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문제 정의
- 기존의 연구에서는 구기자 과실 및 잎을이용한 약리활성검증은 다양하게 이루어져 제약분야 및 화장품관련분야에서는 활발한 연구가 진행되었으나 구기자를 과피와 종자를 분리하여 종자를 이용한 연구결과는 아직 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 구기자 종자를 초임계유체추출법을 이용하여 시료를 획득하고 미백, 항균및 에멀션 안정성에 대한 다양한 실험을 통해 화장품 소재로서의 가능성을 평가하였으며 긍정적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 일반적으로 구기자는 과실 부분을 식용으로 널리 사용하고 있으며 종자는 활용하지는 못하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 식용 및 약용으로 널리 이용되어지고 있는 구기자를 종자와 과피로 분리하여 종자를 초임계유체 추출법을 적용하였으며, 이를 화장품 원료로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 추출물의 유효성을 검증하기 위해 미백활성 효능과 항균효능을 평가하였으며, 구기자종자 추출물을 농도별로 에멀션에 적용하여 다양한 안정성 실험을 진행하였다.
제안 방법
- DMEM 배지로 배양된 흑색종 세포주를 100mm culture dish에 2×106 cells/dish가 되게 분주하고 24시간 동안 배양 후 농도별 시료를 포함한 배지를 제조하여 첨가 후 2일째에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션의 온도 안정성을 평가하였다. Multi-room incubator (JSMI-04CP 4 room chamber, JSR)에 4, 25, 45 ℃의 온도에서 보관하여 물리적 특성에 대한 경시 변화를 관찰하였다.
- pH측정은 Denver Instrument(Denver Instrument, UB-10 pH/mV meter)사의 pH meter를 이용하였으며, 시료는 25±1 ℃ 온도 하에서 3회 반복하여 측정하였다.
- 건조된 melanin에 1 N NaOH를 가하여 56 ℃에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 470 nm에서 흡광도를 측정하였으며 α -Melanocyte-stimulating hormone(α-MSH) 1 μM을 대조군으로 사용하였다.
- 구기자 종자 추출물을 melanoma B16/F10세포에 1시간 전처리 후 α-MSH(1μM)를 처리하여 48시간 배양 한 후 melanin 생성량을 측정하였다.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션과 추출물을 함유하지 않는 대조군을 28일 동안 25 ℃ incubator 에 보관하여 pH변화를 측정하였으며 Fig. 2에 나타내었다. 구기자 종자 추출물을 1.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션의 온도 안정성을 평가하였다. Multi-room incubator (JSMI-04CP 4 room chamber, JSR)에 4, 25, 45 ℃의 온도에서 보관하여 물리적 특성에 대한 경시 변화를 관찰하였다.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션의 점도 측정은 Brookfield Viscometer(Brookfield Engineering Laboratories 11 Commerce Bivd. Middleboro. MA 02346, Made in U.S.A)를 이용하여 측정하였다. 스핀들(spindle) No.
- 구기자 종자 추출물이 함유된 에멀션의 입자크기를 측정하기 위해 Particle size analyzer(MEJI Techno, Trinocular Polarizing microscope MI9300, Japan)사의 광학현미경을 이용하여 400 배율로 에멀션의 입자크기를 관찰하였다,
- 고체배지에 균주를 107 cell/㎖마리가 되도록 접종하여 멸균한 면봉을 이용하여 균일하게 도말하였다. 배지 위에 멸균 된 paper disc (8 mm, Advqutec, Tokoyo, Japan)를 시료 각 농도별로 45 ㎕으로 흡수시켰으며, 24시간 동안 균에 따라 적정 온도에서 배양한 후 disc 주변에 생성 되어진 생육저해환 (clear zone, mm)의 직경으로 추출물의 항균활성 정도를 비교하였다.
- 5 mm mesh에 통과시킨 후 입자를 균일화하여 추출하였다. 본 연구에서는 구기자 종자에 초임계유체 추출법을 적용하였고, 주요용매로 이산화탄소를 사용하였다. 이산화탄소는 다른 유체와 달리 임계점이 낮고 용질과의 비반응성으로 활용가치가 높아 관련 연구 또한 증가하고 있다.
- 33mm 생육저해환을 나타내었다. 안정성 평가를 위해 구기자 종자 초임계유체 추출물을 1.00, 0.50, 0.10, 0.05, 0.01 % 농도로 함유한 에멀션을 제조하였으며 4, 25, 45 ℃에서 28일간 보관하였을 때 에멀션의 변색, 변취, 분리 등의 현상을 보이지 않았다. 또한 25 ℃에서 28일 동안 보관한 각 농도별 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션의 pH, 점도, 입자관찰시 유의적으로 큰 변화가 없었으며, 가장 높은 농도인 1.
- 추출물을 함유한 에멀션의 저장 조건(4, 25, 45℃)에 따른 안정성을 평가하기 위해서 육안으로 층분리 및 응집여부, 이취발생 여부 등을 검토하였다. 콜로이드 형태인 화장품의 경우 사용기간이 길기 때문에 저장기간에 따른 안정성을 평가하도록 되어있어[19], 추출물이 함유된 에멀션과 추출물이 함유되지 않은 에멀션 모두 28일 동안 관찰한 결과 크리밍, 응집과 같은 분리현상이 관찰되지 않았으며, 산화에 의한 특이취도 없었다.
- 따라서, 본 연구에서는 식용 및 약용으로 널리 이용되어지고 있는 구기자를 종자와 과피로 분리하여 종자를 초임계유체 추출법을 적용하였으며, 이를 화장품 원료로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 추출물의 유효성을 검증하기 위해 미백활성 효능과 항균효능을 평가하였으며, 구기자종자 추출물을 농도별로 에멀션에 적용하여 다양한 안정성 실험을 진행하였다. 피부 흑색종인 B16/F10 세포를 이용하여 melanin 저해 활성을 측정한 결과 250, 500, 750 μg/mL 농도에서 α -MSH를 단독으로 처리한 군 대비 각각 98.
대상 데이터
- 4% trypan blue stain은 Gibco BRL CO.(Grand Island, USA)에서 구입하여 사용하였다. DMEM에 10% FBS, 1000u/mL penicillin/streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였고, 37 ℃, 5 % CO2 조건의 Incubator에서 배양하였다.
- 사용된 배지는 Tryptic soybean agar(TSA), Tryptic soybean broth(TSB), Potato dextrose agar(PDA), Potato dextrose broth(PDB)로 Difco사의 제품을 사용하였다. 또한 시료의 미백 활성을 측정하기 위해 사용된 세포는 B16/F10으로 한국 세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 미백 효과 측정에 사용된 시약 α-Melanocyte- stimulating hormone은 Sigma-ALDRICH chemical(St.
- 시료의 항균 활성 측정을 위해 피부상재균주인 Staphylococcus epidermidis(KCTC 1917), Staphylococcus aureus(KCTC 1927), 병원균 Candida albicans(KCTC 7270) 대장균 Escherichia coli(KCTC 2571) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korea)에서 구입하여 계대배양하며 사용하였다. 사용된 배지는 Tryptic soybean agar(TSA), Tryptic soybean broth(TSB), Potato dextrose agar(PDA), Potato dextrose broth(PDB)로 Difco사의 제품을 사용하였다. 또한 시료의 미백 활성을 측정하기 위해 사용된 세포는 B16/F10으로 한국 세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다.
- 시료의 항균 활성 측정을 위해 피부상재균주인 Staphylococcus epidermidis(KCTC 1917), Staphylococcus aureus(KCTC 1927), 병원균 Candida albicans(KCTC 7270) 대장균 Escherichia coli(KCTC 2571) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korea)에서 구입하여 계대배양하며 사용하였다. 사용된 배지는 Tryptic soybean agar(TSA), Tryptic soybean broth(TSB), Potato dextrose agar(PDA), Potato dextrose broth(PDB)로 Difco사의 제품을 사용하였다.
- 충청남도 청양군에서 생산된 구기자를 ㈜옴니허브로부터 구입하여 과피를 제외한 종자만을 분리하여 실험하였다. 구기자 종자를 60 ℃에서 열풍 건조하였으며 분쇄 후 0.
이론/모형
- 구기자 종자 추출물에 대한 항균활성 정도를 측정하기 위해서 paper disc method를 이용하여 생육억제 활성을 검색하였다. 그 결과, 항균활성의 크기를 Table 2에 나타내었다.
- 피부 흑색종 세포로부터 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi등[18]의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 흑색종 세포주를 100mm culture dish에 2×106 cells/dish가 되게 분주하고 24시간 동안 배양 후 농도별 시료를 포함한 배지를 제조하여 첨가 후 2일째에 인산완충액(pH 7.
- 항균활성을 측정하기 위해 paper disc method를 이용하였다. 각 균주 1백금이량을 취하여 10 ㎖ 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 18∼24시간 동안 전 배양하여 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 1에서 보는 것과 같이 α-MSH를 단독으로 처리한 경우 melanin 생성량이 대조군에 비하여 18.93%가 뚜렷하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 구기자 종자 추출물을 250, 500, 750 ㎍/mL 농도로 처리하였을 때 각각 98.36±1.44, 82.34±1.20, 82.48±1.21 %로 대조군 대비 melanin 생성이 감소됨을 확인 할 수 있었다.
- 그 결과, 항균활성의 크기를 Table 2에 나타내었다. 구기자 종자 추출물은 S. aureus, C. albicans, E. coli에 대하여 항균활성을 나타내었으며, S. aureus는 5, 10 g/mL 농도에서 10.00, 12.38 mm, C. albicans에서는 5, 10 g/mL에서 각각 10.53, 15.86 mm의 생육저해환을 나타내었고, E. coli에서는 10 g/mL 농도에서 9.33 mm 생육저해환을 나타내었다. 구기자 종자 추출물은 모든 농도에서 항균활성이 나타나진 않았지만 S.
- 58로 비슷한 분포를 나타내었다. 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션과 추출물을 함유하지 않는 대조군의 pH를 28일 동안 측정한 결과 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션 각각의 pH가 추출물 농도에 따라 수치상으로는 큰 변화를 나타내지 않음을 확인하였으며, pH 3 ~ 9로 화장품의 pH 범위를 제시한 식품의약품안전처 기준[19]에 적합한 것으로 확인되었다.
- 86 %로 미백 효능이 확인되었다. 구기자 종자 추출물의 항균 활성 효능에서도 피부상재균주인 Staphylococcus epidermidis를 제외하고, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli 세가지 균주에서 항균활성 효능이 확인되었으며 10 g/mL 농도에서 각각 12.38, 15.86, 9.33mm 생육저해환을 나타내었다. 안정성 평가를 위해 구기자 종자 초임계유체 추출물을 1.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션과 대조군 에멀션을 관찰한 결과를 Table 4에 나타내었다. 대조군과 각 추출물을 농도별로 함유한 에멀션 모두 28일동안 입자의 분산과 분리, 합일 등과 같은 현상이 없었으므로 안정함을 확인할 수 있었다.
- 01 % 농도로 함유한 에멀션을 제조하였으며 4, 25, 45 ℃에서 28일간 보관하였을 때 에멀션의 변색, 변취, 분리 등의 현상을 보이지 않았다. 또한 25 ℃에서 28일 동안 보관한 각 농도별 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션의 pH, 점도, 입자관찰시 유의적으로 큰 변화가 없었으며, 가장 높은 농도인 1.00 % 추출물을 함유한 에멀션에서도 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
- 이러한 결과는 구기자 종자 초임계유체 추출물은 에멀션 제형에 높은 농도로 적용이 가능해 피부미백효능을 향상시킬 수 있으며, 추출물 자체의 항균력은 화장품 방부시스템에 긍정적으로 작용할 수 있으므로 화장품 원료로서의 가능성을 보여준다고 할 수 있다.
- 점도를 측정하는 기간 동안 대조군의 에멀션은 약 4,600∼5,400 cPs에 분포해 수치상의 큰 변화는 없었으며 28일이 지난 후에도 제조한 날과 비교하였을 때 구기자 종자 추출물을 함유한 시험군이 비슷한 분포로 점도가 증가하는 것을 확인할수 있었다. 일반적으로 화장품 에멀션 제형에 천연 추출물이 첨가물로 포함되는 경우 농도 의존적으로 점도가 감소하는 경우가 대부분이지만, 본 실험에 사용된 구기자 종자 추출물의 경우는 콜로이드 제형에 악영향을 주지 않고, 오히려 농도의존적으로 에멀션의 점도를 증가시켰으므로 화장품 제형 안정성에 긍정적인 영향을 주는 것으로 판단된다.
- 점도를 측정하는 기간 동안 대조군의 에멀션은 약 4,600∼5,400 cPs에 분포해 수치상의 큰 변화는 없었으며 28일이 지난 후에도 제조한 날과 비교하였을 때 구기자 종자 추출물을 함유한 시험군이 비슷한 분포로 점도가 증가하는 것을 확인할수 있었다.
- 구기자 종자 추출물을 함유한 에멀션과 대조군을 25 ℃ Incubator에서 보관하며 점도를 28일 동안 측정하였다. 추출물을 함유한 에멀션을 제조한 직후 1일 후에 점도를 측정한 결과 추출물을 함유하지 않은 대조군의 점도는 4480 cPs으로 실험군인 구기자 종자 추출물을 함유한 1.00, 0.05, 0.10, 0.05, 0.01 % 에멀션의 점도는 각 6860, 6395, 6395, 4003, 4753 cPs로 나타났으며 대조군과 비교하였을 때 추출물을 함유하는 농도가 높을수록 점도가 증가하는 것을 확인하였다. 점도를 측정하는 기간 동안 대조군의 에멀션은 약 4,600∼5,400 cPs에 분포해 수치상의 큰 변화는 없었으며 28일이 지난 후에도 제조한 날과 비교하였을 때 구기자 종자 추출물을 함유한 시험군이 비슷한 분포로 점도가 증가하는 것을 확인할수 있었다.
- 피부 흑색종인 B16/F10 세포를 이용하여 melanin 저해 활성을 측정한 결과 250, 500, 750 μg/mL 농도에서 α -MSH를 단독으로 처리한 군 대비 각각 98.36, 82.34, 81.86 %로 미백 효능이 확인되었다.
후속연구
- 33 mm 생육저해환을 나타내었다. 구기자 종자 추출물은 모든 농도에서 항균활성이 나타나진 않았지만 S. aureus, C. albicans, E. coli에서 특이적으로 항균력을 나타낸 것으로 보아 구기자 종자 추출물은 염증성 피부 혹은 문제성 피부 제품에 적용 가능할 것으로 사료된다.
- 피부의 구조와 기능적 측면으로 보았을 때 피부는 장벽 (skin barrier)으로서의 역할이 주된 것이라고 볼 수 있으며, 모근 측면의 피지선은 피부표면이 소수성의 성질을 나타내게 함으로써 비극성인 오일의 경우 친수성 물질보다 더욱 피부친화적이라 할 수 있다. 구기자 종자 추출물은 오일의 성상을 나타냄으로써 피부 미백효능에 더욱 효과적이라고 사료되며 이와 관련된 추가 실험 및 세포독성에 관한 추가 실험을 진행할 것이다.
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