[논문]한련초 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 경로에 대한 연구

박인해; 홍석훈; 우원홍; 문연자; 차수빈

doi:10.6114/jkood.2017.30.4.037

한련초 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 경로에 대한 연구
A Study of Melanin Synthesis Pathway of the Ethanol extract of Eclipta prostrata In Vitro Study 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.30 no.4, 2017년, pp.37 - 48

박인해 (원광대학교 한의과대학 안이비인후피부과학교실) , 홍석훈 (원광대학교 한의과대학 안이비인후피부과학교실) , 우원홍 (원광대학교 한의과대학 해부학교실) , 문연자 (원광대학교 한의과대학 해부학교실) , 차수빈 (원광대학교 한의과대학 해부학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This Study was conducted to investigate the melanin synthesis effect of Eclipta prostrata and to determine the relationship between melanin synthesis effect of Eclipta prostrata and cAMP/PKA melanin synthesis pathway. Methods : We measured melanin contents, tyrosinase activity, expression of TRPs, p-CREB in B16F10 cells cultured with Eclipta prostrata ethanol extracts(EEP). And after treatment with H89 and dibutyryl cAMP, which inhibit or promote the activation of PKA, we observed changes in melanin synthesis and tyrosinase activity stimulated by EEP. Results : EEP increased melanin synthesis by promoting the expression of tyrosinase and TRP-1. It also promoted expression of p-CREB. H89 suppresses melanogenic effect and expression of tyrosinase, TRP-1 in B16F10 stimulated by EEP. Dibutyryl cAMP promotes melanogenic effect of EEP. Conclusions : The results of this study suggest that melanin synthesis effect of EEP is related to induction of tyrosinase and TRP-1 expression through the cAMP/PKA pathway.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

백반증 등 저색소질환 치료제로서 한련초의 응용 가능성을 확인하기 위하여 EEP의 멜라닌 생합성 촉진 효과를 관찰하였다. B16F10 세포를 이용하여 EEP의 멜라닌 합성량과 tyrosinase 활성을 측정하고, tyrosinase, TRP, p-CREB 등의 단백질 발현을 조사 하였으며, 아울러 cAMP/PKA 경로에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 PKA의 활성을 억제 또는 촉진하는 H89와 dbcAMP 처치에 따른 EEP의 작용 기전을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
이에 허증 백반증 치료에 활용 가능한 한련초의 멜라닌 합성 촉진 효과를 알아보기 위하여 B16F10 세포를 이용하여 한련초 에탄올 추출물의 멜라닌 생합성 효과와 주요 멜라닌 합성 신호 전달 경로 중 하나인 cAMP/PKA 경로에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

제안 방법

10㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 1×10 5개씩 분주하여 2일간 배양한 후, EEP 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리한 다음 3일간 배양하였다.
6㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 3×104개씩 분주하여 부착시킨 후, EEP를 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리하였다.
B16F10 세포를 10㎝ 배양용기에 1×105 개씩 세포를 부착시키고 EEP 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 처리한 다음 3일 동안 배양하였다.
백반증 등 저색소질환 치료제로서 한련초의 응용 가능성을 확인하기 위하여 EEP의 멜라닌 생합성 촉진 효과를 관찰하였다. B16F10 세포를 이용하여 EEP의 멜라닌 합성량과 tyrosinase 활성을 측정하고, tyrosinase, TRP, p-CREB 등의 단백질 발현을 조사 하였으며, 아울러 cAMP/PKA 경로에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 PKA의 활성을 억제 또는 촉진하는 H89와 dbcAMP 처치에 따른 EEP의 작용 기전을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
B16F10 세포에 EEP 50㎍/㎖와 100㎍/㎖ 및 양성 대조군 FSK 500nM 처리한 후 6시간이 경과한 다음 CREB와 인산화된 CREB를 western blot을 통해 측정하였다. 단백질 수준에서 한련초 50㎍/㎖ 처리군에서 111%, 100㎍/㎖ 처리군에서 149%로 인산화된 CREB의 증가를 관찰되었다(Fig.
B16F10 세포에서 EEP가 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양된 B16F10 세포에 EEP 25, 50, 100㎍/㎖ 처리하고 72시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. 실험 결과 EEP 25㎍/㎖에서는 101%, 50㎍/㎖에서는 112%, 100㎍/㎖ 에서는 127%로 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도가 증가하는 것을 알 수 있었으며, 양성대조군인 FSK 500nM에서는 138%의 tyrosinase 활성도를 나타내었다(Fig.
B16F10 세포에서 EEP의 멜라닌 합성 유도 효과를 확인하기 위하여 배양된 B16F10 세포에 EEP 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리한 다음 72시간 배양한 후 멜라닌 합성량을 측정하였다. 실험 결과 EEP는 25㎍/㎖에서 108%, 50㎍/㎖에서 115%, 100㎍/㎖에서 133%로 멜라닌 합성량을 증가시켰으며, 양성대조군인 FSK을 500nM 처리한 결과 151%의 멜라닌 합성량이 증가하였다(Fig.
B16F10 세포의 EEP에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 EEP 10, 50, 100, 150㎍/㎖로 72시간 처리 후 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 실험 결과 대조군에 비해 EEP 10㎍/㎖ 농도에서 99%, 50㎍/㎖ 농도에서 92%, 100㎍/㎖ 농도에서 82%, 150㎍/㎖ 농도에서 34%의 세포 생존율을 보였다(Fig.
B16F10 세포의 멜라닌 합성 관련 단백질인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질의 발현을 western blot를 통하여 조사하였다. Tyrosinase의 경우 EEP 50㎍/㎖에서 116%, 100㎍/㎖에서 138%의 발현 증가를 보였으며, TRP-1은 EEP 50㎍/㎖에서 122%, 100㎍/㎖에서 198%의 발현 증가를 보였으나, TRP-2의 경우 변화는 관찰되지 않았다.
H89 처리군은 H89 1.5μM을 전처리하고 한 시간 후 EEP를 100㎍/㎖ 처리하였고, dbcAMP 처리군은 dbcAMP 15분 전처리 후 EEP를 100㎍/㎖ 처리하여 배양하였다.
PKA 억제제인 H89를 처리한 후 멜라닌 합성량의 변화를 관찰하였다. H89만을 처리한 경우 멜라닌 합성량은 81%로 감소하였고, EEP 100㎍/㎖만 처리한 경우 136%, EEP 100㎍/㎖와 H89를 공동처리한 경우에는 111%의 멜라닌 합성량 변화가 관찰되었다(Fig.
PKA의 발현을 유도할 수 있는 dbcAMP를 처리한 후 멜라닌 합성량의 변화를 관찰하였다. dbcAMP만을 처리한 경우 멜라닌 합성량은 134%로 증가하였고, EEP 100㎍/㎖만 처리한 경우 140%, EEP 100㎍/㎖와 dbcAMP를 공동 처리한 경우에는 155%의 멜라닌 합성량 변화가 관찰되었다(Fig.
TBST(tris-buffered saline and polysorbate 20)로 5회 세척한 후, 2차 antibody를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척한 후 ECL 용액으로 발색한 후 ChemiDoc를 이용하여 band의 사진을 촬영하였다.
1M PMSF를 혼합한 lysis buffer를 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 용해시킨 후, 4℃ 15,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595㎚에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하여 0.1M SPB(pH 6.8)의 총량이 150㎕이 되도록 분주하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50㎕씩 분주하여 37℃에서 30분 반응시켜서 475㎚에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
배양된 세포를 냉장된 PBS로 세척한 후 수거하여 lysis buffer(1x RIPA buffer 1㎖, 1% protease inhibitor)로 얼음 위에서 30분간 용해시킨 후, 4℃ 13,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 단백질은 Bradford 시약을 이용하여 정량하였고, 계산된 단백질과 2x sample buffer(1㎖ glycerol, 0.5㎖ B-mercaptoethanol, 3㎖ 10% SDS, 1.25㎖ 1M Tris-HCl, 2㎍ bromophenol blue)를 동량으로 혼합한 후 총 단백질 40㎍을 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. Nitrocellulose membrane로 전이시키고 5% non-fat milk로 blocking 시킨 후, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, CREB, p-CREB antibody를 반응시켰다.
또한 H89 처리군은 H89 1.5μM을 전처리하고 한 시간 후 EEP를 100㎍/㎖ 처리하였고, dbcAMP 처리군은 dbcAMP 15분 전처리 후 EEP를 100㎍/㎖ 처리하여 배양하였다.
멜라닌 정량은 Hosoi 등의 방법²²⁾을 변형하여 사용하였다. 10㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 1×10 5개씩 분주하여 2일간 배양한 후, EEP 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리한 다음 3일간 배양하였다.
24-well 배양 용기에 2×10 4 개씩 분주하고 48시간 배양 후 EEP를 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂하에서 2일간 배양하였다. 배양 후 100㎕의 MTT 용액을 넣어 4시간 배양한 다음 상층액을 제거한 후 DMSO 1㎖ 녹여서 ELISA reader를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
8), 1% Triton X-100)로 세포를 용해하였다. 원심 분리하여 얻은 세포 침전물을 알코올로 세척한 후 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH 용액으로 90℃에서 1시간 용해하여 475㎚에서 흡광도를 측정하였다.
이어 EEP의 멜라닌 생합성 촉진 효과와 cAMP/PKA 경로와의 연관성을 밝히기 위하여 B16F10 세포에 EEP 처치 후 cAMP/PKA 경로의 하위 신호 전달 과정인 CREB의 인산화에 미치는 영향을 확인하고, PKA의 활성화를 각각 촉진 및 억제할 수 있는 dBcAMP와 H89 inhibitor의 처치에 의한 한련초의 멜라닌 생합성 효과의 변화를 관찰하였다.

대상 데이터

Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco사(NY, USA), dimethyl sulfoxide(DMSO), bovine serum albumin (BSA), triton X-100, ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA), phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), goat polyclonal IgG tyrosinase, TRP-1, TRP-2, phosphor-CREB는 Santa Cruz사(CA, USA), CREB는 Cell signalling사(MA, USA), anti-Goat, anti-Rabbit, anti-Mouse IgG HRP conjugate antibody, hybond-ECL nirocellulose membrane, N,N,N',N-tetrametylethylenediamine(TEMED), L-3,4-dihydroxyhpenyl alanine(L-DOPA), H-89 dihydrochloride hydrate, Dibutyryl cAMP은 Sigma 사(St. Lousi, MO, USA), Western Blotting detection reagent는 Amersham Biosciences사(Buckinghanshire, England), non-fat milk는 Becton사(Le Pont de Claix, France), 단백질 정량 시약은 Bio-Rad사 (CA, USA) 제품을 사용하였다.
EEP를 10, 50, 100, 150㎍/㎖의 농도에서 처리한 결과 10, 50, 100㎍/㎖의 농도에서 82% 이상의 세포 생존율을 나타냈다. 따라서 B16F10 세포를 이용한 tyrosinase, 멜라닌 합성량, 멜라닌 합성 관련 단백질 발현에서 100 ㎍/㎖ 이하의 농도를 사용하였다.
실험에서 사용된 한련초는 (주)옴니허브에서 구입한 것으로 국내에서 재배된 것을 사용하였다. 한련초 200g에 94% 에탄올 2ℓ를 가하여 3일 동안 실온에서 추출하였고, 침전물을 여과한 후 감압 농축하여 한련초에탄올추출물(Ethanol extracts of Eclipta prostrata.
원심분리기(centrifuge HA-12, micro 17TR centrifuge), clean bench, CO 2 incubator는 한일기기사(Inchun, Korea), ELISA reader는 Bio-T사 (Winooski, USA), Electrophoresis power supply는 Amersham사(Buckinghanshire, England), ChemiDoc image analysis는 Bio-Rad사(CA, USA), 감압농 축기는 EYELA사(Rotary evaporator N-100, Digital water bath SB-1000, Temp controller coolace CCA-1100, Japan) 제품을 사용하였다.
한국 세포주 은행(KCLB, Korea)에서 구입한 B16F10 세포는 5% fetal bovine serum(FBS)과 100㎍/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycin, 0.25㎍/㎖ amphotericin B를 첨가하여 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO 2 에서 배양하였다.

데이터처리

실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 * 또는 #, p<0.01인 경우 ** 또는 ##로 유의성이 있다고 표시하였다.

이론/모형

먼저 EEP의 세포 독성을 판단하기 위하여 B16F10 세포를 이용하여 MTT법으로 측정하였다. EEP를 10, 50, 100, 150㎍/㎖의 농도에서 처리한 결과 10, 50, 100㎍/㎖의 농도에서 82% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
세포내 tyrosinase활성은 Martinez-Esparza 등의 방법²³⁾으로 측정하였다. 6㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 3×10⁴개씩 분주하여 부착시킨 후, EEP를 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리하였다.
세포생존율은 Mosmann의 방법²¹⁾ 에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 2×10 4 개씩 분주하고 48시간 배양 후 EEP를 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂하에서 2일간 배양하였다.

성능/효과

1. EEP은 B16F10 세포에서 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 유의하게 증가시켰다.
2. EEP은 B16F10 세포에서 tyrosinase, TRP-1 단백질 발현을 농도 의존적으로 유의하게 증가시켰다.
3. EEP은 B16F10 세포에서 CREB의 인산화를 유의하게 촉진시켰다.
4. H89를 처리한 결과, EEP 단독 처리된 B16F10 세포에 비해 멜라닌 합성량과 tyrosinase 활성도가 감소되었고, tyrosinase, TRP-1 발현 또한 감소되었다.
5. dbcAMP를 처리한 결과, EEP 단독 처리된 B16F10 세포에 비해 멜라닌 합성량과 tyrosinase 활성도가 보다 증가되었다.
B16F10 세포에 EEP 처리 후 6시간이 지나서 p-CREB와 CREB를 western blot을 통해 측정한 결과 EEP 100㎍/㎖ 농도에서 p-CREB의 발현이 149% 증가함을 확인하였다. EEP의 tyrosinase 및 TRP-1의 활성 촉진은 p-CREB의 발현 증가를 통하여 이루어지는 것으로 추측되며, 이러한 가설을 뒷받침하기 위해서는 추가 실험을 통해 경로 상 CREB의 하위 신호 전달 인자인 MITF 발현량 증가를 확인할 필요가 있을 것으로 사료된다.
Cell-free 시스템 및 B16F10 세포에서의 EEP의 tyrosinase 활성 촉진 효과를 확인한 결과 EEP가 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. B16F10 세포에서의 melanin 합성량 역시 EEP 처치 후 농도 의존적으로 증가하여 선행 연구의 결과를 유사하게 재현하였다.
먼저 EEP의 세포 독성을 판단하기 위하여 B16F10 세포를 이용하여 MTT법으로 측정하였다. EEP를 10, 50, 100, 150㎍/㎖의 농도에서 처리한 결과 10, 50, 100㎍/㎖의 농도에서 82% 이상의 세포 생존율을 나타냈다. 따라서 B16F10 세포를 이용한 tyrosinase, 멜라닌 합성량, 멜라닌 합성 관련 단백질 발현에서 100 ㎍/㎖ 이하의 농도를 사용하였다.
PKA 억제제인 H89를 처리한 후 멜라닌 합성량의 변화를 관찰하였다. H89만을 처리한 경우 멜라닌 합성량은 81%로 감소하였고, EEP 100㎍/㎖만 처리한 경우 136%, EEP 100㎍/㎖와 H89를 공동처리한 경우에는 111%의 멜라닌 합성량 변화가 관찰되었다(Fig. 7-A).
Mushroom tyrosinase를 이용한 cell-free 시스템에서 EEP의 tyrosinase activity를 측정한 결과, EEP의 25㎍/㎖ 농도에서 130%, 50㎍/㎖ 농도에서 210%, 100㎍/㎖ 농도에서 275%로 mushroom tyrosinase 활성도가 증가하였으며, 양성대조군인 FSK의 경우 305%, 음성대조군인 KA의 경우 80%의 mushroom tyrosinase 활성도를 나타내었다(Fig. 2).
Tyrosinase 활성도의 경우 H89 단독 처리 시 72%, EEP의 100㎍/㎖의 단독 처리시에는 202%, EEP 100 ㎍/㎖와 H89를 공동 처리한 경우 141%의 tyrosinase 활성도가 나타났다.
Tyrosinase 활성도의 경우 dbcAMP 단독 처리 시 184%, EEP의 100㎍/㎖의 단독 처리 시에는 175% 증가하였으며, EEP 100㎍/㎖와 dbcAMP를 공동 처리한 경우 208%로 tyrosinase 활성도가 증가되었다(Fig. 9-B).
PKA의 발현을 유도할 수 있는 dbcAMP를 처리한 후 멜라닌 합성량의 변화를 관찰하였다. dbcAMP만을 처리한 경우 멜라닌 합성량은 134%로 증가하였고, EEP 100㎍/㎖만 처리한 경우 140%, EEP 100㎍/㎖와 dbcAMP를 공동 처리한 경우에는 155%의 멜라닌 합성량 변화가 관찰되었다(Fig. 9-A).
B16F10 세포에 EEP 50㎍/㎖와 100㎍/㎖ 및 양성 대조군 FSK 500nM 처리한 후 6시간이 경과한 다음 CREB와 인산화된 CREB를 western blot을 통해 측정하였다. 단백질 수준에서 한련초 50㎍/㎖ 처리군에서 111%, 100㎍/㎖ 처리군에서 149%로 인산화된 CREB의 증가를 관찰되었다(Fig. 6). 이를 통해 한련초의 멜라닌 합성 과정은 CREB의 인산화를 통해 촉진됨을 확인하였다.
또한 EEP 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK, 음성대조군 KA 처리군을 처리한 후 72시간 배양하여 배양된 알갱이(pellet)를 육안으로 관찰한 결과에서도 색의 변화를 통해 EEP의 멜라닌 합성 유도 효과를 확인할 수 있었다(Fig. 3-B).
또한 PKA 선택적 억제제인 H89 inhibitor를 처리한 결과, EEP 단독 처리된 B16F10 세포에 비해 멜라닌 합성량과 tyrosinase 활성도가 모두 감소되는 것이 관찰되었다. western blot을 통해서도 EEP에 의해 발현이 증가되었던 tyrosinase와 TRP-1 단백질이 H89 와 EEP를 함께 처리한 샘플에서는 발현이 감소되는 것을 볼 수 있었다.
western blot을 통해서도 EEP에 의해 발현이 증가되었던 tyrosinase와 TRP-1 단백질이 H89 와 EEP를 함께 처리한 샘플에서는 발현이 감소되는 것을 볼 수 있었다. 반대로 PKA의 활성화를 유도할수 있는 dbcAMP를 처리한 결과, EEP에 의한 B16F10 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도의 증가가 보다 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 EEP의 멜라닌 합성 효과가 cAMP/PKA 경로중 상위 단계인 PKA 활성화와 연관이 있다는 것을 시사한다.
B16F10 세포에서 EEP가 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양된 B16F10 세포에 EEP 25, 50, 100㎍/㎖ 처리하고 72시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. 실험 결과 EEP 25㎍/㎖에서는 101%, 50㎍/㎖에서는 112%, 100㎍/㎖ 에서는 127%로 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도가 증가하는 것을 알 수 있었으며, 양성대조군인 FSK 500nM에서는 138%의 tyrosinase 활성도를 나타내었다(Fig. 4).
B16F10 세포에서 EEP의 멜라닌 합성 유도 효과를 확인하기 위하여 배양된 B16F10 세포에 EEP 25, 50, 100㎍/㎖, 양성대조군 FSK 500nM 씩 처리한 다음 72시간 배양한 후 멜라닌 합성량을 측정하였다. 실험 결과 EEP는 25㎍/㎖에서 108%, 50㎍/㎖에서 115%, 100㎍/㎖에서 133%로 멜라닌 합성량을 증가시켰으며, 양성대조군인 FSK을 500nM 처리한 결과 151%의 멜라닌 합성량이 증가하였다(Fig. 3-A).
B16F10 세포의 EEP에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 EEP 10, 50, 100, 150㎍/㎖로 72시간 처리 후 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 실험 결과 대조군에 비해 EEP 10㎍/㎖ 농도에서 99%, 50㎍/㎖ 농도에서 92%, 100㎍/㎖ 농도에서 82%, 150㎍/㎖ 농도에서 34%의 세포 생존율을 보였다(Fig. 1).
알갱이(pellet)을 통해 세포의 색 변화를 관찰한 결과 H89 단독 처리한 경우 멜라닌 합성량이 감소하여 밝게 나타났으며, EEP만을 처리한 경우 멜라닌 합성량이 증가하여 어둡게 나타났다. EEP과 H89를 공동 처리한 경우에는 EEP 단독 처리보다 밝게 관찰되었다(Fig.
반대로 PKA의 활성화를 유도할수 있는 dbcAMP를 처리한 결과, EEP에 의한 B16F10 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도의 증가가 보다 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 EEP의 멜라닌 합성 효과가 cAMP/PKA 경로중 상위 단계인 PKA 활성화와 연관이 있다는 것을 시사한다.
6). 이를 통해 한련초의 멜라닌 합성 과정은 CREB의 인산화를 통해 촉진됨을 확인하였다.
이상의 결과 EEP는 B16F10 세포에서 cAMP/PKA 경로 중 CREB의 인산화와 PKA의 활성화를 통해 tyrosinase와 TRP-1의 발현을 촉진시켜 멜라닌 생합성을 증가시키는 것으로 사료된다.
이상의 결과를 통해 EEP는 B16F10 세포에서 cAMP/PKA 경로 중 PKA의 활성화와 CREB의 인산화를 유도하여 멜라닌 합성 단백질인 tyrosinase 및 TRP-1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 한련초가 멜라닌 생합성 촉진 효과를 통해 백반증 등의 저색소 질환의 치료제로서 응용 가능성이 있는 약재임을 의미하며, 보다 명확하게 한련초의 멜라닌 합성 촉진 기전을 정립하기 위해서는 EEP가 cAMP/PKA 경로의 다른 주요 신호 전달 물질인 cAMP, PKA, MITF 등의 발현량에 미치는 작용을 확인하고, cAMP/PKA 경로 외의 멜라닌 생성 관련 경로들과 한련초와의 연관성을 조사하는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

후속연구

B16F10 세포에 EEP 처리 후 6시간이 지나서 p-CREB와 CREB를 western blot을 통해 측정한 결과 EEP 100㎍/㎖ 농도에서 p-CREB의 발현이 149% 증가함을 확인하였다. EEP의 tyrosinase 및 TRP-1의 활성 촉진은 p-CREB의 발현 증가를 통하여 이루어지는 것으로 추측되며, 이러한 가설을 뒷받침하기 위해서는 추가 실험을 통해 경로 상 CREB의 하위 신호 전달 인자인 MITF 발현량 증가를 확인할 필요가 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과를 통해 EEP는 B16F10 세포에서 cAMP/PKA 경로 중 PKA의 활성화와 CREB의 인산화를 유도하여 멜라닌 합성 단백질인 tyrosinase 및 TRP-1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 한련초가 멜라닌 생합성 촉진 효과를 통해 백반증 등의 저색소 질환의 치료제로서 응용 가능성이 있는 약재임을 의미하며, 보다 명확하게 한련초의 멜라닌 합성 촉진 기전을 정립하기 위해서는 EEP가 cAMP/PKA 경로의 다른 주요 신호 전달 물질인 cAMP, PKA, MITF 등의 발현량에 미치는 작용을 확인하고, cAMP/PKA 경로 외의 멜라닌 생성 관련 경로들과 한련초와의 연관성을 조사하는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	멜라닌은 피부에서 어떠한 기능을 수행하는가?	인체의 피부와 모발의 색을 결정하는 색소인 멜라닌은 표피 기저층의 멜라닌 세포에서 합성되어 방출 되며1), 자외선을 흡수 또는 차단하거나 활성 산소의 소거 등을 통해 피부를 보호하는 기능을 가진다2) . 멜라닌 색소의 형성은 멜라닌 세포 내의 멜라닌소체에서 이루어지며, 멜라닌 소체는 가지돌기 끝으로 옮겨져 각질형성세포의 탐식에 의해 이동한다.
	저색소 질환의 치료법으로 알려진 것은 무엇인가?	멜라닌 색소의 부족으로 인한 저색소 질환은 피부 손상 및 외관상의 불만족을 유발해 사회활동에 지장을 줄 수 있으며3) , 치료법으로 국소 또는 전신 스테로이드 치료, 광선요법, 광화학 요법 및 수술요법 등이 제시되고 있으나 아직 완벽한 치료법은 없는 상황이다4) . 저색소 질환에 응용할 수 있는 천연물에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있는데, 회화나무5) , 음양곽6-9) , 대두10) , 쥐눈이콩과 여우콩11) , 황금12) , 보골지13,14), 산수유15,16) 등이 in vitro에서 멜라닌 합성을 촉진한 다는 결과가 보고된 바 있다.
	멜라닌 색소의 부족으로 발생하는 저색소 질환에 사용될 수 있다고 보고된 천연물의 종류는 무엇인가?	멜라닌 색소의 부족으로 인한 저색소 질환은 피부 손상 및 외관상의 불만족을 유발해 사회활동에 지장을 줄 수 있으며3) , 치료법으로 국소 또는 전신 스테로이드 치료, 광선요법, 광화학 요법 및 수술요법 등이 제시되고 있으나 아직 완벽한 치료법은 없는 상황이다4) . 저색소 질환에 응용할 수 있는 천연물에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있는데, 회화나무5) , 음양곽6-9) , 대두10) , 쥐눈이콩과 여우콩11) , 황금12) , 보골지13,14), 산수유15,16) 등이 in vitro에서 멜라닌 합성을 촉진한 다는 결과가 보고된 바 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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