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문제 정의
- granule 분비감소는 혈소판 응집 억제 능과 같은 경향치를 나타나는 것이 일반적인 현상으로 받아들여지고 있다. 따라서 본 실험은 상황버섯 메탄올 추출물의 혈소판의 ATP release를 억제효과를 조사 하였다. 혈소판 응집 억제 실험에서 쓰였던 가장 높은 농도의 PLK,PLH, PB 메탄올 추출물 200 ug/ml를 전 처리하고 혈소판응집 유도물질인 ADP (10 uM)를 처리한 후 ATP release를 측정 하였다.
- 본 연구는 국내에서 주로 재배되고 있는 P. baumii 와 P. linteus 자실체의 혈소판 활성에 어떠한 영향을 미치는지는 상대적으로 알려진 바가 적으며, 따라서 본 연구에서 국내 재배종인 간의 혈소판 응집 반응과 혈소판의 활성화에 미치는 영향에 대해 수행한 연구결과를 보고 하는바이다.
제안 방법
- 혈소판을 37oC에서 3분간 200 ug/ml 농도의 PLK, PLH, PB 메탄올 추출물을 전 처리 하고 10 uM Adenosine diphosphate (ADP) )를 가하여 5분간 반응을 유도한 후 원심분리로 상층액을 취하여 분석에 사용하였다. ATP release는 ATP assay kit (Biomedical Research Service Center, Buffalo, USA)를 사용하여 luminometer(GloMax 20/20, Promega, Madison, USA)로 측정하였다. 대조구로서 ATP release 억제 효과가 알려진 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122 (4 uM)와calcium chelator인 Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 1 mM 사용하였다.
- Luciferin-luciferase와 Adenosine triphosphate (ATP)가반응할 때 발생하는 luminescence로 ATP release를 측정하였다. 혈소판을 37oC에서 3분간 200 ug/ml 농도의 PLK, PLH, PB 메탄올 추출물을 전 처리 하고 10 uM Adenosine diphosphate (ADP) )를 가하여 5분간 반응을 유도한 후 원심분리로 상층액을 취하여 분석에 사용하였다.
- linteus HN00k9 (PLH) 자실체의 methanol 추출물의 혈소판 응집 억제효과를 위하여 사용하였다. PB,PLK, PLH methanol 추출물을 전 처리하고 혈소판 응집 촉진물인 collagen (2.5 ug/ml) , ADP (10 uM), thrombin(0.1 U/ml)의 처리에 따른 혈소판 응집억제 효과를 조사하였다. Fig.
- Wu 등 (2012)은 ITS-rDNA염기서열 비교분석에서 아시아에 분포하는 Inonotusbaumii-I. linteus 집단은 6종이 관련되어 있으며 형태적으로 매우 유사하여 채집 기주식물체에 따라 종명을 결정할 것을 제안 하였다. 즉 각 기주체에 따라I.
- 국내 상황버섯 재배 종인 Phellinus baumii (PB, Jangsusanghwang), P. linteus (PLK, Korea Sangwhang), 그리고 P. linteus HN00k9 (PLH) 자실체의 methanol 추출물의 혈소판 응집 억제와 ATP release 감소효과를 조사하였다. PB, PLK, PLH methanol 추출물을 전 처리하고 혈소판응집촉진물인 collagen (2.
- 메탄올 추출액을 회전증발농축기에서 증발시키고 잔존하는 건조물을 회수 하여 0-200 µg/ml의 다양한 농도가 되도록 10% (v/v) DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 제조하였다.
- 상황버섯 메탄올추출물을 농도별로 혈장(108/ml)에 2분간 37oC에서 전처리 하고 혈소판 응집촉진물질 (collagen 2.5 ug/ml, thrombin 0.1 U/ml, ADP (10 uM)를 가하여 250 g로 stirring하면서 5분간 반응시켜 혈소판 응집억제 능을 측정 하였다. 혈소판응집은 Aggregometer (ChronoLog, Havertown, PA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 따라서 본 실험은 상황버섯 메탄올 추출물의 혈소판의 ATP release를 억제효과를 조사 하였다. 혈소판 응집 억제 실험에서 쓰였던 가장 높은 농도의 PLK,PLH, PB 메탄올 추출물 200 ug/ml를 전 처리하고 혈소판응집 유도물질인 ADP (10 uM)를 처리한 후 ATP release를 측정 하였다. ADP를 단독으로 처리 시에는 ATP release가 9 uM까지 상승 하였으나 PLK과 PB 추출물은 ATP release를 2.
- 혈소판응집은 Aggregometer (ChronoLog, Havertown, PA, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈소판 응집억제 활성은 유도된 aggregation (%)을 대조군(A)으로, 상황버섯 메탄올 추출물 처리 후 유도된 aggregation (%)을 실험군(B)으로 하여 다음 계산식에 따라 저해율 (%)로 나타내었다.
- Luciferin-luciferase와 Adenosine triphosphate (ATP)가반응할 때 발생하는 luminescence로 ATP release를 측정하였다. 혈소판을 37oC에서 3분간 200 ug/ml 농도의 PLK, PLH, PB 메탄올 추출물을 전 처리 하고 10 uM Adenosine diphosphate (ADP) )를 가하여 5분간 반응을 유도한 후 원심분리로 상층액을 취하여 분석에 사용하였다. ATP release는 ATP assay kit (Biomedical Research Service Center, Buffalo, USA)를 사용하여 luminometer(GloMax 20/20, Promega, Madison, USA)로 측정하였다.
- 1 U/ml, ADP (10 uM)를 가하여 250 g로 stirring하면서 5분간 반응시켜 혈소판 응집억제 능을 측정 하였다. 혈소판응집은 Aggregometer (ChronoLog, Havertown, PA, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈소판 응집억제 활성은 유도된 aggregation (%)을 대조군(A)으로, 상황버섯 메탄올 추출물 처리 후 유도된 aggregation (%)을 실험군(B)으로 하여 다음 계산식에 따라 저해율 (%)로 나타내었다.
- 혈액 샘플을 170×g에서 7분간 원심분리 하여 상등액의 혈소판 부유혈장( platelet-rich plasma, PRP)를 취하여 120×g에서 7분간 원심 분리하여 적혈구 성분을 제거하였다.
대상 데이터
- baumii (JangsuSangwhang, PB)로부터 생산된 2년산 자실체를 사용하였다. 건조 자실체를 파쇄기로 100 mesh로 분말 화 하였다. 상황버섯분말 10 g을 70% 메탄올 500 ml에 혼합하고 16시간동안 실온에서 150 rpm으로 진탕하면서 추출 하였다.
- 국내재배 종 상황버섯 P. linteus HN1009K (PLH)와 P.linteus (Korea Sanghwang, PLK), P. baumii (JangsuSangwhang, PB)로부터 생산된 2년산 자실체를 사용하였다. 건조 자실체를 파쇄기로 100 mesh로 분말 화 하였다.
- ATP release는 ATP assay kit (Biomedical Research Service Center, Buffalo, USA)를 사용하여 luminometer(GloMax 20/20, Promega, Madison, USA)로 측정하였다. 대조구로서 ATP release 억제 효과가 알려진 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122 (4 uM)와calcium chelator인 Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 1 mM 사용하였다.
- 본 연구는 국내 상황버섯 재배 종인 P. baumii (PB,Jangsu sanghwang), P. linteus (PLK, Korea Sangwhang),그리고 P. linteus HN00k9 (PLH) 자실체의 methanol 추출물의 혈소판 응집 억제효과를 위하여 사용하였다. PB,PLK, PLH methanol 추출물을 전 처리하고 혈소판 응집 촉진물인 collagen (2.
- linteus)은 뽕나무를 기주식물체로 하여 자실체형태가 누런색을 띤다하여 “상황버섯으로 부르게 되었으며. 학술명으로는 목질진흙버섯이다. Wu 등 (2012)은 ITS-rDNA염기서열 비교분석에서 아시아에 분포하는 Inonotusbaumii-I.
성능/효과
- 혈소판 응집 억제 실험에서 쓰였던 가장 높은 농도의 PLK,PLH, PB 메탄올 추출물 200 ug/ml를 전 처리하고 혈소판응집 유도물질인 ADP (10 uM)를 처리한 후 ATP release를 측정 하였다. ADP를 단독으로 처리 시에는 ATP release가 9 uM까지 상승 하였으나 PLK과 PB 추출물은 ATP release를 2.5 uM로 감소 시켜 ADP 무 처리구와 필적하는 효과를 보였으며 PLH 추출물도 ADP로 유도된 혈소판의 ATP release를 절반 이상 감소시켰다 (Fig. 2). 이들 세 가지 추출물의 ATP release 억제 효과는 양성대조구로 사용된 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122(4 uM)나 calcium chelator 인 EDTA (1 mM)보다 더 뛰어난 것으로 나타났다.
- 1 U/ml)의 처리에 따른 혈소판 응집억제 효과를 조사하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 PB 는 collagen, ADP와 thrombin에 의해 유도된 혈소판 응집 반응을 농도 의존적으로 억제시켰으며 50 ug/ml의 농도에서 무처리구에비하여 50% 이상, 100 ug/ml농도에서는 95% 이상의 혈소판응집억제 효과를 보였으며 그 효과는 ADP처리 혈소판에서 가장 강하게 나타났다. PLK 추출물 또한 PB의 혈소판 응집 억제 결과와 같이, collagen, ADP, 그리고 thrombin에 의해 유도된 혈소판 응집 반응을 농도 의존적으로 억제시켰으며 혈소판 응집 억제 효과는 collagen처리 혈소판에서 억제 효과가 가장 높았으나 ADP처리구에서는 다소 약하게 나타났다.
- linteus HN00k9 (PLH) 자실체의 methanol 추출물의 혈소판 응집 억제와 ATP release 감소효과를 조사하였다. PB, PLK, PLH methanol 추출물을 전 처리하고 혈소판응집촉진물인 collagen (2.5 ug/ml), ADP (10 uM),thrombin (0.1 U/ml) 처리에 50ug/ml에서 200 ug/ml 농도에서 50%에서 95%의 혈소판응집억제 효과가 나타났으며 ATP release 감소효과는 200 ug/ml 농도에서 ADP(10 uM) 처리 혈소판에서 60%에서 50%로 나타났으며 이는 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122 (4 uM)과calcium chelator인 EDTA (1 mM)에 비하여 20%이상 높게 나타났다. 본 결과로부터 상황버섯 PB, PLK, PLH 메탄올 추출물은 심혈관계질병을 예방 하는 유용한 소재로 활용 가능 할 것으로 사료 된다.
- 1에서 보는 바와 같이 PB 는 collagen, ADP와 thrombin에 의해 유도된 혈소판 응집 반응을 농도 의존적으로 억제시켰으며 50 ug/ml의 농도에서 무처리구에비하여 50% 이상, 100 ug/ml농도에서는 95% 이상의 혈소판응집억제 효과를 보였으며 그 효과는 ADP처리 혈소판에서 가장 강하게 나타났다. PLK 추출물 또한 PB의 혈소판 응집 억제 결과와 같이, collagen, ADP, 그리고 thrombin에 의해 유도된 혈소판 응집 반응을 농도 의존적으로 억제시켰으며 혈소판 응집 억제 효과는 collagen처리 혈소판에서 억제 효과가 가장 높았으나 ADP처리구에서는 다소 약하게 나타났다. 한편, PLH추출물 200 µg/ml농도에서 collagen처리 혈소판응집을 95% 이상 억제 시켰으나, ADP와 thrombin에 의한 응집의 억제 효과는38%, 56%로 다른 상황버섯 균주보다 혈소판 응집 억제효과가 다소 약하게 나타났다(Fig.
- 이들 세 가지 추출물의 ATP release 억제 효과는 양성대조구로 사용된 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122(4 uM)나 calcium chelator 인 EDTA (1 mM)보다 더 뛰어난 것으로 나타났다. 결과적으로 상황버섯 메탄올 추출물이 혈소판의 ATP release를 억제 시키는 것을 감안할때, 혈소판의 dense granule 분비를 억제시키는 것과 관련이 있다고 사료 되었다.
- Kim 등 (2013)은 표고버섯 자실체 80% 에탄올추출물은 collagen 혈소판응집촉진제처리에 대한 억제효과를 조사한 바 있는데 추출물 5, 10, 25 mg/ml의 농도에서 10%, 35%, 50%의 혈소판응집억제 효과가 있었다고 하였다. 이는 본 연구의처리농도보다 100배 이상의 고 농도 처리로 본 연구의 상황버섯 메탄올 추출물이 보다 높은 혈소판응집억제 효과가 있는 것으로 사료 되었다. 전 연구에서 52종의 버섯류의 균사체들의 물 추출물과 에탄올 추출물에 대한 혈소판억제활성을 조사 한 바 있는데 에탄올 추출물이 2배에서 3배 이상 높았으며 특히 차가버섯 (Inonotus obliquus ASI 74006)에탄올 추출물 처리구에서 81 %이상의 혈소판 억제활성을 나타난다고 하였고 비늘버섯류와 잎새버섯자실체에서 51%와 37%로 다른 버섯류에 비교적 혈소판응집억제효과가 높았다고 하였다 (Park et al.
- 2). 이들 세 가지 추출물의 ATP release 억제 효과는 양성대조구로 사용된 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122(4 uM)나 calcium chelator 인 EDTA (1 mM)보다 더 뛰어난 것으로 나타났다. 결과적으로 상황버섯 메탄올 추출물이 혈소판의 ATP release를 억제 시키는 것을 감안할때, 혈소판의 dense granule 분비를 억제시키는 것과 관련이 있다고 사료 되었다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때에 상황버섯 균주 PLK, PLH, PB의 메탄올 추출물 모두 다 각자 다른 기전으로 혈액을 응집시키는 collagen, ADP, 그리고 thrombin에 의해 유도된 응집을 유의성 있게 농도 의존적으로 억제시켰다. Thrombin과 ADP와 같은 soluble agonist는 Gprotein과 연결된 수용체와 각각 결합하여 phospholipaseCβ를 활성화 시키는 반면, collagen은 glycoprotein 수용체와 결합하여 phospholipase Cγ를 활성화시키는 것을 고려해 볼 때, 여기에서 사용한 세 가지의 추출물은 항 혈소판 효과가 광범위함을 시사 하고 있다.
- 이는 본 연구의처리농도보다 100배 이상의 고 농도 처리로 본 연구의 상황버섯 메탄올 추출물이 보다 높은 혈소판응집억제 효과가 있는 것으로 사료 되었다. 전 연구에서 52종의 버섯류의 균사체들의 물 추출물과 에탄올 추출물에 대한 혈소판억제활성을 조사 한 바 있는데 에탄올 추출물이 2배에서 3배 이상 높았으며 특히 차가버섯 (Inonotus obliquus ASI 74006)에탄올 추출물 처리구에서 81 %이상의 혈소판 억제활성을 나타난다고 하였고 비늘버섯류와 잎새버섯자실체에서 51%와 37%로 다른 버섯류에 비교적 혈소판응집억제효과가 높았다고 하였다 (Park et al., 2003). 그러나, 버섯 추출물의 정량적 처리가 기술되지않아 본 연구의 상활버섯 추출물과의 활성 비교가 불가능 하였다.
- 한편, PLH추출물 200 µg/ml농도에서 collagen처리 혈소판응집을 95% 이상 억제 시켰으나, ADP와 thrombin에 의한 응집의 억제 효과는38%, 56%로 다른 상황버섯 균주보다 혈소판 응집 억제효과가 다소 약하게 나타났다(Fig. 1).
후속연구
- 1 U/ml) 처리에 50ug/ml에서 200 ug/ml 농도에서 50%에서 95%의 혈소판응집억제 효과가 나타났으며 ATP release 감소효과는 200 ug/ml 농도에서 ADP(10 uM) 처리 혈소판에서 60%에서 50%로 나타났으며 이는 Phospholipase C의 inhibitor인 U73122 (4 uM)과calcium chelator인 EDTA (1 mM)에 비하여 20%이상 높게 나타났다. 본 결과로부터 상황버섯 PB, PLK, PLH 메탄올 추출물은 심혈관계질병을 예방 하는 유용한 소재로 활용 가능 할 것으로 사료 된다.
- Thrombin과 ADP와 같은 soluble agonist는 Gprotein과 연결된 수용체와 각각 결합하여 phospholipaseCβ를 활성화 시키는 반면, collagen은 glycoprotein 수용체와 결합하여 phospholipase Cγ를 활성화시키는 것을 고려해 볼 때, 여기에서 사용한 세 가지의 추출물은 항 혈소판 효과가 광범위함을 시사 하고 있다. 본 연구의 상황버섯의 높은 혈소판 응집효과구명을 기반으로 하여 향 후 추출물 내에 잔존 하는 유효물질을 구명하여 새로운 약리 활성 물질 개발을 위한 유용한 기반재료로 활용 할 수 있을 것이다.
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