유재묘
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
강윤환
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
김동희
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
박태순
(National Development Institute of Korean Medicine)
본 연구에서는 탁리산 열수추출물을 용매 분획하여 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 검증하여 화장품 소재로서 이용가능성을 연구하였다. 용매 분획물로 DPPH radical scavenge, ABTS radical scavenge, elastase, tyrosinase 저해활성을 확인하였고 에틸아세테이트 분획물(TW-EA)이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 세포내에서의 주름억제, 미백효과를 확인하기 위해서 western blot을 실시하였고 비교 검증을 위해 사용한 positive contol보다 TW-EA의 억제효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과로 탁리산의 화장품소재로서 적용 가능성을 검증하였다.
본 연구에서는 탁리산 열수추출물을 용매 분획하여 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 검증하여 화장품 소재로서 이용가능성을 연구하였다. 용매 분획물로 DPPH radical scavenge, ABTS radical scavenge, elastase, tyrosinase 저해활성을 확인하였고 에틸아세테이트 분획물(TW-EA)이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 세포내에서의 주름억제, 미백효과를 확인하기 위해서 western blot을 실시하였고 비교 검증을 위해 사용한 positive contol보다 TW-EA의 억제효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과로 탁리산의 화장품소재로서 적용 가능성을 검증하였다.
In this study, the activity of Takli-san for anti-oxidation, anti-wrinkle and whitening effect was verified and its applicability as a cosmetic material was confirmed. 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase an...
In this study, the activity of Takli-san for anti-oxidation, anti-wrinkle and whitening effect was verified and its applicability as a cosmetic material was confirmed. 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase and tyrosinase inhibitory activity were investigated by solvent fraction, and ethyl acetate fraction of water extract from Takli-san (TW-EA) showed the highest inhibitory activity. Western blot was performed to confirm anti-wrinkle and whitening effect in the cells, and it was investigeted that the TW-EA inhibition effect was superior to that of the positive contol used for the comparison test. Through the results of the experiments, the applicability as a cosmetic material of Takli-san was verified.
In this study, the activity of Takli-san for anti-oxidation, anti-wrinkle and whitening effect was verified and its applicability as a cosmetic material was confirmed. 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase and tyrosinase inhibitory activity were investigated by solvent fraction, and ethyl acetate fraction of water extract from Takli-san (TW-EA) showed the highest inhibitory activity. Western blot was performed to confirm anti-wrinkle and whitening effect in the cells, and it was investigeted that the TW-EA inhibition effect was superior to that of the positive contol used for the comparison test. Through the results of the experiments, the applicability as a cosmetic material of Takli-san was verified.
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문제 정의
본 연구에서는 탁리산 열수추출물의 용매 분획물을 이용하여 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 검증하였다.
기존에 한약처방으로 보고된 연구로는 연교승마탕(Kim 등,2008a), 황연해독탕(Yun 등, 2008), 경옥고 가미방(Choi 등,2007), 신효탁리산(Kang 등, 2016) 등이 있다. 본 연구에서는탁리산을 이용하여 연구하고자 한다.
제안 방법
CCD-986sk cell에 elastase 억제활성 측정결과 가장 우수한 효능을 나타낸 TW-EA를 이용하여 procollagen의 합성양을 평가하기 위해 PIP EIA kit를 이용하여 free propeptide 생성양을 검출하였다. Collagens는 procollagens이라고 불리는 전구체로 합성되고 이것은 propeptides라고 불리는 펩타이드 서열을 포함하고 있다(Kim 등, 2008b).
DPPH radical 소거능에 대한 실험은 Blois 등 (1958)을 변형하여 96 well plate를 이용하여 측정하였다. 각 시료 100 μL에 0.
ROS-Glo™ H2O2 assay kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS 발생량을 측정하였다.
UV-B에 노출된 피부는 활성산소종(ROS)을 생성하는데 이것은 세포내에 영향을 주어 피부손상을 주기 때문에 이것의 제거 능을 검증하기 위해(Fisher 등, 1997; Yoon 등, 2003; Di Girolamo등, 2006; Shimauchi 등, 2008; Han 등, 2013), ROS를 유도한 뒤 DPPH와 ABTS raical 소거능 측정결과에서 가장 우수한 효능을 나타낸 TW-EA를 농도별로 처리하여 항산화능을 측정하였다. 그 결과 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였고 100μg/mL의 농도에서 46.
각 시료 50 μL에 희석한 ABTS용액 100 μL를 가하여 5분 동안 방치한 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 후 PBS로 교환하여 UVB (20 mJ/cm2)를 조사하고 다시 배지교환 후, TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 시료를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 차가운 PBS로 세척하였다.
PVDF membrane을 1×TBST에 녹인 5% BSA에 1시간 동안 반응시켜 background를 제거하고 TBST로 3회 washing 한 후 primary antibody (1:500)를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 secondary antibody (1:500)를 2.5시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 washing 한 후 Immobilon chemiluminescent reagents로 측정하였다. Band density는 ImageQuant LAS-4000(GE life sciences, Taipei, Taiwan)으로 확인하였다.
3 g을 얻었다. 그중 14 g을 가지고 순차적 용매분획법을 이용하여 n-hexane 분획물(0.67 g), ethyl acetate 분획물(1.1 g), butanol 분획물(4.57 g) 최종 물분획물(7.5 g)을 확보하였다.
본 실험에 사용된 세포주는 fibroblast인 CCD-986sk cell과 melanocyte인 HEM cell을 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지와 human melanocyte growth medium(CEFO, Seoul, Korea)에 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)를 첨가한 배지를 각각 사용하였으며, 37 oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
시료의 주름억제 효능을 검증하기 위해 elastase 억제활성과 PIP 생성량 확인 및 collagen 분해를 통한 광노화 유도 인자인 MMPs에 대해 western blot을 실시하였다. 피부 주름은 진피에 존재하는 collagen과 elastin의 그물망 구조가 깨지면서 일어나는데, 이것은 자외선, 나이 그리고 스트레스 등으로 인해 과발현된 elastase에 의해서 이루어진다(Voegeli 1996).
시료의 항산화 효과를 검증하기 위해 DPPH, ABTS radical 소거능 측정, ROS-GloTM H2O2 assay kit를 이용한 ROS 생성량 측정을 수행하였다. DPPH는 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정한 구조의 라디칼로 존재하는 화합물 내 질소 중심의 라디칼이다.
여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 20 μL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 microplatereader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 후 UV-B (20 mJ/cm2)를 조사하고 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 처리한 후 각 well에 시료를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양한 세포의 배양액을 채취하여 procollagen type-C peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio)를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.
Melanocyte에는 melanin을 합성하는 효소를 가지고 있는melanosome이 존재하고, 그 중 tyrosinase는 tyrosine을 DOPA, DOPA quinone으로 산화시키는 과정에 관여하여 melanin 생합성에 영향을 준다(Iwata 등, 1990). 이에 세포에서 미백효능을 확인하기 위해 melanocyte의 한 종류인 HEM cell에 TW-EA와 positive control인 arbutin을 농도별로 처리하였고 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현을 검증하였다. MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 순서로 50 μg/mL의 농도에서 62, 58, 34, 19%의 저해 활성을 나타내었고 positive control인 arbutin은 동일 농도에서 각 각 33, 48, 22, 8%의 억제효과를 보여 TW-EA의 효능이 더 높게 나타났다(Fig.
이후, 배양된 배지를 제거하고 PBS를 넣어 UV-B (20 mJ/cm2)를 처리하고 PBS를 제거한뒤 DMEM 배지를 각 well에 넣고 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가한 후 시료를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양하고 ROS 발생양을 microplate reader를 사용하여 측정하였다.
탁리산 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(TW-EA)로 CCD-986sk cell과 HEM cell에서 세포 독성을 확인하기 위하여 시료를 6.25, 12.5, 25, 50, 75, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 관찰하였다.
대상 데이터
Melanin 생성 유발을 위한 human tumor necrosis factor-α with carrier, sterile (TNF-α)는 Cell Signaling사(Danvers, MA,USA)에서 구입하여 사용하였다.
주름 및 항산화활성 측정을 위해 procollagen type I C-peptide kit (Takara Shuzo, Kyoto,Japan)와 ROS-GloTM H2O2 assay kit (Promega, Madison,WI, USA)를 구입하여 사용하였다. Primary antibody인 MMPs및 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2와 secondary antibody는 Santa cruz biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 세포주는 fibroblast인 CCD-986sk cell과 melanocyte인 HEM cell을 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지와 human melanocyte growth medium(CEFO, Seoul, Korea)에 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)를 첨가한 배지를 각각 사용하였으며, 37 oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 구성 약재는 2016년 2월 (주)휴먼허브(Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 실험 재료로 사용하였다. 효능 실험과 세포 독성 측정 시약 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium persulfate, porcine pancreas elastase, Lascorbic acid, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), nsuccinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, collagenase from Clostridiumhistolyticum, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)은 Sigma chemical Co.
세포 배양에 사용되는 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS),penicillin/streptomycin, 0.25% trypsin-EDTA, 0.4% trypan blue stain은 gibco BRL Co. (Grand Island, New York, USA), haemacytometer (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany)를 구입하였다.
Melanin 생성 유발을 위한 human tumor necrosis factor-α with carrier, sterile (TNF-α)는 Cell Signaling사(Danvers, MA,USA)에서 구입하여 사용하였다. 주름 및 항산화활성 측정을 위해 procollagen type I C-peptide kit (Takara Shuzo, Kyoto,Japan)와 ROS-GloTM H2O2 assay kit (Promega, Madison,WI, USA)를 구입하여 사용하였다. Primary antibody인 MMPs및 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2와 secondary antibody는 Santa cruz biotechnology Inc.
효능 실험과 세포 독성 측정 시약 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium persulfate, porcine pancreas elastase, Lascorbic acid, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), nsuccinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, collagenase from Clostridiumhistolyticum, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)은 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance) 프로그램을 이용하여 t-test를 통해 통계적 유의수준 p <0.05에서 검증하였다.
이론/모형
ABTS radical 소거능을 이용한 항산화력 측정은 Re 등 (1999)의 방법을 이용하여 측정하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 2.
Elastase 저해활성은 Cannell 등 (1998)의 방법에 따라 측정하였다. 동일 농도의 시료를 조제하여 40 μL씩 96 well plate에 분주하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.
Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등(1986)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
세포 독성 측정은 Carmichael 등(1987)의 방법에 따라 측정하였다. CCD-986sk cell과 HEM cell을 각각 96 well plate에 1×104, 3×104 cells/well을 분주하고 37 oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
시료의 미백 효과를 검증하기 위해 tyrosinase 저해활성과 western blot을 실시하였다. Tyrosinase는 melanin 생성에 중요한 역할을 하는 효소로 기질인 tyrosine이 tyrosinase에 의해 산화되어 생성되는 melanin의 흡광도를 측정함으로써 시료의 tyrosinase 억제 활성 효과를 검토하는 방법으로 미백 효과 연구에 사용되고 있다(Ko 등, 2012).
성능/효과
CCD-986sk cell에 TW-EA를 농도 별로 처리하여 MMP-1, -2,-9, 13의 활성을 확인하였으며 각 각 100 μg/mL의 농도에서 79,55, 64, 63%의 저해활성을 보여주었다(Fig. 4).
MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 순서로 50 μg/mL의 농도에서 62, 58, 34, 19%의 저해 활성을 나타내었고 positive control인 arbutin은 동일 농도에서 각 각 33, 48, 22, 8%의 억제효과를 보여 TW-EA의 효능이 더 높게 나타났다(Fig. 6).
TW-EA를 농도별로 처리하여 확인한 결과 최고 농도인 100 μg/mL의 농도에서 각 각 89%의 procollagen 합성율을 나타내었다(Fig. 3B).
TW-H, TW-EA, TW-B, TW-W는 100과 1,000 μg/mL의 농도에서 소거활성이 각각 12,93, 68, 60%와 22, 97, 96, 86%로 나타나서 더 높은 소거능을 확인하였고, 분획물 중에서는 TW-EA의 효과가 가장 높게 나타났다(Fig. 2B).
그 결과 CCD-986sk cell은 6.25-100 μg/mL 농도에서는 세포 독성을 확인 할 수 없었고, 200 μg/mL 이상에서 독성이 관찰되었다.
그 결과 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였고 100μg/mL의 농도에서 46.4%의 저해효과를 보여주었다(Fig. 2C)
따라서 탁리산 용매 분획물로 elastase의 억제율을 측정하여 주름억제 활성을 검증하였으며 TW-H, TW-EA, TW-B, TW-W는 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 29, 49, 26, 32%의 억제율을 나타냈고 TW-EA가 용매 분획물 중 가장 높은 저해활성을 보여주었다(Fig. 3A).
기존에 보고된 연구로는 구아바잎 70% 메탄올 추출물의 EA이 1,000 μg/mL에서 65%의 저해활성을 나타내었고(Park과 Onjo 2008), 섬초롱 80% 에탄올 추출물의 EA는 동일한 농도에서 약 25%의 억제효과를 보여주었다(Kim 등, 2012). 반면 탁리산 용매 분획물은 TW-H, TWEA, TW-B, -TW-W이 동일한 농도에서 각각 10, 69, 23, 7%의 저해활성을 나타내었고, 그 중 TW-EA가 가장 우수한 효능을 나타내었다(Fig. 5).
위 실험결과들을 통해 탁리산의 항산화, 주름 억제, 미백 효과를 확인함으로써 복합적인 한방처방의 다중 활성을 통한 피부개선효과를 증명 할 수 있었다. 이는 탁리산의 기능성 화장품 소재로의 개발 가능성을 보여준다고 사료된다.
탁리산 열수추출물의 헥산(TW-H), 에틸아세테이트(TWEA), 부탄올(TW-B), 물(TW-W) 분획물은 100, 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 19, 62, 43, 22%와 33, 92, 90, 83%의 소거능을 나타내었고, 그 중 TW-EA의 효과가 가장 우수했다(Fig. 2A).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
탁리산를 구성하는 약재는 무엇인가?
탁리산은 인삼(人蔘), 황기(黃芪 ), 백작약(白芍藥), 백출(白朮),진피(陳皮), 당귀(當歸), 숙지황(熟地黃), 백복령(白茯), 감초(甘草) 총 9가지 약재로 구성되어있고, 《동의보감(東醫寶鑑)》에서 옹저(癰疽)가 기혈(氣血)이 허하여서 나올 수가 없고 나온 것들도 다시 수렴되며 추운 것을 싫어하고 열(熱)이 나며 기육(肌肉)이 영양을 원활히 받지 못하는 것을 치료하는 데에 쓰던 처방으로 기재되어 있다. 현재까지 연구결과로는 마우스를 이용한 항암효능 연구(Choi 등, 2005), Balb/c 3T3의 증식에 미치는 영향 연구(Eun 등, 1993), 보습 효능에 대한 임상적 연구(Kang 등,2016) 등이 보고되어 있다.
propeptide 생성양이 합성된 collagen 분자의 양을 대변하는 근거는?
CCD-986sk cell에 elastase 억제활성 측정결과 가장 우수한 효능을 나타낸 TW-EA를 이용하여 procollagen의 합성양을 평가하기 위해 PIP EIA kit를 이용하여 free propeptide 생성양을 검출하였다. Collagens는 procollagens이라고 불리는 전구체로 합성되고 이것은 propeptides라고 불리는 펩타이드 서열을 포함하고 있다(Kim 등, 2008b). 따라서 free propeptide의 양은 합성된 collagen 분자의 양을 말한다. TW-EA를 농도별로 처리하여 확인한 결과 최고 농도인 100 μg/mL의 농도에서 각 각 89%의 procollagen 합성율을 나타내었다(Fig.
생체 내 reactive oxygen species (ROS)를 소멸시키는 효소는 무엇인가?
노화의 원인으로써 reactive oxygen species (ROS)를 들 수 있는데 세포 및 조직에서 생성되어 생체 내에 존재하는 superoxidedistimutase (SOD), peroxidase, catalase 등에 의해 대부분 소멸된다. 그러나 ROS가 제대로 제거되지 않을 경우 free radical로인한 산화적 스트레스를 받게 되므로 생체는 노화를 비롯한 각종 질병이 유발 되기도 한다(Karin 등, 2000; Meinhard 2001).
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