[논문]치매유발제인 알루미늄으로 손상된 배양 C6 Glioma 세포에 대한 금은화 추출물의 보호 효과

정재윤; 정인주; 제갈승주

doi:10.15324/kjcls.2017.49.3.271

치매유발제인 알루미늄으로 손상된 배양 C6 Glioma 세포에 대한 금은화 추출물의 보호 효과
The Protective Effect of Lonicerae flos Extract on Cultured C6 Glioma Cells Damaged by Aluminum of Dementia Inducer 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.49 no.3, 2017년, pp.271 - 278

정재윤 (원광대학교 의과대학 산본병원 마취통증의학과) , 정인주 (동신대학교 뷰티미용학과) , 제갈승주 (원광보건대학교 임상병리학과)

초록
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치매유발제인 염화알루미늄(aluminum chloride, $AlCl_3$)의 세포독성을 대뇌교종세포인 C6 glioma 세포를 대상으로 산화적 손상측면에서 조사하였으며, 또한 $AlCl_3$의 세포독성에 대한 금은화(Lonicerae flos, LF) 추출물의 영향을 세포생존율을 비롯한 DPPH-라디칼 소거능, superoxide anion-radical (SAR) 제거능 및 지질과산화(lipid peroxidation, LP) 억제능과 같은 항산화 측면에서 분석하였다. 본 실험에서 배양 C6 glioma 세포에 $120{\sim}160{\mu}M$의 $AlCl_3$가 각각 포함된 배양액에서 처리한 결과 처리 농도에 비례하여 세포생존율이 대조군에 비하여 유의한 감소를 보였으며, 이 때 $XTT_{50}$값은 $128.8{\mu}M$에서 나타나 중간독성(mid-toxic)인 것으로 나타났다. 또한, 항산화제인 BHT는 $AlCl_3$의 세포독성을 유효하게 방어하였다. 한편, $AlCl_3$의 세포독성에 대한 금은화(LF) 추출물의 영향에 대한 조사에 있어서, LF 추출물은 $AlCl_3$에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로써 세포독성을 방어하였다. 이와 동시에, LF 추출물은 DPPH-라디칼 소거능을 비롯하여 SAR 제거능 및 LP 억제능을 보임으로서 항산화 효과를 나타냈다. 위의 결과로부터 $AlCl_3$의 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있으며, 또한 LF 추출물은 $AlCl_3$의 독성을 항산화능에 의하여 효과적으로 방어하였다. 따라서, LF 추출물과 같은 천연성분은 알루미늄과 같이 산화적 손상과 관련된 치매유발제의 독성을 방어함으로써 차후 치매와 같은 산화적 손상 관련의 질환 치료를 위한 항산화 물질로서의 개발적 가치가 있다고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was performed to evaluate the cytotoxicity of aluminum chloride ($AlCl_3$), and the protective effect of Lonicerae flos (LF) extract on $AlCl_3-induced$ cytotoxicity in the cultured C6 glioma cells. Here, the cell viability and antioxidative effects, such as DPPH-radical scavenging activity, superoxide anion scavenging activity, and lipid peroxidation (LP), were assessed. $AlCl_3$ significantly decreased the cell viability in a dose-dependent manner; the $XTT_{50}$ value was measured at $128.8{\mu}M$ of $AlCl_3$. The cytotoxicity of $AlCl_3$ was determined as highly toxic the y Borenfreund and Puerner's toxic criteria. The butylated hydroxytoluene (BHT) and antioxidant both significantly increased the cell viability, which was damaged by $AlCl_3-induced$ cytotoxicity in these cultures. In the protective effect of LF extract on $AlCl_3-induced$ cytotoxicity, the LF extract significantly increased the superoxide anion scavenging activity and inhibitory activity of LP, as well as the DPPH-radical scavenging activity. From these results, it is suggested that the oxidative stress may have been involved in the cytotoxicity of $AlCl_3$, and LP extract effectively protected $AlCl_3-induced$ cytotoxicity through the antioxidative effects. Conclusively, the natural resources, like LP extract, may be a putative therapeutic agent for the treatment of dementia induced by allergen like aluminum correlated with the oxidative stress.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

근래에 세포배양기법이 빠르게 발전되면서 독성물질의 독성정도를 비롯하여 신약제의 효능분석 및 안전성 검정과 같은 다양한 분석도구로 활용되고 있다[14]. 본 연구는 치매유발제인 염화알루미늄(AlCl₃)의 세포독성을 산화적 손상 측면에서 조사하였으며, 동시에, AlCl₃에 대한 금은화 추출물의 영향을 항산화 측면에서 조사하였다.

제안 방법

이 같은 결과는 LF 추출물속에 함유된 tannin이나 luteolin, saponin과 같은 성분들이 AlCl₃의 산화적 손상을 방어한 결과라고 생각되며, 그 이유의 하나로 플라보노이드 계통인 luteolin이나 페놀화합물의 일종인 tannin 및 saponin 등의 성분들은 강력한 항산화 성분들로 알려져 있기 때문이다[26]. 따라서 본 연구에서는 LF 추출물 시료에 대한 항산화 효과를 알아보기 위하여 DPPH-라디칼 소거능을 비롯하여 superoxide anion-radical (SAR) 제거능 및 지질과산화(LP) 억제능을 조사하였다.
배양중인 C6 glioma 세포에 AlCl₃가 120∼160 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 48시간 동안 배양한 후 세포생존율을 대조군과 비교 조사하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 대뇌신경세포인 C6 glioma 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양 받아 사용하였다.
전북 익산시 야산에서 5∼6월경 인동덩굴로부터 금은화를 채취한 후 시에 위치하고 있는 원광대학교 부설 생명자원과학 연구소에서 동정 확인하였다. 추출은 Han 등[15]의 방법에 따라 채취하여 보관중인 건조 꽃봉오리 39.

데이터처리

실험결과는 SPSS/WIN 18.0을 이용하여 군간의 차이를 비교하기 위하여 ANOVA를 시행하였고 사후 분석은 Tukey'spost-hoc test에 의하였으며, 모든 통계의 유의수준은 p＜.05에서 채택하였다.

이론/모형

DPPH-라디칼 소거능(DPPH-radical scavenging activity)의 측정은 Blois [19]의 방법에 따라, 메탄올시료에 0.3 mM DPPH 메탄올용액 100 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 처리하였다. 처리 완료 후 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
LP 측정은 Kikuzaki와 Nakatani [20]의 방법에 따라, 2.52% linoleic acid와 0.05 M PBS (pH7.0) 용액 12.1 mL에 에탄올과 시료 3.9 mL 혼합액을 첨가한 후 24시간 동안 40°C에서 배양하였다. 배양 완료 후 에탄올과 30% ammonium thiocyanate와 0.
SAR 제거능 측정은 nitroblue tetrazolium (NBT)의 환원방법에 따라, 시료용액 0.1 mL와 0.4 mL potassium phosphate buffer (pH 7.5)에 0.4 mM xanthine과 NBT를 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 1 N HCl I mL를 가하여 반응을 정지시켜 생성된 SAR 양을 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
전북 익산시 야산에서 5∼6월경 인동덩굴로부터 금은화를 채취한 후 시에 위치하고 있는 원광대학교 부설 생명자원과학 연구소에서 동정 확인하였다. 추출은 Han 등[15]의 방법에 따라 채취하여 보관중인 건조 꽃봉오리 39.6 g을 잘게 파쇄한 다음 시료의 3배 정도의 물과 함께 1,000 mL의 환저플라스크에넣고 3시간 동안 가열하였다. 위의 과정을 4회 반복 추출하여 여과한 다음 3,000 rpm에서 30분 동안 원침시켰다.

성능/효과

이를 위하여 먼저 항산화제의 일종인 BHT의 라디칼 제거능을 조사하기 위하여 자유라디칼의 일종인 20 μM H2O2를 배양세포에 처리하기 전에 10∼50 μM BHT 각각의 농도를 배양 세포에 전처리한 결과 H2O2의 처리에 비하여 모두 유의한 세포생존율의 증가를 나타냈다. 본 실험의 결과에서 BHT의 처리가 H2O2의 처리에 비하여 세포생존율이 유의하게 증가된 것은 BHT가 자유라디칼을 제거할 수 있는 항산화능을 가지고 있음을 증명하고 있다. 본 연구 결과는 Kim과 Jekal [14]이 자유라디칼에 대한 BHT의 소거능을 보고한 연구 결과와도 일치함을 알 수 있었다.
치매는 기억력 감퇴와 인지기능의 상실로 인한 학습 및 정상적인 생활적 영위가 어려운 뇌질환으로서 이의 원인물질중의 하나로 알루미늄이 알려져 있으며 이는 또한 산화적 손상과도 밀접한 관련이 있다고 제시된 바 있다[2]. 본 연구에서는 치매유발제인 염화알루미늄(AlCl₃)의 세포독성을 조사하기 위하여 대뇌신경교세포의 일종인 C6 glioma 세포에 120∼160 μM의 AlCl₃ 농도를 각각 처리한 결과 농도 의존적으로 세포생존율이유의하게 감소되었으며 이 때 XTT₅₀값이 128.8 μM에서 나타났다. 따라서, AlCl₃는 배양 C6 glioma 세포에 세포독성을 나타냈으며 이는 Borenfreund와 Puerner [21]의 독성판정기준에 따라 중간독성(mid-toxic)인 것으로 나타났다.
따라서, AlCl₃는 배양 C6 glioma 세포에 세포독성을 나타냈으며 이는 Borenfreund와 Puerner [21]의 독성판정기준에 따라 중간독성(mid-toxic)인 것으로 나타났다. 이들은 약제의 독성을 XTT₅₀값이 100 μM 이하인 경우는 고독성으로, 100∼1,000 μM 이면 중간독성(mid-toxic)으로 각각 판정하였다. 본연구 결과는 Verstraeten 등[22]이 알루미늄의 뇌독성을 보고한 연구 결과나, 또한 Kim 등[2]이 배양 신경교종세포에 대한 AlCl₃의 신경독성에 대한 연구보고와 일치하였다.

후속연구

이상의 결과로부터 LF 추출물과 같은 천연성분은 치매와 같이 산화적 손상과 관련된 병변에 대한 치료적 약물개발을 위해 활용가치가 클 것으로 생각된다. 그러나 천연성분에 대한 산화적 손상에 대한 생리활성 분석은 생화학이나 약리 및 분자적 측면에서 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
지질과산화는 LDH 활성과 함께 산화적 손상에 의한 지질과산화의 막손상 정도를 측정하는 정량적 분석방법의 하나로 알려져 있다[29]. 이상의 결과로부터 LF 추출물과 같은 천연성분은 치매와 같이 산화적 손상과 관련된 병변에 대한 치료적 약물개발을 위해 활용가치가 클 것으로 생각된다. 그러나 천연성분에 대한 산화적 손상에 대한 생리활성 분석은 생화학이나 약리 및 분자적 측면에서 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치매는 무엇으로 구분되는가?	치매(dementia)는 혈관손상에 의한 혈관성 치매(vascular dementia, VD)와 연령증가에 따른 노인성 치매인 알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD)으로 구분된다[1]. 최근 대부분 선진국에서는 급속한 노인인구의 증가로 인하여 고령화 시대로 접어들면서 AD가 사회적 문제로 관심의 대상이 되었다.
	AD의 발병에는 어떤 인자들이 작용하는가?	최근 대부분 선진국에서는 급속한 노인인구의 증가로 인하여 고령화 시대로 접어들면서 AD가 사회적 문제로 관심의 대상이 되었다. AD의 발병에는 많은 요인들이 관여하고 있는데 예를 들면, 염색체에 의한 유전적 요인을 비롯하여 신경전달물질, 신경영양인자 및 유해중금속류 등 다양한 인자들이 작용하고 있다[2]. 처음으로 발견된 알츠하이머병에서 관련유전자는 21번 염색체에 존재하는 β-amyloid precursor protein (βAPP)으로 밝혀졌으며[3],이 밖에도 apoprotein E (APOE)나 presenilin (PS) 역시 AD의 발병 가능성을 높여 준다고 알려져 있다[4].
	인동덩굴의 건조 꽃봉오리의 성분은 무엇이 있는가?	인동덩굴은 우리나라 전국에 분포하고 있는데 주로 산비탈의 덤불속에 서식하고 있으며, 맛은 달고 성은 냉하여 오래전부터 관절염을 비롯한 종독, 임파선염 및 인후염의 치료에 사용하여 왔었다[12]. 금은화의 성분으로는 saponin을 비롯하여 luteolin, tannin, triterpenoid glycoside, loniceran과 같은 다양한 물질들이 함유되어 있으며, 페놀화합물 또는 플라보노이드 계통인 luteolin이나 tannin 성분이나 saponin 같은 성분들은 항산화를 비롯한 항염이나 항균작용이 강하다고 알려져 있다[11]. 금은화의 효능은 시험관 내에서는 물론 생체에서도 동물을 대상으로 피부염과 같은 질환에 대해 일부 이루어지고 있으나[4], 치매에 대한 연구는 매우 드물다.

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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