[논문]오계란 단백질 가수 분해물 제조 및 한외여과 분획물의 in vitro 항산화 활성 특성

하유진; 김슬기; 유선균

doi:10.12925/jkocs.2017.34.3.673

오계란 단백질 가수 분해물 제조 및 한외여과 분획물의 in vitro 항산화 활성 특성
In vitro Antioxidant Activity of Ogae (Korean Native Black Fowl) Egg White Protein Hydrolysates Fractionated by Ultrafiltration 원문보기

한국유화학회지 = Journal of oil & applied science, v.34 no.3, 2017년, pp.673 - 682

하유진 (중부대학교 식품생명과학과) , 김슬기 (중부대학교 식품생명과학과) , 유선균 (중부대학교 식품생명과학과)

초록
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식물 및 동물성 단백질 유래 펩타이드 형태의 단백질 가수 분해물들은 항산화, 고혈압 완화, 면역조절, 진통완화 및 항균작용 등 생리활성이 있는 것으로 알려져 왔다. 본 연구는 연산오계란 단백질 가수 분해물을 Ultrafiltration를 이용하여 HDS(분획되지 않은 가수 분해물), 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa로 분획된 기능성 펩타이드의 DPPH radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity 및 $Fe^{2+}$ chelation ability을 평가하였다. 그 결과 DPPH radical scavenging activity 최대값은 1 kDa(70.83 %), hydroxyl radical scavenging activity 최대값은 5 kDa (47.01 %), superoxide anion radical scavenging activity 최대값은 5 kDa(40.57 %), $Fe^{2+}$ chelation ability 최대값은 5 kDa(29.87 %)로 나타났다. Ultrafiltration를 이용하여 fractionation된 단백질 가수 분해물의 항산화 저해 능력 $IC_{50}$ 평가하였다. 그 결과 HDS의 최대값은 superoxide anion radical scavenging activity($IC_{50}$, 5.42 mg/ml)이고, 1 kDa의 최대값은 $Fe^{2+}$ chelation ability($IC_{50}$, 1.67 mg/ml)이고, 5 kDa의 최대값은 $Fe^{2+}$ chelation ability($IC_{50}$, 2.09 mg/ml)이고, 10 kDa의 최대값은 $Fe^{2+}$ chelation ability($IC_{50}$, 2.61 mg/ml)이고, 50 kDa의 최대값은 $Fe^{2+}$ chelation ability($IC_{50}$, 4.53 mg/ml)이다. 그러므로 본 연구 결과를 바탕으로 5 kDa를 이용하여 오계란 단백질에서 분획한 펩타이드는 항산화 기능성 식품소재로서 활용할 가치가 높을 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Protein hydrolysates derived from plants and animals having antioxidant, suppression of hypertension, immunodulatory, alleviation of pain, and antimicrobial activity has been known as playing important role like hormone. This study was fractioned to hydrolysis of Ogae egg white protein using the ultrafiltration. The antioxidant activity of the produced peptides was analyzed. As a result, the maximum value of DPPH radical scavenging was 1 kDa(70.83 %), hydroxy radical scavenging was 5 kDa(47.01 %), superoxide anion radical scavenging was 5 kDa(40.57 %), and $Fe^{2+}$ chelation ability was 5 kDa(29.87 %). Furthermore, the antioxidant Inhibition concentration ($IC_{50}$) of peptides was evaluated for each fraction. As a result, the maximum value of HDS was superoxide anion radical scavenging($IC_{50}$, 5.42 mg/ml). 1 kDa was $Fe^{2+}$ chelation ability($IC_{50}$, 1.67 mg/ml), 5 kDa was $Fe^{2+}$ cheating ability($IC_{50}$, 2.09 mg/ml), 10 kDa was $Fe^{2+}$ cheating ability($IC_{50}$, 2.61 mg/ml), papain was $Fe^{2+}$ cheating ability($IC_{50}$, 4.53 mg/ml). Therefore, we expect that peptides produced from Ogae egg white protein using 5 kDa fraction are useful as an antioxidant functional food ingredients.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

DPPH의 측정 방법은 산소인 free radical이 생체 고분자들인 지질 단백질 등과 결합하여 피부의 노화 및 질병을 유발하는 물질로 밝혀진 이래로 항산화 물질의 radical scavenging activity에 이용되고 있다[17]. DPPH radical scavenging activity은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다[18]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW(deionized water)에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다.
Hydroxyl radical 에 대한 소거활성 측정은 Fan의 방법을 변형하여 측정하였다[19]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다.
Superoxide anion radical scavenging activity은 Yu의 방법을 변형하여 측정하였다[20]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다.
chelation ability이 다르게 나타났다. 가수 분해물들의 항산화 저해 능력을 비교하기 위해서 각각 가수 분해물에 대하여 IC₅₀ 평가하였다. (Table 1).
Fe, Cu, Ni 등과 같은 금속은 지질산화과정에서 촉매로 작용한다[36]. 금속 킬레이트 능력은 ferrozine이 Fe²⁺와 결합하여 붉은색을 띠게 되는데 이때 킬레이트 효과를 가진 성분이 존재하면 Fe²⁺-ferrozine 복합체 형성을 방해하여 붉은색이 탈색되어 흡광도가 저해되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하였다[37]. 또한 일부 단백질과 펩타이드는 Fe²⁺와 같은 금속 이온을 킬레이트 한다고 보고되었고, 산성 및 염기성 아미노산이 펩타이드에 의한 Fe²⁺ chelation ability에 중요한 역할을 하며, 산성 아미노산과 염기성 아미노산의 측쇄에 있는 카르복실기와 아미노기는 단백질과 펩타이드의 Fe²⁺ chelation ability에 관여하기 쉽다고 한다[38].
혼합물은 30분간 실온에서 암실 보관한 후 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 대조구로는 ascorbic acid를 이용하였으며 시료와 동일한 조건으로 측정하였다. DPPH-radical scavenging activity는 아래의 식에 의해 값을 산출하였다.
수거된 가수분해 상등액은 초저온 냉동고(-50 ℃)에서 동결 후 동결 건조하였다. 동결 건조된 단백질 가수 분해물을 정제수에 용해하였고, 분획 전 가수 분해물을 HDS(hydrolysates)로 명하고, 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa 의 ultrafiltration을 이용하여 각각 분획하여 항산화 능력을 분석하였다. Fig 1.
Hydroxyl radical 에 대한 소거활성 측정은 Fan의 방법을 변형하여 측정하였다[19]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다. 표준물질 제조는 ascorbic acid 10 mg을 10 mL DIW에 혼합하였다.
따라서 본 연구는 연산오계란 단백질 가수 분해물을 Ultrafiltration를 이용하여 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa로 분획된 기능성 펩타이드의 DPPH radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity, Chelation of metal ion radical activity을 평가하였다.
본 연구는 오계란 단백질 가수 분해물을 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa ultrafiltration를 이용하여 분획된 기능성 펩타이드의 DPPH radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity 및 Fe²⁺ chelation ability을 평가하였다.
시료용액의 Metal chelating effect는 Gulcin의 방법을 약간 변형하여 측정하였다[21]. 동결건조 분말 가수 분해물을 DIW에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다.
공급된 오계란은 100 ℃ 항온수조에서 20분 동안 가열하여 오계 노른자와 흰자를 분리하였으며 흰자만을 골라내어 골고루 다진 후 – 20 ℃ 냉동 보관하였다. 연산오계란 단백질의 가수분해는 Bromelain을 선발하여 처리하였다. 시료의 10 % PBS buffer를 넣고 효소처리는 발효기를 이용하여 시료의 3 %를 혼합한 후 반응기에서 50℃, 100 rpm, 4시간 동안 반응시켰다.
DPPH radical scavenging activity은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다[18]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW(deionized water)에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다. 추출된 시료를 일정한 농도로(10 %) 증류수에 용해한 후 시료가 포함된 용액 2 mL와 DPPH-radical(0.
Hydroxyl radical 에 대한 소거활성 측정은 Fan의 방법을 변형하여 측정하였다[19]. 항산화 특성을 평가하기 위해서 동결건조분말 가수 분해물을 DIW에 용해를 한 다음 10 kDa 한 외막을 이용하여 분리하였다. 표준물질 제조는 ascorbic acid 10 mg을 10 mL DIW에 혼합하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 오계란은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 제공하였다. 단백질 분해효소 bromelain은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 항산화활성 측정에 사용된 시약 DPPH-radical, ascorbic acid, 1,10-phenanthroline, FeSO₄, hydrogen peroxid, Tris–HCl buffer(pH 8.
본 실험에 사용된 연산 오계란은 지산농원에서 제공되었다. 공급된 오계란은 100 ℃ 항온수조에서 20분 동안 가열하여 오계 노른자와 흰자를 분리하였으며 흰자만을 골라내어 골고루 다진 후 – 20 ℃ 냉동 보관하였다.
본 실험에 사용된 오계란은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 제공하였다. 단백질 분해효소 bromelain은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다.
항산화활성 측정에 사용된 시약 DPPH-radical, ascorbic acid, 1,10-phenanthroline, FeSO4, hydrogen peroxid, Tris–HCl buffer(pH 8.3), pyrogallol, FeCl2, methanol, ferrozine, ethylene diamine tetra acetic acid(EDTA)는 Sigma (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

성능/효과

01 %로 가장 높은 활성을 보여준다. 1 kDa 와 5 kDa 의 hydroxyl radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, HDS, 10 kDa와 50 kDa의 hydroxyl radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하여서 통계적 유의성이 있다고 볼 수 있었다. 반면에 수수의 hydroxyl radical scavenging activity은 70.
57 %로 가장 높은 활성을 보여 준다. 1 kDa 와 5 kDa 의 superoxide anion radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, 또한 10 kDa 와 50 kDa 의 Superoxide anion radical scavenging activity도 마찬가지로 유의수준 5 % 하여서 통계적으로 유의적 차이가 없다고 볼 수 있었다. 우리 연구와 비슷한 결과로 옥수수 단백질 가수 분해물의 펩타이드는 Radical scavenging activity 이 47.
35 mg/ml이었다. 1 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었으며 그 값은 1.67, 1.27, 1.09, 및 0.71 mg/ml 이었다. 5 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었고, 그 값은 각각 2.
1. DPPH radical scavenging activity은 약 21.27 %에서 70.83 % 사이의 분포를 보여 주었는데 1 kDa 일 때 70.83 % 로 가장 높았고, HDS 일 때 21.27 %로 가장 낮게 나타내었다.
90 mg/ml이었다. 10 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었으며 그 값은 각각 2.61, 1.73, 1.40 및 1.18mg/ml이었다. 50 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었고, 그 값은 각각 4.
5 kDa 의 DPPH radical scavenging activity은 1 kDa 와 10 kDa 일 경우 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, HDS와 50 kDa의 DPPH radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하여서 통계적 유의성이 있다고 볼 수 있었다. 연구 결과에 따르면 펩타이드들의 항산화 능력은 1) 구성아미노산 중에서 비극성 및 방향족 아미노산, 2) 분자량이 작을수록 항산화 능력이 높은 것으로 알려 졌다. 우리 연구 결과와 마찬가지로, 퀴노아 단백질 가수 분해물[23], 대마씨 단백질 가수 분해물[24]과 검은 갈치 단백질 가수 분해물은[25] 저 분자량 펩타이드가 더 높은 DPPH 소거활성을 나타낸다는 보고가 있었다.
2. Hydroxyl radical scavenging activity은 약 9.23 %에서 47.01 % 사이의 분포를 보여 주었는데 5 kDa 에서 47.01 %로 가장 높았고, HDS 에서 9.23 %로 가장 낮게 나타내었다.
3. Superoxide anion radical scavenging activity은 약 11.27 %에서 40.57 % 사이의 분포를 보여 주었는데 5 kDa 에서 40.57 %로 가장 높았고, HDS 에서 11.27 %로 가장 낮게 나타내었다.
4. Fe²⁺ chelation ability은 약 11.04 %에서 29.87 % 사이의 분포를 보여 주었는데 1 kDa 에서 29.87 %로 가장 높았고, 50 kDa 에서 11.04 % 로 가장 낮게 나타내었다. 5.
71 mg/ml 이었다. 5 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었고, 그 값은 각각 2.09, 1.23, 1.06 및 0.90 mg/ml이었다. 10 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었으며 그 값은 각각 2.
04 % 로 가장 낮게 나타내었다. 5. Ultrafiltration를 이용하여 HDS, 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa로 fractionation된 단백질 가수 분해물의 항산화 저해 능력 IC50 평가한 결과, HDS에 의하여 항산화 저해농도가 가장 높은 값은 superoxide anion radical scavenging activity(IC₅₀, 5.42 mg/ml)이고, 1 kDa에 의하여 항산화 저해농도가 가장 높은 값은 Fe²⁺ chelation ability(IC₅₀, 1.67 mg/ml)이고, 5 kDa에서는 Fe²⁺ chelation ability(IC₅₀, 2.09mg/ml), 10 kDa에서는 Fe²⁺ chelation ability(IC₅₀, 2.61 mg/ml), 50 kDa에서는 Fe²⁺ chelation ability(IC₅₀, 4.53 mg/ml)이 었다.
18mg/ml이었다. 50 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었고, 그 값은 각각 4.53, 2.45, 1.76 및 1.50 mg/ml이었다. 이와 비슷한 결과로 옥수수의 단백질 가수 분해물의 hydroxyl radical scavenging activity은 IC₅₀ 값이 0-4 mg/ml 로 높은 활성을 나타낸다[34].
(Table 1). HDS 가수 분해물의 superoxide anion radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity, Fe²⁺ chelation ability 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었고 그 값은 각각 5.42, 4.44 4.13 및 2.35 mg/ml이었다. 1 kDa에 의하여 생산된 가수 분해물은 Fe²⁺ chelation ability, hydroxyl radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity 및 DPPH radical scavenging activity 순서로 저해농도가 높음을 보여 주었으며 그 값은 1.
87 %로 가장 높은 활성을 보여 준다. HDS 와 50 kDa 의 Fe²⁺ chelation ability는 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, 반대로 1 kDa, 5 kDa 와 10 kDa 의 Fe²⁺ chelation ability는 유의수준 5 % 하여서 통계적으로 유의적 차이가 있다고 볼 수 있었다. 이와 비슷하게 Girgih 등 [39] 연구에서도 Fe²⁺ chelation ability은 펩티드 크기가 증가할 때 감소했으며, 낮은 분자량의 펩티드가 Fe²⁺ chelation ability에 더 큰 효과가 나타났다.
87 % 사이의 분포를 보여 주었는데 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, HDS, 50 kDa 순으로 나타났으며. 가장 높은 활성을 보여준 것은 1 kDa로 fraction한 것이며, 29.87 %로 가장 높은 활성을 보여 준다. HDS 와 50 kDa 의 Fe²⁺ chelation ability는 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, 반대로 1 kDa, 5 kDa 와 10 kDa 의 Fe²⁺ chelation ability는 유의수준 5 % 하여서 통계적으로 유의적 차이가 있다고 볼 수 있었다.
83 % 사이의 분포를 나타내었는데 radical scavenging activity은 1 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa, HDS 순으로 나타났으며. 가장 높은 활성을 보여준 것은 1 kDa로 fraction한 것이며, 70.83 %로 가장 높은 활성을 보여준다. 5 kDa 의 DPPH radical scavenging activity은 1 kDa 와 10 kDa 일 경우 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, HDS와 50 kDa의 DPPH radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하여서 통계적 유의성이 있다고 볼 수 있었다.
57 % 사이의 분포를 보여 주었는데, superoxide anion radical scavenging activity은 5 kDa, 1 kDa, 10 kDa, 50 kDa, HDS 순으로 나타났으며. 가장 높은 활성을 보여준 것은 5 kDa로 fraction한 것이며, 40.57 %로 가장 높은 활성을 보여 준다. 1 kDa 와 5 kDa 의 superoxide anion radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, 또한 10 kDa 와 50 kDa 의 Superoxide anion radical scavenging activity도 마찬가지로 유의수준 5 % 하여서 통계적으로 유의적 차이가 없다고 볼 수 있었다.
00 % 사이의 분포를 보여주었는데, hydroxyl radical scavenging activity은 5 kDa, 1 kDa, 10 kDa, 50 kDa, HDS 순으로 나타났으며. 가장 높은 활성을 보여준 것은 5 kDa로 fraction한 것이며, 47.01 %로 가장 높은 활성을 보여준다. 1 kDa 와 5 kDa 의 hydroxyl radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, HDS, 10 kDa와 50 kDa의 hydroxyl radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하여서 통계적 유의성이 있다고 볼 수 있었다.
1 kDa 와 5 kDa 의 superoxide anion radical scavenging activity은 유의수준 5 % 하에서 통계적으로 유의적 차이가 없었고, 또한 10 kDa 와 50 kDa 의 Superoxide anion radical scavenging activity도 마찬가지로 유의수준 5 % 하여서 통계적으로 유의적 차이가 없다고 볼 수 있었다. 우리 연구와 비슷한 결과로 옥수수 단백질 가수 분해물의 펩타이드는 Radical scavenging activity 이 47.45 %로 높은 활성을 보여주었다. 이는 옥수수 단백질 즉 제인 단백질의 펩타이드는 우수한 과산화물 radical scavenging activity 제거제일 수 있다[34, 35].

후속연구

6. 그러므로 본 연구 결과를 바탕으로 5 kDa를 이용하여 오계란 단백질에서 분획한 펩타이드는 항산화 기능성 식품소재로서 활용할 가치가 높을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Phosvitin는 어떤 구조로 되어있는가?	천연기념물 265호로 지정이 된 한국 재래 오골계인 연산 오계는 예로부터 질병을 예방하고 건강을 개선하는 식품으로 알려져 왔다. 특히 항암효과로 알려진 오계의 난황 단백질인Phosvitin은 아미노산 사슬의 50 % 이상을 인산화 된 serine이 차지하고 있는 특이한 구조로 되어있는데[2], 이러한 특이구조로 인해 phosvitin은 강력한 Fe2+ metal chelator로 작용한다고 보고되고 있으며[3], Fe2+ chelation ability으로 인해 phosvitin이 항산화제로서 금속이온에 의해 발생되는 지방 산패를 억제할 수 있는 것으로 발표되었다[4, 5]. 이외에 닭 가공 공정 부산물 단백질, 닭 가슴살 단백질, 닭 날개 단백질, 난 단백질, 닭 피부 단백질로부터 기능성 펩타이드 생산 및 생리활성에 대한 연구들이 발표되고 있다[6-12].
	막 분리는 무엇인가?	막 분리(membrane separation)는 환경 친화적이고 비교적 적은 공정비로 유용한 물질을 분획하는 기술이다[13]. 많은 연구들이 단백질 및 단백질 가수 분해물들의 분획을 pH, 온도, 이온강도 등 조건에 따라 막과 물질과의 상호 연관에 대한 많은 연구들이 발표 되어 오고 있다[14].
	항산화제의 프로톤공여 능력은 DPPH radical scavenging activity의 어떤 지표를 통해 나타나는가?	DPPH radical scavenging activity는 DPPH radical이 항산화제와 같은 프로톤공여(proton donating) 물질과 반응하면 radical이 scavenging된다. 그리고 항산화제의 프로톤공여 능력에 따라서 짙은 보라색이 탈색되어 노란색으로 변하는 정도를 지표로 하여 항산화력을 측정하는 방법이다[22].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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