Real-Time PCR과 Internal Standard Addition법을 이용한 돼지고기 소시지에 혼합된 닭고기의 정량 Use of Real-Time PCR and Internal Standard Addition Method for Identifying Mixed Ratio of Chicken Meat in Sausages원문보기
본 연구는 돼지고기로 제조된 소시지에 저가원료인 닭고기 혼합비율을 정량하기 위해 real-time PCR 법과 소량 함유된 닭의 정량의 정확도를 높이기 위해 닭의 내부 표준물질을 첨가하는 방법을 적용함으로써 소시지의 진위판별 가능성을 제시하였다. DNA 회수율과 PCR 증폭효율을 높이기 위해 QIAamp DNA Micro Kit을 사용하였고, 최종 PCR 반응액 $20{\mu}L$에 template DNA($5{\sim}10ng/{\mu}L$)는 $3.0{\sim}5.0{\mu}L$, primer 농도는 $0.5{\mu}L(10pmol)$, $2{\times}$ Cybrgreen buffer는 $10{\mu}L$로 조정하였을 때 가장 적합하였고, PCR 증폭조건은 annealing 온도를 $62^{\circ}C$, extension 온도를 $68^{\circ}C$, final extension 시간은 33초, 최종 PCR cycle은 40 cycle로 했을 때 가장 PCR 증폭효율이 좋은 것으로 평가되었다. 돼지와 닭의 DNA를 50 ng에서 0.05 ng으로 순차적으로 10배씩 희석한 template DNA를 이용해 민감도(최소 검출한계)를 확인한 결과 돼지와 닭 모두 0.05 ng 이상으로 각각 확인되었다. 표준곡선의 결정계수($R^2$)도 모두 0.995 이상으로 표준곡선의 linearity가 정량에 적합한 것으로 확인되었다. 돼지고기와 닭고기를 각각 70:30 비율로 혼합한 3점의 시료를 $70^{\circ}C$에서 10분간 열처리한 후 정량분석을 실시하여 기대치에 의한 측정치를 비교한 결과, 64.3:35.7의 비율로써 평균 5.7%의 차이를 나타내 생육(raw meat) 또는 가열처리된 시료의 상태에 따라 DNA에 영향을 주어 PCR 증폭효율 및 DNA 정량 값에 일부 영향을 주는 것으로 판단되었다. 소시지에 함유된 돼지고기와 닭고기의 함량을 분석한 결과 돼지고기에 비해 닭고기 함량이 적은 소시지에서는 닭고기(6%, 12%, 25%, 38%)의 검출이 어려웠고, Ct(threshold cycle) 값에 따른 DNA 정량값이 매우 낮아 배합비율을 환산이 어려웠다. 그러나 소시지에 닭의 표준물질 DNA(50 ng)를 첨가함으로써 배합비율이 증가할수록 Ct값도 점차 낮아져서 배합비율을 반영하고 있음에 따라 Ct값의 평균치${\pm}$오차범위 값으로 간접적으로 배합비율을 추정할 수 있을 것으로 생각되었다.
본 연구는 돼지고기로 제조된 소시지에 저가원료인 닭고기 혼합비율을 정량하기 위해 real-time PCR 법과 소량 함유된 닭의 정량의 정확도를 높이기 위해 닭의 내부 표준물질을 첨가하는 방법을 적용함으로써 소시지의 진위판별 가능성을 제시하였다. DNA 회수율과 PCR 증폭효율을 높이기 위해 QIAamp DNA Micro Kit을 사용하였고, 최종 PCR 반응액 $20{\mu}L$에 template DNA($5{\sim}10ng/{\mu}L$)는 $3.0{\sim}5.0{\mu}L$, primer 농도는 $0.5{\mu}L(10pmol)$, $2{\times}$ Cybrgreen buffer는 $10{\mu}L$로 조정하였을 때 가장 적합하였고, PCR 증폭조건은 annealing 온도를 $62^{\circ}C$, extension 온도를 $68^{\circ}C$, final extension 시간은 33초, 최종 PCR cycle은 40 cycle로 했을 때 가장 PCR 증폭효율이 좋은 것으로 평가되었다. 돼지와 닭의 DNA를 50 ng에서 0.05 ng으로 순차적으로 10배씩 희석한 template DNA를 이용해 민감도(최소 검출한계)를 확인한 결과 돼지와 닭 모두 0.05 ng 이상으로 각각 확인되었다. 표준곡선의 결정계수($R^2$)도 모두 0.995 이상으로 표준곡선의 linearity가 정량에 적합한 것으로 확인되었다. 돼지고기와 닭고기를 각각 70:30 비율로 혼합한 3점의 시료를 $70^{\circ}C$에서 10분간 열처리한 후 정량분석을 실시하여 기대치에 의한 측정치를 비교한 결과, 64.3:35.7의 비율로써 평균 5.7%의 차이를 나타내 생육(raw meat) 또는 가열처리된 시료의 상태에 따라 DNA에 영향을 주어 PCR 증폭효율 및 DNA 정량 값에 일부 영향을 주는 것으로 판단되었다. 소시지에 함유된 돼지고기와 닭고기의 함량을 분석한 결과 돼지고기에 비해 닭고기 함량이 적은 소시지에서는 닭고기(6%, 12%, 25%, 38%)의 검출이 어려웠고, Ct(threshold cycle) 값에 따른 DNA 정량값이 매우 낮아 배합비율을 환산이 어려웠다. 그러나 소시지에 닭의 표준물질 DNA(50 ng)를 첨가함으로써 배합비율이 증가할수록 Ct값도 점차 낮아져서 배합비율을 반영하고 있음에 따라 Ct값의 평균치${\pm}$오차범위 값으로 간접적으로 배합비율을 추정할 수 있을 것으로 생각되었다.
This study examined how much chicken meat was in sausage made with pork. Both real-time polymerase chain reaction (PCR) and internal standard addition were used. Fifty ng of chicken DNA was added to the sausages as an internal standard. The addition of standard DNA increased the amplification effici...
This study examined how much chicken meat was in sausage made with pork. Both real-time polymerase chain reaction (PCR) and internal standard addition were used. Fifty ng of chicken DNA was added to the sausages as an internal standard. The addition of standard DNA increased the amplification efficiency of PCR and confirmed the possibility of quantitative analysis. A QIAamp DNA Micro Kit was used to improve the DNA recovery and amplification efficiency. The density of template DNA and primer were suitable for $3.0{\sim}5.0{\mu}L$ and $0.5{\mu}L$, respectively. Each DNA of pig and chicken was diluted in 10-fold from steps 50 ng to 0.05 ng. The detection limit of both pig and chicken meat was more than 0.05 ng and the correlation coefficient of the standard curve was at least 0.98. The result of the quantitative analysis after heat treatment of 3 samples of pigs and chickens mixed at 70:30 showed a 5.7% difference (64.3:35.7) between the expected value and measured value. The quantitative value was changed by affecting the DNA according to the heat treatment ($70^{\circ}C$, 10 min). An analysis of the pork and chicken content in sausages showed that it was difficult to detect chicken meat and the quantitative value of DNA according to the Ct value was very low. On the other hand, when adding standard material (50 ng of chicken DNA) to the sausages, the Ct value decreased gradually with increasing chicken mixing ratio. Thus, the mixing ratio of chicken in sausages could be estimated.
This study examined how much chicken meat was in sausage made with pork. Both real-time polymerase chain reaction (PCR) and internal standard addition were used. Fifty ng of chicken DNA was added to the sausages as an internal standard. The addition of standard DNA increased the amplification efficiency of PCR and confirmed the possibility of quantitative analysis. A QIAamp DNA Micro Kit was used to improve the DNA recovery and amplification efficiency. The density of template DNA and primer were suitable for $3.0{\sim}5.0{\mu}L$ and $0.5{\mu}L$, respectively. Each DNA of pig and chicken was diluted in 10-fold from steps 50 ng to 0.05 ng. The detection limit of both pig and chicken meat was more than 0.05 ng and the correlation coefficient of the standard curve was at least 0.98. The result of the quantitative analysis after heat treatment of 3 samples of pigs and chickens mixed at 70:30 showed a 5.7% difference (64.3:35.7) between the expected value and measured value. The quantitative value was changed by affecting the DNA according to the heat treatment ($70^{\circ}C$, 10 min). An analysis of the pork and chicken content in sausages showed that it was difficult to detect chicken meat and the quantitative value of DNA according to the Ct value was very low. On the other hand, when adding standard material (50 ng of chicken DNA) to the sausages, the Ct value decreased gradually with increasing chicken mixing ratio. Thus, the mixing ratio of chicken in sausages could be estimated.
그러나 아직 실제 가공식품을 적용한 정량분석은 DNA 농도, 순도 및 PCR 증폭효율 등 기술적 한계로 인해 현재까지 초기 연구에 머물고 있는 실정이다. 본 연구에서는 돼지고기 위주로 제조된 소시지에 저가 원료인 닭고기의 혼합 여부를 판별하기 위한 real-time PCR 정량법과 internal standard addition법을 적용하였으며, 향후 닭고기 외의 타 원료에 대한 정량분석의 기초자료를 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
표준 DNA를 일정한 비율로 혼합하였을 때 혼합비율에 따라 DNA 정량의 차이를 확인하기 위해 돼지고기와 닭고기의 조직에서 추출한 DNA 농도를 20 ng/μL가 되도록 조정한 후, 닭과 돼지의 혼합비율이 각각 100%+0%, 50%+50%, 30%+70%, 10%+90% 및 0%+100%가 되도록 인위적으로 혼합하여 정량분석을 실시하였다(Table 7). 돼지고기와 닭고기의 DNA를 혼합하지 않았을 경우 Ct값은 전혀 검출되지 않았다.
대상 데이터
DNA 회수율을 비교하기 위한 가공되지 않은 표준시료(생육)로서 돼지고기와 닭고기는 식재료 마트에서 조직시료를 각각 구입하여 사용하였다. 소시지 제조용 돼지고기(후지)와 돈지는 SK 축산(Nonsan, Korea)에서, 계육은 하림(Iksan, Korea)에서 구매하였으며 첨가물은 비에치푸드(주)(Gunpo, Korea)를 통해 구입하였다.
데이터처리
결과의 신뢰성을 높이기 위해 3반복 실험을 실시하였다. 통계처리는 각 항목에 따른 실험 결과를 SPSS 프로그램(IBM SPSS Statistics 20, Chicago,IL, USA)을 이용하여 처리하였으며 DNA 농도에 따른 민감도는 일원배치 분산분석으로 처리하였고, P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 시료 간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
혼합비율의 계산은 Drummond 등(31)이 보고한 산출계산식을 근거로 하여 산출하였다.
성능/효과
48이었다. Ct값을 이용한 표준곡선의결정계수(R2)는 돼지고기 0.999, 닭고기는 0.995로 나타나 표준곡선의 linearity가 매우 정량에 적합하였다(Fig. 3).
닭과 돼지의 DNA 정량값은 닭은 93, 52, 23 및 8이었고 돼지는 46, 66, 88 및 98로 확인되었다. DNA 정량값으로 혼합비율에 따른 측정치를 산출하여 기대치와 비교한 결과, 닭의 기대치(100%, 50%, 30%, 10%)와 측정치(100%, 53%, 26%, 8%) 간에는 각각 2~4%의 차이만 있었고, 돼지의 기대치(50%, 70%, 90%, 100%)와 측정치(47%, 74%, 92%, 100%) 간에는 2~4%의 차이만 보여 DNA 혼합비율에 의한 정량분석이 가능한 것으로 확인되었다.
16으로 측정되었다면 닭고기가 약 6% 정도 배합된 기준으로 예상할 수 있으며, 마찬가지로 다른 닭고기 함량도 Ct값에 의한 표준편차를 고려하여 배합비율의 추정이 가능하다고 할 수 있다. 따라서 표준 DNA를 추가했을 때 닭의 함량이 증가할수록 Ct값의 추세선도 전체적으로 낮아져 서로 차이를 보임에 따라 Ct값을 근거로 닭의 배합비율 산출이 가능할 것으로 보인다(Fig. 4). 그러나 이와 같은 경우 Ct값을 기준으로 원료육 함량의 확인이 가능하나,Ha(39)에 의하면 real-time PCR은 cycle이 진행됨에 따라 DNA는 지수적으로 증가하며 이론적으로 DNA 간 10배 차이가 있을 때 약 3.
35 정도 느린 증폭효율을 보였다. 이러한 결과로 볼 때 생육(raw meat) 또는 가열처리된 시료의 상태에 따라 DNA에 영향을 주어 PCR 증폭효율 및 DNA 정량값에 영향을 주는 것으로 판단되었다. 사골 추출 가공품의 유전자추출에서도 발효나 숙성 단계가 고유의 유전자를 많이 손실하는 결과가 나타났다고 하였으며(36), 고추다대기가 혼입된 불량 고춧가루에 대한 판별에서도 가공과정을 거치면서 첨가된 식품에 존재하는 PCR 저해물질이 PCR에 미치는 영향이 매우 크고 실제로 식품은 다양한 매트릭스를 가지고 있어 가공과정 중 주형유전자의 파괴가 일어나기 때문이라고 하였다(14).
후속연구
Real-time PCR의 정량능력과 정확성은 DNA 추출량에 영향을 미치는 인자인 세포마다 DNA의 양에 따라 영향을 주기 때문에 이러한 문제를 해결하기 위해서는 유전자를 추출하는 처리과정을 동일한 조건으로 고정하여 유전자의 양을 일정하게 얻어야 하지만 실질적인 측면에서 실현 가능성이 매우 낮을 수 있다. 또한, 가공식품에서의 real-time PCR을 통한 정량분석 시 전체적으로 사용된 원료보다 낮게 나타나는 경향을 보였다고 알려져 있어 향후 추가적인 연구를 통한 보완이 더 필요하다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
기존 PCR과 비교해서 real-time PCR이 선호되고 있는 추세는 무엇인가?
최근 PCR과 분광형광광도계를 일체화시킨 real-time PCR 기술이 개발되었다(23). 기존 PCR은 증폭을 수행한 후 전기영동으로 확인이 필요한 반면, real-time PCR은 이러한 과정이 없이도 증폭되는 과정마다 증폭산물의 양을 실시간 측정 및 확인할 수 있어 신속･간편하게 분석 결과를 얻을 수 있고, 오염의 위험이 낮아 real-time PCR을 많이 선호하고 있는 추세이다(24). Ct(threshold cycle)값의 비교로 정량분석을 실시하는 real-time PCR은 초기 DNA 양이 많을수록 증폭곡선이 빨리 나타나고 단계적으로 희석한 표준시료에 대해 증폭 곡선을 얻게 된다.
PCR을 이용한 DNA 검출법의 특징은 무엇인가?
1990년대 이후 분자생물학의 급속한 발달로 생물종이 가지고 있는 고유한 유전자 정보를 분석하는 분자유전학적 기법이 식육에 도입되면서 종 특이적 DNA 염기서열 차이로 인한 종판별이 가능해져 종래 단백질 수준에서의 한계점을 극복할 수 있는 계기가 되었다. 특히 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 DNA 검출법은 시료로부터 극소량의 DNA를 추출한 후, 종 특이적 프라이머(species specific primer)를 사용해 원하는 부위의 특정 유전자를 단 시간 내에 증폭할 수 있어 국내외적으로 동식물의 유전분석 및 종판별 등에 다양하게 활용되어 왔다(12-19). 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR 검출법은 종간 또는 종내에 따라 특이성이 높은 DNA 염기서열만을 탐색한 후 이 부위를 프라이머로 설계 및 합성하고, 시료로부터 충분한 DNA만 확보하면 검출이 가능하다(20,21).
종 특이적 단백질을 검출하는 방법에는 무엇이 있는가?
이종 혼합식품 또는 가짜식품 등을 가공하거나 처리하였을 경우 외관이나 관능적 방법으로는 원재료의 판별이 거의 불가능하기 때문에 원재료의 정확한 표시와 소비자들의 신뢰성을 확보하기 위해서는 이를 객관적으로 검증할 수 있는 과학적인 판별기술이 매우 필요하다. 그동안 식육 및 원재료의 다양화 및 세분화로 이들 종을 판별할 수 있는 기술로서 면역효소측정법(4,5), 크로마토그래피(6), 등전점 전기영동법(7) 및 GC, LC, HPLC(8,9) 등을 이용한 다양한 방법들이 시도되어 왔다. 그러나 이들 방법들은 단백질 조성 및 구조적 차이에 의한 종 특이적 단백질(species-specific protein)을 검출하는 방법으로써 이종 간의 식별은 가능하나 동종 간의 판정은 사실상 불가능하였다.
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