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문제 정의
- 수컷 랫드가 암컷과 교미하기 전에 섭취한 식이는 또 한세대의 후손에서 영양대사 및 번식과 관련한 건강에 영향을 미칠 수 있음이 보고되었다 [18,21]. 본 연구는 부모가 교미 1개월 전부터 임신- 분만-출생-이유 후 성장기까지 2세대에 걸쳐 서식이 내 오메가 6와 오메가 3 지방산의 비율을 서로 다르게 조절하였을 때 차세대 랫드의 성장능력, 혈액 지질, 간 기능 관련 효소 수준에 관한 지질대사의 생화학적 메카니즘을 조사하였다.
- 본 연구는 차세대 랫드에서 오메가 6와 오메가3 비율이 서로 다른 식이(0, 1:1, 8:1, 19:1)의 섭취가 성장능력, 혈액 지질, 간 기능 관련 효소수준에 관한 생화학적 지질대사의 메카니즘을 조사하였다. 식이섭취량 및 식이효율은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1 그룹이 높았다.
가설 설정
- a,bValues within the same line with different superscript are significantly different (n=6,p<0.05).
- a,bValues within the same line withdifferent superscript are significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 냉각시킨 후 1 mL의 BF3-methanol을 넣어 다시 15분간 가열해서 메칠화하였다. NaCl 포화용액과 heptane 혼합 용액(8:1)을 가하여 1분간 혼합, 30분 동안 실온에 방치 후 상등액 1 uL를 취해서 지방산을 분석하였다. 지방산 메칠에스터는 capillary gas liquid chromatography (Hewlett Packard 6890 gas chromatograph equipped with a 30 m×0.
- dimethylformamide과 pyridine에서 각각 제조된 중성스테롤과 산성스테롤의 TMS (Trimethylsilylether) 유도체 3 μL를 Gas-liquid chromatography (Packard model 439, USA)에 주입하여서 스테로이드 함량을 측정하였다.
- carriergas로써 helium의 유입속도를 분 당 1 mL로 조절하였다. injector와 detector temperature는 각각 230, 250℃로 실행하였다. column oven temperature는 155℃까지 분당 8℃, 180℃까지 분당 1.
- Tokyo, Japan)로써 측정하였다. 간 기능효소 Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT)는 혈액 생화학적 자동분석기 (Fuji Dri-Chem 3500, Tokyo, Japan)로써 측정하였다. 혈당은 Beckman glucose analyzer(Beckman instrument Co.
- 간으로부터 마이크로좀을 분리하였고 마이크로좀의 단백질과 HMG-CoA reductase activity를 측정하였다. 시약으로써 Triton X-100, NADPH(Sigma aldrich Inc.
- 0014를 함유하였다 [23]. 동물은 실온 20-24℃, 상대습도55-58%, 12시간 점등조절로 유지되는 사육실의 폴리에틸렌 케이지에 사육하였으며 물과 실험식이를 무제한 급여하였다. 식이 내 오메가 6와 오메가 3 비율은 대조구의 경우 코코넛유 7.
- 2 animal source (Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용하였다. 분리는Hewlett Packard GC Chem Station software(HP GC, Wilmington, DE)를 이용하여 기록하였다 [26].
- 동물은 실온 20-24℃, 상대습도55-58%, 12시간 점등조절로 유지되는 사육실의 폴리에틸렌 케이지에 사육하였으며 물과 실험식이를 무제한 급여하였다. 식이 내 오메가 6와 오메가 3 비율은 대조구의 경우 코코넛유 7.0%를첨가하였으며, 오메가 6와 오메가 3 수준 처리구는 1:1 (아마씨유 3.50%+옥수수유 3.50%), 8:1(아마씨유 0.46%+옥수수유 6.54%), 19:1 (대두유 1.68%+옥수수유 5.32%)로 각각 조절하였다. 지방 급원의 지방산 조성은 Table 1에 제시하였으며 사료 지방산 조성은 Table 2와 같다.
- 식이 섭취량과 체중은 10일에 1회씩 측정하였다. 일정한 기간 중 식이 섭취량과 체중 증가량을 총 사육일 수로 나누어 일정한 기간 동안의 평균 식이 섭취량과 체중 증가량을 계산하였다.
- 일정한 기간 중 식이 섭취량과 체중 증가량을 총 사육일 수로 나누어 일정한 기간 동안의 평균 식이 섭취량과 체중 증가량을 계산하였다. 식이효율은 일일 평균 체중 증가량에 대한 식이섭취량의 비율(식이 섭취량/체중 증가량)로서 계산하였다.
- 교미하기 전까지 30일 동안 암수를 분리하여 실험 식이를 급여하였다. 실험식이 처리구는 대조구(오메가 6와 오메가 3 비율, 0), 오메가 6와 오메가 3 비율 1:1, 8:1, 19:1 그룹으로 구분하였다. 동일한 실험 식이를 급여한 암수끼리 일정 기간 동거를 실시하여 임신기간을 거치고 분만 직전에 수컷을 케이지로부터 분리하였다.
- 실험식이를 섭취한 동물로부터 배설되는 스테롤의 함량을 측정하기 위해 실험 종료 3일 전부터 종료 일까지 배설된 분을 채취하여 무게를 측정하였다. 분은 동결건조기(SFDSF12, SamwonCo.
- 혈액 중 유해 지질과 간기능을 나타내는 효소의 수준은 1:1 그룹에서 가장 낮았다. 오메가 6와 오메가 3 비율 1:1, 8:1그룹에서 HMG-CoA reductase의 활성을 억제함과 동시에 분을 통한 스테롤의 배설을 촉진시켰다. 혈액 중 오메가 6와 오메가 3 비율은 식이내 오메가 6와 오메가 3 비율 증가와 관련하여 농도 의존적으로 높아졌다.
- 원심분리 관에 교반액과 증류수 20 mL를 가하여 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 지질을 함유하는 클로로포름 층을 분리하여 질소가스를 주입하면서 농축하여 지질을 추출하였다. 지질을 검화용 반응용기에 취해서 methanolic 0.
- 식이 섭취량과 체중은 10일에 1회씩 측정하였다. 일정한 기간 중 식이 섭취량과 체중 증가량을 총 사육일 수로 나누어 일정한 기간 동안의 평균 식이 섭취량과 체중 증가량을 계산하였다. 식이효율은 일일 평균 체중 증가량에 대한 식이섭취량의 비율(식이 섭취량/체중 증가량)로서 계산하였다.
- 한 배 새끼 중 건강하게 잘 자란 자손 가운데서 수컷 6마리를 재배치 한 후 성장 8주령까지 사육하였다. 즉, 차세대 랫드 수컷 총 24마리를 4처리구 6반복으로 완전임의 배치하여 성장능력 및 생화학적 지질대사 메카니즘을 규명하였다. 동물실험을 포함한 모든 절차는 EEC Directive(86/609/EEC)에서 제시된 과학적이고 윤리적인 규정을 따랐으며 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 얻어서 진행하였다 (KNU-1618).
- 지방산 메칠에스터는 capillary gas liquid chromatography (Hewlett Packard 6890 gas chromatograph equipped with a 30 m×0.25 mm SP-2380 column, film thickness, 20 μm)에 의해서 분석하였다.
- 동일한 실험 식이를 급여한 암수끼리 일정 기간 동거를 실시하여 임신기간을 거치고 분만 직전에 수컷을 케이지로부터 분리하였다. 한마리 당 출생한 자손을 8마리씩으로 조절하여 출생 후 22일째 이유를 실시하였다. 한 배 새끼 중 건강하게 잘 자란 자손 가운데서 수컷 6마리를 재배치 한 후 성장 8주령까지 사육하였다.
- 생화학적 분석을 위해 -196℃의 액체질소 가스에 급속냉동 처리한 다음 분석 시까지 냉동 보관하였다. 혈액 내 triacylglyceride (TAG), total cholesterol (TC), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) 및 phospholipid은 Diagnostic kit (Sigma chemical Co., St, Louis, MO, USA)를 이용하여 자동분석장치 (Hitachi 917, Hitachi Ltd. Tokyo, Japan)로써 측정하였다. 간 기능효소 Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT)는 혈액 생화학적 자동분석기 (Fuji Dri-Chem 3500, Tokyo, Japan)로써 측정하였다.
대상 데이터
- HMG-CoA reductase 반응용액 125μL의 첨가와 동시에 37℃ water bath에서 정확히 30 분 간 유지하였고 이때 시료 사이의 시간차이는 5분으로 하였다. 340 nm에서 반응 직전의 흡광도를 측정하였고 30분 반응 후 감소율을 측정하였으며 사용된 기기는 double beam spectrophotometer (JASCO model UVIDEC610, Japan)이었다. NADPH의 내인성 산화율을 측정하여 이를 시료의 측정치로부터 뺀 값으로 보정해주었고, HMG-CoA reductase activity는 NADPH의 산화된 양으로서 나타냈다 [24].
- 내부표준물질로써 5α-cholestane (Sigma-aldrichInc., St. Louis, USA), nordesoxycholic acid(Toronto research chemicals Inc., Canada), 그리고 DBM capillary column (0.25 mm×30 m,J & W Scientific, Folsom, CA)을 이용하였다.
- 번식을 위하여 Sprague-Dawley 랫드 (암컷 315±5 g, 숫컷 230±5 g)각각 12마리씩을 충청북도 음성군에 소재한 ㈜대한바이오링크로부터 공급받았다.
- 간으로부터 마이크로좀을 분리하였고 마이크로좀의 단백질과 HMG-CoA reductase activity를 측정하였다. 시약으로써 Triton X-100, NADPH(Sigma aldrich Inc., St. Louis, USA), HMG-CoA reductase (Pharmacia LKB Biotechnology, USA)를 사용하였다. 빛으로 인한산화적 손실을 피하기 위하여 항산화제로서 아스코르빈산 150 ppm을 간 조직과 homogenizing buffer (w/v 1:2)의 혼합물에 첨가하여 균질화하였다.
- 혈액지질 프로파일 분석을 위하여 실험 종료 12시간 전에 식이를 철회하여 절식시켰다. 에틸에테르로써 가볍게 마취시키고 복부를 절개하여 heparinized tubes (Franklin lakes, NJ07417,USA) 속으로 25 gage 주사기를 이용하여서 복대동맥으로부터 3 mL의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 즉시 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 얻었다.
- 한마리 당 출생한 자손을 8마리씩으로 조절하여 출생 후 22일째 이유를 실시하였다. 한 배 새끼 중 건강하게 잘 자란 자손 가운데서 수컷 6마리를 재배치 한 후 성장 8주령까지 사육하였다. 즉, 차세대 랫드 수컷 총 24마리를 4처리구 6반복으로 완전임의 배치하여 성장능력 및 생화학적 지질대사 메카니즘을 규명하였다.
데이터처리
- one- way analysis of variance과 Duncan's multiple range test에 의해서 각 처리구의 평균값에 대한 통계적인 유의차 (p< 0.05)를 검증하였다.
이론/모형
- 실험동물 식이는 미국 영양연구소에서 제시한 랫드의 영양소요구량 [22]을 충족 또는 초과할수 있도록 조절된 정제 펠렛식이를 이용하였다. 정제 펠렛식이는 제조 후 70℃ 건조오븐에서 24시간 건조하여 수분 12%를 함유하였다.
성능/효과
- HMG-CoA reductase 활성은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1 그룹에서 각각 36.45, 33.04,17.36% 낮았으며 19:1을 제외한 1:1, 8:1 사이의 유의차가 인정되었다 (p<0.05).
- 간 기능을 나타내는 지표인 AST, ALT는 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1 순서로 낮아졌으며 AST는 37.13, 19.70, 5.25%,ALT는 43.54, 20.06, 5.90% 각각 감소하였다(p<0.05).
- 식이섭취량 및 식이효율은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1 그룹이 높았다. 간, 비장은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1 그룹이 높았고 흉선은 1:1 그룹이 높았다. 혈액 중 유해 지질과 간기능을 나타내는 효소의 수준은 1:1 그룹에서 가장 낮았다.
- 05). 결과의 중요한 발견은 오메가 6와 오메가 3 비율 1;1, 8:1을 함유하는 식이를 섭취한 차세대 랫드에서 간 콜레스테롤 합성효소의 활성을 억제함과 동시에 분을 통한 스테롤의 배설을 촉진시킨다는 점이었다. 실험동물에서 오메가 3 지방산은 세포막 지방포화도의 변화로 인하여 HMG-CoA reductase 활성을 조절해줌으로써 혈중 콜레스테롤의 증가를 낮출 수 있음이 보고되었다 [32, 33].
- 혈액 중 오메가 6와 오메가 3 비율은 식이내 오메가 6와 오메가 3 비율 증가와 관련하여 농도 의존적으로 높아졌다. 결론적으로, 부모 세대부터 차세대에 이르는 랫드에게 오메가 6와 오메가 3 비율이 1:1 또는 8:1을 함유하는 식이를 급여하면 혈액 유해 지질, 간 기능효소, 조직세포의 발육, HMG-CoA reductase 활성 및 분을 통한 스테롤의 배설과 관련한 지질대사의 생화학적 메카니즘을 경유하여 건강을 유지함과 동시에 성장능력을 개선할 수 있다는 점을 보여준다.
- 05). 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1에서 총 산성스테롤 2.08, 2.11, 1.68배, 총 담즙산 2.05,2.01, 1.70배, lithocholic acid 3.26, 3.71, 2.90배, deoxycholic acid 2.65, 2.50, 1.09배, cholicacid 1.81, 2.57, 1.06배로 각각 높게 나타났다. 이러한 중성스테롤과 산성스테롤의 배설은 총 스테롤의 배설량에 영향하였으며 총스테롤의 배설량은 대조구에 비해서 1:1 그룹 2.
- 05) 19:1과 대조구, 그리고 1:1, 8:1, 19:1 사이의 차이는 없었다. 본 결과에서 오메가 6와 오메가 3 비율 8:1 이하를 함유하는 식이의 섭취는 차세대 랫드에서 체중에 영향을 주지 않으면서 식이효율을 향상시킬 수 있었다. 오메가 6와 오메가3 비율이 낮은 식이의 섭취는 랫드의 식욕과 지질대사 개선을 통하여 체중증가를 꽤할 수 있음이 보고되었다 [14, 27].
- 분을 통하여 배설되는 일일 중성스테롤의 총량, 총콜레스테롤은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1 순서로 유의하게 높았으며 코프로스타놀은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1에서 각각 1.21, 1.63,1.24배 높아졌다 (p<0.05).
- 불포화지방산과 포화지방산의 비율은 대조구, 1:1, 8:1, 19:1에서 각각 0.91, 0.71, 0.56, 0.69로 나타나서 대조구가 높은 경향을 보였으나 대조구, 1:1, 19:1 사이는 서로 비슷하였고 8:1은 대조구에 비해서 낮았으나 오메가 6와 오메가 3 처리구 사이의 차이는 없었다 (p<0.05).
- 본 연구는 차세대 랫드에서 오메가 6와 오메가3 비율이 서로 다른 식이(0, 1:1, 8:1, 19:1)의 섭취가 성장능력, 혈액 지질, 간 기능 관련 효소수준에 관한 생화학적 지질대사의 메카니즘을 조사하였다. 식이섭취량 및 식이효율은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1 그룹이 높았다. 간, 비장은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1 그룹이 높았고 흉선은 1:1 그룹이 높았다.
- 19%로 구성되었음을 확인하였다 (Table 1). 실험사료의 오메가 6와 오메가 3 비율은 대조구 0, 1:1 , 8:1, 19:1로 나타났다 (Table 2). 오메가 6와 오메가 3 비율이 동일한 실험식이를 동거 30일 전부터 부모에게 급여한 이 후 동거, 임신, 분만 후 이유, 성장 8주령까지의 차세대 랫드에서 성장능력을 조사한 결과는 Table 3과 같다.
- 이러한 중성스테롤과 산성스테롤의 배설은 총 스테롤의 배설량에 영향하였으며 총스테롤의 배설량은 대조구에 비해서 1:1 그룹 2.39, 8:1 그룹 2.19, 19:1 그룹 1.73배로 유의하게 높은 경향을 보여주었다 (p<0.05).
- 05). 중성스테롤의 배설량은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1에서 총중성스테롤 2.66, 2.26, 1.79배, 총콜레스테롤2.91, 2.37, 1.88배 각각 높게 나타났으며, 코프로스타놀은 8:1, 19:1에서 각각 1.63. 1.
- 지방 급원에서 조사한 오메가 6와 오메가 3비율은 코코넛유 0, 옥수수유 122.7, 아마씨유0.33, 대두유 7.53으로 나타났으며 포화지방산은 각각 93.12, 16.52, 9.08, 17.81%, 불포화지방산은 각각 6.88, 83.48, 90.92, 82.19%로 구성되었음을 확인하였다 (Table 1). 실험사료의 오메가 6와 오메가 3 비율은 대조구 0, 1:1 , 8:1, 19:1로 나타났다 (Table 2).
- 05). 한편, 오메가 6와 오메가 3 비율 19:1에서 AST, ALT 수준은 대조구와 비교할 때 각각 5.25, 5.90% 낮아지는 경향을 보였으나 이들 사이의 통계적 유의차는 인정되지 않았다. 혈당은 대조구와 비교할 때 1:1, 8:1, 19:1 순서로 각각 23.
- 오메가 6와 오메가 3 비율 1:1, 8:1그룹에서 HMG-CoA reductase의 활성을 억제함과 동시에 분을 통한 스테롤의 배설을 촉진시켰다. 혈액 중 오메가 6와 오메가 3 비율은 식이내 오메가 6와 오메가 3 비율 증가와 관련하여 농도 의존적으로 높아졌다. 결론적으로, 부모 세대부터 차세대에 이르는 랫드에게 오메가 6와 오메가 3 비율이 1:1 또는 8:1을 함유하는 식이를 급여하면 혈액 유해 지질, 간 기능효소, 조직세포의 발육, HMG-CoA reductase 활성 및 분을 통한 스테롤의 배설과 관련한 지질대사의 생화학적 메카니즘을 경유하여 건강을 유지함과 동시에 성장능력을 개선할 수 있다는 점을 보여준다.
- 혈액 중 오메가 6와 오메가 3비율은 대조구는 전혀 측정되지 않았으나 1:1, 8:1, 19:1에서 각각 7.20, 15.11, 20.81로써 농도 의존적으로 높게 나타났으며 각 처리군 사이의 차이가 있었다 (p<0.05).
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