식물의 유일한 활성 스테로이드 호르몬인 Brassinosteroid (BR)는 다양한 내재적 또는 외부 신호 전달 경로와의 통합적인 결합을 통해 식물의 생장 및 발달 과정에서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 식물학 연구들은 종자의 발아와 초기 발달과정에서 BR과 ABA 사이의 필수적인 상호작용 메커니즘이 존재하고 있음을 보고하고 있다. 하지만 이들 두 호르몬의 중요한 신호전달 상호작용에 대한 분자 메커니즘은 거의 알려지지 않았다. 식물의 초기 발달과정에서 BR에 의해 매개되는 ABA 신호전달과의 기능학적, 생물학적 상호작용 네트워크를 이해하기 위해 Agilent Arabidopsis $4{\times}44K$ 올리고 칩을 사용하여 비교 전사체 분석을 수행하였다. ABA에 반응하지 않는 bes1-D 돌연변이체에서의 ABA 처리에 따른 다양한 유전자의 발현 패턴을 야생형 식물과 비교 분석하였다. 그 결과 발현의 변화가 발생하는 유전자(DEGs) 2,353개를 확인하였다. GO 분석을 통해 ABA 신호전달 및 대사에 관여하는 유전자들이 BR 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라, BR 신호전달 경로는 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스, 오옥신 및 ROS 등 다양한 신호전달 체계와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 BR 신호전달의 활성화는 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 억제함을 확인하였다. 또한 본 연구는 다양한 신호 경로 사이의 상호작용이 다양한 환경요인에 대한 식물의 적응 반응에 중요하게 작용할 수 있음을 보여주고 있다.
식물의 유일한 활성 스테로이드 호르몬인 Brassinosteroid (BR)는 다양한 내재적 또는 외부 신호 전달 경로와의 통합적인 결합을 통해 식물의 생장 및 발달 과정에서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 식물학 연구들은 종자의 발아와 초기 발달과정에서 BR과 ABA 사이의 필수적인 상호작용 메커니즘이 존재하고 있음을 보고하고 있다. 하지만 이들 두 호르몬의 중요한 신호전달 상호작용에 대한 분자 메커니즘은 거의 알려지지 않았다. 식물의 초기 발달과정에서 BR에 의해 매개되는 ABA 신호전달과의 기능학적, 생물학적 상호작용 네트워크를 이해하기 위해 Agilent Arabidopsis $4{\times}44K$ 올리고 칩을 사용하여 비교 전사체 분석을 수행하였다. ABA에 반응하지 않는 bes1-D 돌연변이체에서의 ABA 처리에 따른 다양한 유전자의 발현 패턴을 야생형 식물과 비교 분석하였다. 그 결과 발현의 변화가 발생하는 유전자(DEGs) 2,353개를 확인하였다. GO 분석을 통해 ABA 신호전달 및 대사에 관여하는 유전자들이 BR 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라, BR 신호전달 경로는 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스, 오옥신 및 ROS 등 다양한 신호전달 체계와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 BR 신호전달의 활성화는 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 억제함을 확인하였다. 또한 본 연구는 다양한 신호 경로 사이의 상호작용이 다양한 환경요인에 대한 식물의 적응 반응에 중요하게 작용할 수 있음을 보여주고 있다.
Brassinosteroid (BR), a plant steroid hormone, plays a critical role in the growth and developmental processes through its canonical signaling and crosstalk with various internal and external signaling pathways. Recent studies have revealed the essential interplay mechanisms between BR and ABA durin...
Brassinosteroid (BR), a plant steroid hormone, plays a critical role in the growth and developmental processes through its canonical signaling and crosstalk with various internal and external signaling pathways. Recent studies have revealed the essential interplay mechanisms between BR and ABA during seed germination and early seedling establishment. However, molecular mechanisms for this important signaling crosstalk are largely unknown. To understand the crosstalk between BR-mediated signaling pathways and ABA functions during early seedling development, we carried out a comparative genome-wide transcriptome analysis with an Agilent Arabidopsis $4{\times}44K$ oligo chip. We selected and compared the expression patterns of ABA response genes in ABA-insensitive bes1-D mutant with wild type seedlings on which ABA was exogenously applied. As a result, we identified 2,353 significant differentially expressed genes (DEGs) in ABA-treated bes1-D and wild type seedlings. GO enrichment analysis revealed that ABA signaling, response, and metabolism were critically down-regulated by BR-activated signaling pathways. In addition, the genome-wide transcriptome analysis data revealed that BR-regulated signaling pathways were tightly connected to diverse signal cues including abiotic/biotic stress, auxin, ROS etc. In this study, we newly identified the molecular mechanisms of BR-mediated repression of ABA signaling outputs. Also, our data suggest that interplay among diverse signaling pathways is critical for the adaptive response of the plant to various environmental factors.
Brassinosteroid (BR), a plant steroid hormone, plays a critical role in the growth and developmental processes through its canonical signaling and crosstalk with various internal and external signaling pathways. Recent studies have revealed the essential interplay mechanisms between BR and ABA during seed germination and early seedling establishment. However, molecular mechanisms for this important signaling crosstalk are largely unknown. To understand the crosstalk between BR-mediated signaling pathways and ABA functions during early seedling development, we carried out a comparative genome-wide transcriptome analysis with an Agilent Arabidopsis $4{\times}44K$ oligo chip. We selected and compared the expression patterns of ABA response genes in ABA-insensitive bes1-D mutant with wild type seedlings on which ABA was exogenously applied. As a result, we identified 2,353 significant differentially expressed genes (DEGs) in ABA-treated bes1-D and wild type seedlings. GO enrichment analysis revealed that ABA signaling, response, and metabolism were critically down-regulated by BR-activated signaling pathways. In addition, the genome-wide transcriptome analysis data revealed that BR-regulated signaling pathways were tightly connected to diverse signal cues including abiotic/biotic stress, auxin, ROS etc. In this study, we newly identified the molecular mechanisms of BR-mediated repression of ABA signaling outputs. Also, our data suggest that interplay among diverse signaling pathways is critical for the adaptive response of the plant to various environmental factors.
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문제 정의
브라시노스테로이드 활성이 일어난 상태에서 ABA 처리에 따른 다양한 발현 차이를 보인 2,353개 유전자들을 동정하고, 이들 유전자들의 Gene Ontology 분석을 통해 다양한 ABA 신호전달 및 합성에 관여 하는 유전자들이 브라시노스테로이드 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 따라서 종자발아와 유식물 발달단계에서 브라시노스테로이드 신호전달이 어떻게 ABA 반응을 억제하게 되는지에 대해 전사체레벨에서 해석하고 다양한 외부환경 요인에 대한 식물의 반응에 대해 분자적 접근에 대해 고찰하였다.
제안 방법
식물의 초기 발달과정에서 BR에 의해 매개되는 ABA 신호전달과의 기능학적, 생물학적 상호작용 네트워크를 이해하기 위해 Agilent Arabidopsis 4 x 44K 올리고 칩을 사용하여 비교 전사체 분석을 수행하였다. ABA에 반응하지 않는 bes1-D 돌연변이체에서의 ABA 처리에 따른 다양한 유전자의 발현 패턴을 야생형 식물과 비교분석하였다. 그 결과 발현의 변화가 발생하는 유전자(DEGs) 2,353 개를 확인하였다.
본 실험 결과로 부터 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 활성화되는 BES1 전사인자는 다양한 유전자의 발현을 조절하여 ABA 활성도를 억제한다고 할 수 있다. BES1에 의해서 조절되는 전사체 발현패턴을 조사하기 위해 microarray 분석을 실시하였다. 브라시노스테로이드 활성이 있는 bes1-D와 야생형 En-2 유식물에 ABA를 처리 후, RNA를 추출하여 Microarray로 분석한 결과 통계적으로 유의성이 나타나는 p-value가 0.
이들 779 유전자들로 부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment analysis 분석을 수행하였다. GO 분석을 통해 브라시노스테 로이드 신호전달에 의해 조절되는 네트워크와 이들 신호에 의해 특이적으로 조절되는 ABA 활성억제 기작을 확인하기 위해 총 5가지로 구분을 지어 그 특성을 조사하였다(Fig. 2B). 먼저 En-2와 bes1-D에서 ABA 처리에 따라 공통으로 증가되는 유전자들은 ABA, 지질 등 2차 대사산물 합성과 신호전달에 관여하는 유전자들로 나타났다.
2000). Gene Ontology Consortium website (http://geneontology.org/page/goenrichment-analysis)에서 제공하는 프로그램을 이용하여 biological process, molecular function 및 cellular component에 해당하는카테고리를 분리하였다(Supek et al. 2011). GO-Slim 카테고리는 TAIR database (https://www.
Microarray 분석을 통해 얻어진 2,353개의 DEGs (p<0.05, 1.5 fold change)으로부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment 분석을 수행하였다(Ashburner et al. 2000).
Total RNA를 이용하여 Microarray 분석에 이용하였다. Real-time quantitative PCR을 수행하기 위해 Oligo (dT) primer를 사용한 cDNA를 합성하였다. cDNA는 1st strand synthesis KIT (Enzynomics, Korea)를 이용하여 합성하 였다.
Threshold cycle (Ct) 값에 의한 발현량 분석은 2 −ΔΔCt 으로 계산 하였으며, ΔΔCt은 처리식물체의(Ct target gene−Ct actin gene) – 대조식물체의 (Ct target gene− Ct actin gene)에 의해 계산하여 수치화 하였다 (Livak and Schmittgen 2001).
분리된 total RNA는 MS 3000 Nano-drop (Bio-red, USA)으로 농도를 측정하여 공시하였다. Total RNA를 이용하여 Microarray 분석에 이용하였다. Real-time quantitative PCR을 수행하기 위해 Oligo (dT) primer를 사용한 cDNA를 합성하였다.
Total RNA의 2 ㎍을 이용하였으며, 합성 조건은 50°C에서 60분 동안 반응시킨 후 1분간 얼음에 냉각시켜 first strand cDNA 합성을 완성하였다. qRT-PCR 분석은 cDNA를 사용하여 SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Quant Studio 3 (Applied Biosystem, USA) 장비를 사용하여 장치에서 권장하는 방법에 의해 수행하였다. Threshold cycle (Ct) 값에 의한 발현량 분석은 2 −ΔΔCt 으로 계산 하였으며, ΔΔCt은 처리식물체의(Ct target gene−Ct actin gene) – 대조식물체의 (Ct target gene− Ct actin gene)에 의해 계산하여 수치화 하였다 (Livak and Schmittgen 2001).
따라서 본 연구에서는 모델식물 애기장대 bes1-D 돌연변 이체와 야생형 En-2에 ABA 처리 후, microarray 분석을 통해 전사체 발현패턴을 살펴보았다. 브라시노스테로이드 활성이 일어난 상태에서 ABA 처리에 따른 다양한 발현 차이를 보인 2,353개 유전자들을 동정하고, 이들 유전자들의 Gene Ontology 분석을 통해 다양한 ABA 신호전달 및 합성에 관여 하는 유전자들이 브라시노스테로이드 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다.
2016). 본 연구는 최근 발달하고 있는 시스템 생물학적 연구기법 중 microarray 분석을 통해 ABA에 대한 반응성에 변화가 발생한 돌연변이체에서 일어나는 유전자들의 발현 양상을 조사하고, 기능학적 분류를 통해 유전자들의 그룹을 형성할 수 있는 gene enrichment analysis 기법이 ontology 분석을 통해 그 원인을 분석하였다. 이러한 연구기법을 통해 브라시노스테로이드 신호전달이 활성화되어 있는 bes1-D 식물체의 경우 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 직간접적으로 억제함으로써 정상적인 ABA 반응성을 보이지 못하게 하고 있다는 사실을 구명하였다.
브라시노스테로이드 신호전달에 의한 ABA 활성도의 억제가 두 전사인자 BES1과 BZR1 경로를 통해 이루어졌는지 확인하기 위해 애기장대 En-2, bes1-D 계통(Yin et al, 2002) 및 Col-0, bzr1-1D, dwf4-D (Wang et al, 2002)계통을 이용하여 ABA처리에 따른 발아율을 조사하였다(Fig. 1). 브라시노스 테로이드 합성이 증대되어 신호전달이 활성화되고 있는 dwf4-D 식물체의 경우, 야생형 Col-0에 비해 발아율이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
하지만이들 두 호르몬의 중요한 신호전달 상호작용에 대한 분자 메커니즘은 거의 알려지지 않았다. 식물의 초기 발달과정에서 BR에 의해 매개되는 ABA 신호전달과의 기능학적, 생물학적 상호작용 네트워크를 이해하기 위해 Agilent Arabidopsis 4 x 44K 올리고 칩을 사용하여 비교 전사체 분석을 수행하였다. ABA에 반응하지 않는 bes1-D 돌연변이체에서의 ABA 처리에 따른 다양한 유전자의 발현 패턴을 야생형 식물과 비교분석하였다.
애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형 En-2, bes1-D 식물에 ABA를 처리에 따른 전사체분석을 위해 1시간 동안 ABA를처리한 식물들을 독립적으로 3반복씩 수행하여 총 6종류의 식물 샘플에서 RNA를 추출한 후, microarray 분석을 수행하 였다. ABA를 처리하지 않은 En-2와 bes1-D 샘플의 마이크로 어레이 분석은 선행연구(Kim et al.
org)에서 제공되는 데이터를 이용하였다. 유전자의 이름은 TAIR database를 이용하여 결정하였다.
2A). 이들 779 유전자들로 부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment analysis 분석을 수행하였다. GO 분석을 통해 브라시노스테 로이드 신호전달에 의해 조절되는 네트워크와 이들 신호에 의해 특이적으로 조절되는 ABA 활성억제 기작을 확인하기 위해 총 5가지로 구분을 지어 그 특성을 조사하였다(Fig.
이러한 유전자들은 ABFs, ABI5, PP2C, Myb, PYR 등 ABA 신호 전달에 관여하는 유전자들이 대거 포함되어 있음을 확인할수 있었다. 이러한 발현패턴에 차이를 보이는 유전자들 중에서 bes1-D 돌연변이체에서 ABA 처리시, 그 발현량이 감소또는 증가되는 유전자들 만을 추출하였다(Fig. 3B). 이들 유전자들은 ABA 반응성 유전자들 (5PTASE11, SKOR, ERD14, AtMYB74/112, ANAC072, OCP3, BLH1, AKT2, COR13)이었다.
이를 확인하기 위해 각 패턴별 특이성을 보이는 Gene Ontology에 포함된 유전자들을 추출하여 표시하였다(Fig. 3A). 이러한 유전자들은 ABFs, ABI5, PP2C, Myb, PYR 등 ABA 신호 전달에 관여하는 유전자들이 대거 포함되어 있음을 확인할수 있었다.
이러한 결과 전체 적인 ABA 신호전달의 활성이 약해지면서 종자의 발아 및 유식물의 발달을 촉진시키는 것으로 예측된다. 전사인자의 활성도가 항상 증가 되어져 있는 bes1-D 유식물에서 ABA 신호 전달의 활성이 실제로 약하게 나타나는지 여부를 마이크로 어레이와 Real-time q-PCR을 통해 확인하였다(Fig. 4). 식물 종자의 발아와 유식물의 발달 시 비생물학적 스트레스 환경이 주어지게 되면 ABA의 합성이 증가되고, 신호전달의 활성이 증대되면서 전사인자 ABI3, ABI4의 활성도 증가와 그하위 전사조절인자 ABI5, ABF1-4 (ABFs)의 발현이 급격하게 증대되는 것으로 알려져 있다(Kim et al.
대상 데이터
2011). GO-Slim 카테고리는 TAIR database (https://www.arabidopsis.org)에서 제공되는 데이터를 이용하였다. 유전자의 이름은 TAIR database를 이용하여 결정하였다.
본 연구를 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형 ecotype En-2와 EMS 돌연변이 유도원을 통해 동정된 브라시노스테 로이드 활성 돌연변이 bes1-D 식물(Yin et al. 2002)을 B5액체 배지에 파종 후 5일된 유식물을 실험에 사용하였다. 준비된 유식물에 1 µM 농도의 ABA를 1시간 처리 후 샘플링을 하였다.
데이터처리
5 µM 농도의 ABA가 첨부된 B5 배지에 100개의 종자를 심어 발아율을 측정하였다. 독립적으로 3번의 실험을 통해 얻을 결과를 이용하여 통계처리를 하였다.
0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용하여 각 spot의 nomalization을 수행하였다. 분석 프로그램은 Agilent GeneSpringGX 7.3을 사용하였으며, Hybridization은 각각 3 반복으로 수행되었다. Microarray 분석 데이터 및 raw data는 농업생명공학정보센터(NABIC, http://nabic.
그러나 bes1-D에서의 ABA 처리에 따른 이들 ABI3, ABI4, ABI5, ABFs들의 발현은 약 1 ~ 8 배정도로 야생형 En-2에서 나타나는 발현량의 변화에 비해 확연히 적게 나타남을 알 수 있었다. 이들 ABI3, ABI4, ABI5, ABFs들의 발현은 ABA 반응성과 직접적인 연관성이 있기 때문에, real time quantitative PCR을 통해 이들 발현량의 변화를 조사하고 마이크로어레이 분석결과와 비교분석 하였다(Fig. 4B). RT-PCR 을 통해 확인된 이들 유전자들의 발현양상은 microarray 분석을 통해 확인된 발현 양상과 비슷하게 나타남을 확인 할 수있었다.
타겟 probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였 으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Arabidopsis 4 x 44K Oligo microarray을 사용하여 hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용하여 각 spot의 nomalization을 수행하였다.
이론/모형
애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형 En-2, bes1-D 식물에 ABA를 처리에 따른 전사체분석을 위해 1시간 동안 ABA를처리한 식물들을 독립적으로 3반복씩 수행하여 총 6종류의 식물 샘플에서 RNA를 추출한 후, microarray 분석을 수행하 였다. ABA를 처리하지 않은 En-2와 bes1-D 샘플의 마이크로 어레이 분석은 선행연구(Kim et al. 2016)의 결과를 활용하였다. 타겟 probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였 으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Arabidopsis 4 x 44K Oligo microarray을 사용하여 hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.
준비된 유식물에 1 µM 농도의 ABA를 1시간 처리 후 샘플링을 하였다. Total RNA 분리는 Total RNA extraction kit (Intron Biotech. Korea)를 이용하여 제공된 실험 방법에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA는 MS 3000 Nano-drop (Bio-red, USA)으로 농도를 측정하여 공시하였다.
성능/효과
Fig. 4A에서 볼 수 있듯이 마이크로어 레이 결과에서 ABA 신호전달의 주요 전사인자 ABI3와 ABI4 의 발현이 처리하지 않은 샘플에 비해 약 2배정도 증가하였 고, 이들에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 하위 전사 인자 ABI5, ABFs들은 3 ~ 15배 정도 증가되어져 있음을 확인 하였다(Fig. 4A). 그러나 bes1-D에서의 ABA 처리에 따른 이들 ABI3, ABI4, ABI5, ABFs들의 발현은 약 1 ~ 8 배정도로 야생형 En-2에서 나타나는 발현량의 변화에 비해 확연히 적게 나타남을 알 수 있었다.
RT-PCR 을 통해 확인된 이들 유전자들의 발현양상은 microarray 분석을 통해 확인된 발현 양상과 비슷하게 나타남을 확인 할 수있었다. ABA 처리시 En-2에서 ABI4의 발현이 증가되는 것이 확인되지 않았지만, 약 1.5배 정도의 ABI3 발현 증가와 그 하위 ABI5, ABFs 들의 발현증가가 확인되었다(Fig 4B). 마이크 로어레이 분석결과와 비슷하게 bes1-D 유식물에서 ABA 처리전 또는 처리후에 따른 이들 전사인자들의 발현량이 현저히 감소되어 있음을 확인 할 수 있었다.
그 결과 발현의 변화가 발생하는 유전자(DEGs) 2,353 개를 확인하였다. GO 분석을 통해 ABA 신호전달 및 대사에 관여하는 유전자들이 BR 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라, BR 신호전달 경로는 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스, 오옥신 및 ROS 등 다양한 신호전달 체계와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다.
4B). RT-PCR 을 통해 확인된 이들 유전자들의 발현양상은 microarray 분석을 통해 확인된 발현 양상과 비슷하게 나타남을 확인 할 수있었다. ABA 처리시 En-2에서 ABI4의 발현이 증가되는 것이 확인되지 않았지만, 약 1.
ABA에 반응하지 않는 bes1-D 돌연변이체에서의 ABA 처리에 따른 다양한 유전자의 발현 패턴을 야생형 식물과 비교분석하였다. 그 결과 발현의 변화가 발생하는 유전자(DEGs) 2,353 개를 확인하였다. GO 분석을 통해 ABA 신호전달 및 대사에 관여하는 유전자들이 BR 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다.
4A). 그러나 bes1-D에서의 ABA 처리에 따른 이들 ABI3, ABI4, ABI5, ABFs들의 발현은 약 1 ~ 8 배정도로 야생형 En-2에서 나타나는 발현량의 변화에 비해 확연히 적게 나타남을 알 수 있었다. 이들 ABI3, ABI4, ABI5, ABFs들의 발현은 ABA 반응성과 직접적인 연관성이 있기 때문에, real time quantitative PCR을 통해 이들 발현량의 변화를 조사하고 마이크로어레이 분석결과와 비교분석 하였다(Fig.
1A, 1B). 또한 ABA에 의해 억제되는 유식물의 발달이 bes1-D와 dWf4-D 식물체에서는 완벽하게 회복되었다(Fig. 1A). 이들 결과로부터 브라시 노스테로이드 신호전달과정상의 최하위 전사인자 BES1 경로를 통해 특이적으로 ABA 활성이 억제되고 있는 두 호르몬의 상호작용이 일어났다고 할 수 있다.
본 연구를 통해 BR 신호전달의 활성화는 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 억제함을확인하였다. 또한 본 연구는 다양한 신호 경로 사이의 상호 작용이 다양한 환경요인에 대한 식물의 적응 반응에 중요하게 작용할 수 있음을 보여주고 있다.
5배 정도의 ABI3 발현 증가와 그 하위 ABI5, ABFs 들의 발현증가가 확인되었다(Fig 4B). 마이크 로어레이 분석결과와 비슷하게 bes1-D 유식물에서 ABA 처리전 또는 처리후에 따른 이들 전사인자들의 발현량이 현저히 감소되어 있음을 확인 할 수 있었다. 특히 ABI3-ABI5 두전사인자의 조절기작은 식물의 발아와 유식물 발달에 있어서 매우 중요한 ABA 신호전달 매개체 이다 (Lopez-Molina et al.
2B). 먼저 En-2와 bes1-D에서 ABA 처리에 따라 공통으로 증가되는 유전자들은 ABA, 지질 등 2차 대사산물 합성과 신호전달에 관여하는 유전자들로 나타났다. ABA 처리에 따른 En-2 와 bes1-D 돌연변이체에서 특이적으로 발현량이 증가 (Pattern 2, 3)되거나 감소(Pattern 4, 5)되는 패턴은 Fig.
2B, Pattern 3). 반대로 ABA 처리 후, bes1-D에서 특이적 으로 감소하는 유전자들은 ROS와 auxin 합성에 관련된 유전 자들과 ABA 신호전달, 특히 ABF 관련 유전자들이 발현량이 현저하게 감소하였다. 이들 결과로부터 ABA 처리에 따라 특정한 유전자들이 bes1-D 돌연변이체에서 발현이 증가 또는 감소됨으로써, 종자 발아 및 유식물 발달과정에서 ABA 에 대한 반응성을 낮춘다고 시사한다.
2012). 본 실험 결과로 부터 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 활성화되는 BES1 전사인자는 다양한 유전자의 발현을 조절하여 ABA 활성도를 억제한다고 할 수 있다. BES1에 의해서 조절되는 전사체 발현패턴을 조사하기 위해 microarray 분석을 실시하였다.
뿐만 아니라, BR 신호전달 경로는 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스, 오옥신 및 ROS 등 다양한 신호전달 체계와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 BR 신호전달의 활성화는 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 억제함을확인하였다. 또한 본 연구는 다양한 신호 경로 사이의 상호 작용이 다양한 환경요인에 대한 식물의 적응 반응에 중요하게 작용할 수 있음을 보여주고 있다.
따라서 본 연구에서는 모델식물 애기장대 bes1-D 돌연변 이체와 야생형 En-2에 ABA 처리 후, microarray 분석을 통해 전사체 발현패턴을 살펴보았다. 브라시노스테로이드 활성이 일어난 상태에서 ABA 처리에 따른 다양한 발현 차이를 보인 2,353개 유전자들을 동정하고, 이들 유전자들의 Gene Ontology 분석을 통해 다양한 ABA 신호전달 및 합성에 관여 하는 유전자들이 브라시노스테로이드 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 따라서 종자발아와 유식물 발달단계에서 브라시노스테로이드 신호전달이 어떻게 ABA 반응을 억제하게 되는지에 대해 전사체레벨에서 해석하고 다양한 외부환경 요인에 대한 식물의 반응에 대해 분자적 접근에 대해 고찰하였다.
BES1에 의해서 조절되는 전사체 발현패턴을 조사하기 위해 microarray 분석을 실시하였다. 브라시노스테로이드 활성이 있는 bes1-D와 야생형 En-2 유식물에 ABA를 처리 후, RNA를 추출하여 Microarray로 분석한 결과 통계적으로 유의성이 나타나는 p-value가 0.05 이하와 1.5배 이상의 발현량 차이를 보이는 유전자는 총 2,353개의 DEG를 추출하였다. En-2에서 발현 차이를 보이는 유전자의 수는 총 1,621개 였고, bes1-D에서 발현차이를 보이는 유전자는 총 1,511개 이었다.
GO 분석을 통해 ABA 신호전달 및 대사에 관여하는 유전자들이 BR 신호전달 경로에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라, BR 신호전달 경로는 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스, 오옥신 및 ROS 등 다양한 신호전달 체계와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 BR 신호전달의 활성화는 ABA 신호전달에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 억제함을확인하였다.
2002; Ryu et al, 2014). 이들 결과들은 브라 시노스테로이드 신호전달의 활성이 식물의 발아와 유식물의 발달을 억제하고 있는 ABA반응성을 직접적으로 낮추고 있음을 의미한다.
반대로 ABA 처리 후, bes1-D에서 특이적 으로 감소하는 유전자들은 ROS와 auxin 합성에 관련된 유전 자들과 ABA 신호전달, 특히 ABF 관련 유전자들이 발현량이 현저하게 감소하였다. 이들 결과로부터 ABA 처리에 따라 특정한 유전자들이 bes1-D 돌연변이체에서 발현이 증가 또는 감소됨으로써, 종자 발아 및 유식물 발달과정에서 ABA 에 대한 반응성을 낮춘다고 시사한다.
1A). 이들 결과로부터 브라시 노스테로이드 신호전달과정상의 최하위 전사인자 BES1 경로를 통해 특이적으로 ABA 활성이 억제되고 있는 두 호르몬의 상호작용이 일어났다고 할 수 있다. 또한 종자발아과정및 유식물 발달과정에서 bzr1-1D의 ABA에 대한 민감한 반응은 브라시노스테로이드 합성 및 억제가 그 원인으로 생각할 수 있다(Vriet et al.
즉 브라시노스테로이드 신호전 달의 활성화는 전사인자 BES1의 탈인산화 및 핵으로의 이동을 통해 다양한 ABA 대사 및 신호전달에 관여하는 유전자 들의 발현을 억제하는 것으로 판단된다. 이러한 결과 전체 적인 ABA 신호전달의 활성이 약해지면서 종자의 발아 및 유식물의 발달을 촉진시키는 것으로 예측된다. 전사인자의 활성도가 항상 증가 되어져 있는 bes1-D 유식물에서 ABA 신호 전달의 활성이 실제로 약하게 나타나는지 여부를 마이크로 어레이와 Real-time q-PCR을 통해 확인하였다(Fig.
3A). 이러한 유전자들은 ABFs, ABI5, PP2C, Myb, PYR 등 ABA 신호 전달에 관여하는 유전자들이 대거 포함되어 있음을 확인할수 있었다. 이러한 발현패턴에 차이를 보이는 유전자들 중에서 bes1-D 돌연변이체에서 ABA 처리시, 그 발현량이 감소또는 증가되는 유전자들 만을 추출하였다(Fig.
후속연구
2007). 즉 활성화된 브라시노스테로 이드 신호전달과 ABA 신호전달의 상호작용 네트워크 분석은 식물이 발아와 유식물단계에서 어떻게 외부 환경변화에 적절히 대처하는지에 대한 중요한 단서를 제공할 것으로 기대하고 있다. Microarray 및 Next Generation Sequencing (NGS) 을 기반으로 한 총 전사체 발현 양상 분석은 다양한 신호전 달체계들의 시스템적인 분석을 활용하고 이해할 수 있다 (Harnsomburana et al.
2016). 향후 본 연구를 통해 분석한 연구기법을 통해 최근 발달하고 있는 차세대유전체분석기술(NGS)를 통해 얻어지는 빅데이터를 분석하고, 이러한 지식을 통합적으로 활용함으로써 다양한 생명체들이 어떻게 환경적인 변화와 내재적 신호전달의 통합을 이룰 수 있는 지를 확인함으로써 복잡한 생명현상을 좀더 빠르고 정확하게 이해할 수 있으리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
브라시노스테로이드 신호전달이 ABA 활성도에 미치는 영향은 무엇인가?
반대로 ABA 처리 후, bes1-D에서 특이적 으로 감소하는 유전자들은 ROS와 auxin 합성에 관련된 유전 자들과 ABA 신호전달, 특히 ABF 관련 유전자들이 발현량이 현저하게 감소하였다. 이들 결과로부터 ABA 처리에 따라 특정한 유전자들이 bes1-D 돌연변이체에서 발현이 증가 또는 감소됨으로써, 종자 발아 및 유식물 발달과정에서 ABA 에 대한 반응성을 낮춘다고 시사한다.
식물의 종자발아과정과 유식물 발달 단계가 생장 및 발육에 있어 가장 중요한 이유는?
식물의 생활사 중에서 종자발아과정과 유식물 발달 단계가 외부환경에 대한 위험성이 가장 크기 때문에 생장 및 발육에 있어서 가장 중요하다. 식물 종자는 적합한 발아조건을 외부에서 주어지면 유아 및 유근의 활력이 생겨 유식물로 생장 한다.
발아 및 유식물의 발달을 조절하는 식물생장조절 물질은 무엇이 있는가?
식물 종자는 적합한 발아조건을 외부에서 주어지면 유아 및 유근의 활력이 생겨 유식물로 생장 한다. 이러한 발아 및 유식물의 발달을 조절하는 생리적기 작은 ABA, 지베렐린, 브라시노스테로이드 등의 식물생장조 절물질의 신호전달과정 및 광과의 복잡한 상호작용을 통해 일으키는 것으로 알려져 있다(Choudhary et al. 2012; Ryu et al.
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