고, 해당 농도에서의 흡광도를 제외하면 민감도가 증가하며 0.95≤R²≤0.99로 매우 높은 상관관계를 나타낸다. 그러나 세로토닌은 혈청에서 1.
도파민과 세로토닌 모두 ELISA보다 HPLC의 LOD가 훨씬 낮다. 다른 모노아민 신경전달물질인 히스타민을 대상으로 하는 경우에도 같은 결과를 확인하였다[17].
98로 매우 높은 상관관계를 나타낸다. 따라서 항원-항체반응을 이용한 ELISA는 도파민이 0.195×10⁻⁹M 미만으로 존재하는 혈청보다는 170∼3,319×10⁻⁹M의 농도로 존재하는 24시간 뇨에서의 도파민 검출에 적합할 것으로 사료된다.
세로토닌의 경우 시판 제품은 R²=0.73으로 낮았던 것에 반해 제작 항체는 6,000배를 제외한 모든 희석배수에서 R²≥0.8로 상관관계가 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 세로토닌에서도 회귀선의 기울기의 절댓값이 큰 차이를 보였는데, 시판 제품은 0.
경쟁적 ELISA를 통해 신경전달물질의 농도 변화에 따른 흡광도 차이를 확인할 수 있었다. 항체 희석배수에 따라 연관성의 정도는 다르게 나타났지만 도파민과 세로토닌 모두 전반적으로 0.8∼0.9 범위의 높은 결정계수를 나타냈으며, 회귀선을 통해 항원에 대한 민감도를 확인하고 교차반응 실험을 통해 특이도를 확인하였다.

후속연구

하지만 시간과 비용 면에서 ELISA의 장점이 명확하며 24시간 뇨 검체의 참고치보다 낮은 LOD를 갖기 때문에 검사에 이용할 수 있으므로, 현재 신경전달물질의 검사에 사용되는 HPLC-MS의 장점인 정확성을 갖춘다면 ELISA를 이용한 검사 방법을 이용하는 것이 효과적일 것이라 사료된다. 이를 위해 보다 낮은 농도를 검출하기 위한 방법은 추후 연구가 필요하다.
다른 모노아민 신경전달물질인 히스타민을 대상으로 하는 경우에도 같은 결과를 확인하였다[17]. 하지만 시간과 비용 면에서 ELISA의 장점이 명확하며 24시간 뇨 검체의 참고치보다 낮은 LOD를 갖기 때문에 검사에 이용할 수 있으므로, 현재 신경전달물질의 검사에 사용되는 HPLC-MS의 장점인 정확성을 갖춘다면 ELISA를 이용한 검사 방법을 이용하는 것이 효과적일 것이라 사료된다. 이를 위해 보다 낮은 농도를 검출하기 위한 방법은 추후 연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	HPLC 검출의 단점은 무엇인가?	저농도도 검출할 수 있기 때문에 민감도가 높은 정확한 측정 방법이라 할 수 있다. 하지만 HPLC는 장비가 매우 비싸고 검체 세척시간이 필요하며 경우에 따라 특이도가 높지 않을 수 있다. 때문에 보다 간단하고 정확한 검사를 위해 전기화학적 방법 등 대안을 찾는 연구들이 존재한다[11–14].
	세로토닌이란 무엇인가?	세로토닌은 모노아민 신경전달물질로 생화학적으로 트립토판에서 유도된다[5]. 인간을 포함한 동물의 위장관, 혈소판, 중추신경계에서 발견되며 그 중 대다수는 위장관에 분포하면서 장운동을 조절한다[6].
	도파민의 기능 및 부족할 경우 나타날 수 있는 증상은 무엇인가?	혈액뇌장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)을 통과하지 못 하기 때문에 뇌와 말초에서의 합성과 기능은 독립적이다[1]. 혈관 확장 및 심박수와 혈압 증가, 배뇨량 증가, 인슐린 생성 감소, 운동 조절, 동기부여, 보상기전 등의 기능을 하며[2] 운동 조절 중에서도 자발적인 움직임에 중요한 기능을 하기 때문에 부족할 경우 파킨슨병을 유발한다[3]. 도파민의혈청 농도는 30 ng/L (0.

참고문헌 (17)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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