Real-time PCR 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 종 판별법 개발 Development and Validation of Real-time PCR to Determine Branchiostegus japonicus and B. albus Species Based on Mitochondrial DNA원문보기
미토콘드리아게놈에 존재하는 시토크롬C 산화효소 서브유닛 I (cytochrome C oxidase subunit I, COI) 유전자의 DNA 염기서열을 기반으로 하는 종 판별은 수산물 자원의 지속적인 개발과 어류 다양성 보존을 위해 폭넓게 적용되고 있다. 본 연구에서는 한국에서 소비되는 옥돔과 가짜 옥돔으로 둔갑하는 옥두어의 종 판별을 위한 분석법을 개발하였다. 옥돔과 옥두어, 두 종의 종 판별과 검증을 위해 미토콘드리아 게놈의 DNA 염기서열 차이를 이용하여 real-time PCR법에 의해 분석하였다. 미토콘드리아 DNA 서열의 생물정복학적 분석에서 옥돔과 형태학적 옥돔 유사종인 옥두어, 두 종 사이에 COI 유전자 내에서 상당히 유사한 DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 확인되었다. 명확하게 종 판별을 하기 위해 COI 유전자 내에서 일부 변화된 서열에서 종 특이적 프라이머를 디자인하였다. 10 개체의 옥돔과 옥두어에서 게놈 DNA을 추출하여 옥돔과 옥두어의 종 특이적 프라이머를 이용하여 real-time PCR 시스템에 의해 분석되었다. 이러한 real-time PCR 시스템을 이용한 genomic DNA 기반의 분자 기술은 동물 조직의 분류학적 분류를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 옥돔판별을 위해, 옥돔 DNA에서 옥돔 종 특이적 프라이머를 이용한 Ct 평균값($21.85{\pm}3.599$)과 옥두어 DNA에서 옥돔 종 특이 프라아머를 이용한 Ct 평균값($33.49{\pm}1.183$) 차이를 나타내었다. 그리고 옥두어판별을 위해, 옥두어 DNA에서 옥두어 종 특이적 프라이머를 이용한 Ct 평균값($22.49{\pm}0.908$)과 옥돔 DNA에서 옥두어 종 특이 프라아머를 이용한 Ct 평균값($33.93{\pm}0.479$)을 통해 옥돔과 옥두어의 각 종 특이 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성 측정은 통계적으로 유의한 차이를 보여 주었다. 제안된 방법은 10개의 상용 샘플로 검증이 되었다. 따라서, threshold cycle (Ct) value와 같은 real-time PCR 결과 분석에 의해 종 판별이 가능하였다.
미토콘드리아 게놈에 존재하는 시토크롬C 산화효소 서브유닛 I (cytochrome C oxidase subunit I, COI) 유전자의 DNA 염기서열을 기반으로 하는 종 판별은 수산물 자원의 지속적인 개발과 어류 다양성 보존을 위해 폭넓게 적용되고 있다. 본 연구에서는 한국에서 소비되는 옥돔과 가짜 옥돔으로 둔갑하는 옥두어의 종 판별을 위한 분석법을 개발하였다. 옥돔과 옥두어, 두 종의 종 판별과 검증을 위해 미토콘드리아 게놈의 DNA 염기서열 차이를 이용하여 real-time PCR법에 의해 분석하였다. 미토콘드리아 DNA 서열의 생물정복학적 분석에서 옥돔과 형태학적 옥돔 유사종인 옥두어, 두 종 사이에 COI 유전자 내에서 상당히 유사한 DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 확인되었다. 명확하게 종 판별을 하기 위해 COI 유전자 내에서 일부 변화된 서열에서 종 특이적 프라이머를 디자인하였다. 10 개체의 옥돔과 옥두어에서 게놈 DNA을 추출하여 옥돔과 옥두어의 종 특이적 프라이머를 이용하여 real-time PCR 시스템에 의해 분석되었다. 이러한 real-time PCR 시스템을 이용한 genomic DNA 기반의 분자 기술은 동물 조직의 분류학적 분류를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 옥돔판별을 위해, 옥돔 DNA에서 옥돔 종 특이적 프라이머를 이용한 Ct 평균값($21.85{\pm}3.599$)과 옥두어 DNA에서 옥돔 종 특이 프라아머를 이용한 Ct 평균값($33.49{\pm}1.183$) 차이를 나타내었다. 그리고 옥두어판별을 위해, 옥두어 DNA에서 옥두어 종 특이적 프라이머를 이용한 Ct 평균값($22.49{\pm}0.908$)과 옥돔 DNA에서 옥두어 종 특이 프라아머를 이용한 Ct 평균값($33.93{\pm}0.479$)을 통해 옥돔과 옥두어의 각 종 특이 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성 측정은 통계적으로 유의한 차이를 보여 주었다. 제안된 방법은 10개의 상용 샘플로 검증이 되었다. 따라서, threshold cycle (Ct) value와 같은 real-time PCR 결과 분석에 의해 종 판별이 가능하였다.
DNA barcoding is the identification of a species based on the DNA sequence of a fragment of the cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene in the mitochondrial genome. It is widely applied to assist with the sustainable development of fishery-product resources and the protection of fish biodiversity....
DNA barcoding is the identification of a species based on the DNA sequence of a fragment of the cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene in the mitochondrial genome. It is widely applied to assist with the sustainable development of fishery-product resources and the protection of fish biodiversity. This study attempted to verify horse-head fish (Branchiostegus japonicus) and fake horse-head fish (Branchiostegus albus) species, which are commonly consumed in Korea. For the validation of the two species, a real-time PCR method was developed based on the species' mitochondrial DNA genome. Inter-species variations in mitochondrial DNA were observed in a bioinformatics analysis of the mitochondrial genomic DNA sequences of the two species. Some highly conserved regions and a few other regions were identified in the mitochondrial COI of the species. In order to test whether variations in the sequences were definitive, primers that targeted the varied regions of COI were designed and applied to amplify the DNA using the real-time PCR system. Threshold-cycle (Ct) range results confirmed that the Ct ranges of the real-time PCR were identical to the expected species of origin. Efficiency, specificity and cross-reactivity assays showed statistically significant differences between the average Ct of B. japonicus DNA ($21.85{\pm}3.599$) and the average Ct of B. albus DNA ($33.49{\pm}1.183$) for confirming B. japonicus. The assays also showed statistically significant differences between the average Ct of B. albus DNA ($22.49{\pm}0.908$) and the average Ct of B. japonicus DNA ($33.93{\pm}0.479$) for confirming B. albus. The methodology was validated by using ten commercial samples. The genomic DNA-based molecular technique that used the real-time PCR was a reliable method for the taxonomic classification of animal tissues.
DNA barcoding is the identification of a species based on the DNA sequence of a fragment of the cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene in the mitochondrial genome. It is widely applied to assist with the sustainable development of fishery-product resources and the protection of fish biodiversity. This study attempted to verify horse-head fish (Branchiostegus japonicus) and fake horse-head fish (Branchiostegus albus) species, which are commonly consumed in Korea. For the validation of the two species, a real-time PCR method was developed based on the species' mitochondrial DNA genome. Inter-species variations in mitochondrial DNA were observed in a bioinformatics analysis of the mitochondrial genomic DNA sequences of the two species. Some highly conserved regions and a few other regions were identified in the mitochondrial COI of the species. In order to test whether variations in the sequences were definitive, primers that targeted the varied regions of COI were designed and applied to amplify the DNA using the real-time PCR system. Threshold-cycle (Ct) range results confirmed that the Ct ranges of the real-time PCR were identical to the expected species of origin. Efficiency, specificity and cross-reactivity assays showed statistically significant differences between the average Ct of B. japonicus DNA ($21.85{\pm}3.599$) and the average Ct of B. albus DNA ($33.49{\pm}1.183$) for confirming B. japonicus. The assays also showed statistically significant differences between the average Ct of B. albus DNA ($22.49{\pm}0.908$) and the average Ct of B. japonicus DNA ($33.93{\pm}0.479$) for confirming B. albus. The methodology was validated by using ten commercial samples. The genomic DNA-based molecular technique that used the real-time PCR was a reliable method for the taxonomic classification of animal tissues.
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문제 정의
본 연구에서는 부정 식품 유통 근절을 위해 형태학적으로 판별이 어려운 옥돔(B. japonicus)과 그 형태학적 유사 어종인 옥두어(B. albus)에 대한 정확한 판별 기술을 확립하기 위해 국제생물바코드컨소시엄(Consortium for the Barcode of Life)에서 제안된 종 판별 바코드 영역인 미토콘드리아 DNA 염기서열의 cytochrome c oxidase I (COI) 유전자 영역에서 종 특이 프라이머를 설계, 2종에 대한 정확한 판별이 가능한 real-time PCR 반응 조건을 확립하고자 하였다.
이에 본 연구에서도 기존의 종 판별 문제점을 극복하기 위한 방법으로 real-time PCR을 이용하여 옥돔과 옥두어의 종 판별을 위한 조건을 확립하였다. 옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 real-time PCR system에 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 Ct 값을 비교 분석하여 종 판별이 가능하며, real-time PCR 조건에서 반응 반복횟수를 30회 이내로 축소하면 종 판별에 검출/비검출의 판별법으로 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
제안 방법
Collection tube에 담긴 Binding column 용출액을 제거하고, W1 버퍼 500 μl를 Binding column에 넣고 원심분리(6,000× g, 1분)하였다.
DNA 추출 시 하나의 분석 검체로부터 적정량을 2회 칭량하여 동시에 DNA를 추출하였고, 추출된 각각의 DNA는 적절히 희석하거나 농축하여 PCR에 사용하였다. DNA는AccuPrepⓇ Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 아래와 같이 추출하였다.
PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 각 시료에서 추출한 genomic DNA 1 μl (10 ng/μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole),AccuPower® Taq PCR PreMix, distilled water 17 μl로 총 20μl로, PCR 반응은 AllInOneCycler™ (Bioneer, Korea)를 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 7분 동안 pre-denaturation 후 94℃에서 30초간 denaturation, 50℃에서 30초간 annealing 및 72℃에서 1분간 extension의 조건으로 35회 반복하여 진행하였고 최종적으로 72℃에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA 염기서열 분석 서비스(Macrogen, Korea)를 의뢰하여 염기서열 분석을 진행하였다.
PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 각 시료에서 추출한 genomic DNA 1 μl (10 ng/μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole),AccuPower® Taq PCR PreMix, distilled water 17 μl로 총 20μl로, PCR 반응은 AllInOneCycler™ (Bioneer, Korea)를 사용하였다.
Real-time PCR 반응액 조성은 template DNA 1 μl, forward primer 1μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl로 총 20 μl로 준비하였다. Real-time PCR 기기는 QuantStudio 6 Flex real-time PCR instrument system (ABI, USA)를 사용하였으며, 플레이트를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시하였다.
Real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 동안 pre-denaturation 후 95℃에서 15초간 denaturation, 60℃에서 15초간 annealing 및 72℃에서 15초간 extension의 조건으로 35회 반복하여 진행하였다.
2. Standard curve of a 10-fold serial diluted standard plasmid DNA of B. japonicus (A) and B. albus (B) with averaged results from 3 separately repeated real-time PCR experiments, and parameter values of each standard curve (C). Threshold cycle(Ct) is plotted on the Y-axis and standard plasmid DNA equivalent is plotted on the X-axis.
uk/Tools/msa/clustalo)를 사용하여 옥돔과 옥두어 각각의 COI 유전자 1,534bp의 염기서열을 분석하였다. 두 종에서 얻어진 COI 영역 염기서열은 종간 특이성을 나타내는 염기서열 변이 부분을 탐색하였다. 종 특이 프라이머는 real-time PCR을 고려하여 증폭산물의 크기는 80~200 base pair 사이가 되도록 하였고, 염기서열 변이 부위는 프라이머의 3’말단에 위치하도록 제작하였다.
선별된 colony를 ampicillin (50 μg/ml)이 첨가된 LB 액체배양액에 배양한 후 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)을 이용하여 plasmid DNA를 추출하였다.
nih)에 등록 되어 있는 COI 유전자 염기서열을 이용하였다. 실험 대상 시료의 COI 유전자 염기서열을 각각 3종류 이상 선정하여 이들의 유전적 상동성을 확인하였으며, 이 결과로부터 real-time PCR의 적용성을 고려하여 옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 최적의 프라이머를 선정하였고 프라이머의 위치는 Fig. 1에 표시하였다. 본 연구에서 real-time PCR에 사용되는 옥돔과 옥두어 2쌍의 종 특이 프라이머는 Table 1에 표시되어있으며, 제작된 2쌍의 프라이머는 각각 옥돔과 옥두어의 시료에서 특이적으로 증폭하여 종 판별을 할 수 있다.
옥돔 및 옥두어 조직에서 추출한 genomic DNA를 사용하여, 옥돔 및 옥두어 판별을 위한 real-time PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 각각의 시료에서 추출한 genomic DNA 1 μl(10 ng/μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl, 총 20 μl로 반응액을 준비하여 standard curve를 확인하기 위한 동일한 조건에서 real-time PCR을 수행하였다.
옥돔 및 옥두어 조직에서 추출한 genomic DNA를 사용하여, 옥돔 및 옥두어 판별을 위한 real-time PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 각각의 시료에서 추출한 genomic DNA 1 μl(10 ng/μl), forward primer 1 μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl, 총 20 μl로 반응액을 준비하여 standard curve를 확인하기 위한 동일한 조건에서 real-time PCR을 수행하였다. 옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 real-time PCR은 옥돔, 옥두어 각각 5개 개체에서 추출된 genomic DNA를 template로 사용하였고, 각각의 시료는 3개씩 PCR 반응을 수행하고 반응 종료 후 실험결과를 해석하였다.
옥돔과 옥두어 종에 각각 특이적인 프라이머 세트의 real-time PCR 효율을 확인하기 위해 옥돔의 Bj-al_2_F/R primer와 옥두어 Bal-j_2_F/R primer를 이용하여 각 옥돔과 옥두어로부터 증폭된 PCR 산물을pGEM®T-easy vector system (Promega, USA)에 클로닝 하였고, DH5α competent cell (Takara, Japan)에 형질전환한 후 ampicillin (50 μg/ml)이 첨가된 LB-agar 배지에서 blue/white colony selection을 통해 단일 colony를 선별하였다.
옥돔과 옥두어에서 확보한 각각의 standard plasmid DNA를 10배수 희석하여 template로 사용한 real-time PCR 반응 결과, 옥돔 판별을 위한 프라이머 세트의 standard curves(Fig. 2A)와 옥두어 판별을 위한 프라이머 세트의 standard curves (Fig. 2B)를 확보하였다. 또한 Table 2에서 나타나는 것과 같이 3회 반복한 결과에서 거의 유사한 threshold cycle(Ct) 값을 나타내며, 옥돔 프라이머 세트(Bj-al_2)의 standard curves 결과에서 기울기(Slop)는 -3.
옥돔과 옥두어의 각 5개 시료의 genomic DNA를 동일한농도로 맞추어 template로 사용하고 옥돔의 종 특이 프라이머 세트(Bj-al_2)와 옥두어의 종 특이 프라이머 세트(Bal-j_2)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 옥돔과 옥두어의 각 5개의 시료에서 옥돔 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 realtime PCR 결과를 분석 결과, 옥돔의 시료에서 Ct 값 평균이 21.
종 특이 프라이머는 real-time PCR을 고려하여 증폭산물의 크기는 80~200 base pair 사이가 되도록 하였고, 염기서열 변이 부위는 프라이머의 3’말단에 위치하도록 제작하였다.
PCR 조건은 94℃에서 7분 동안 pre-denaturation 후 94℃에서 30초간 denaturation, 50℃에서 30초간 annealing 및 72℃에서 1분간 extension의 조건으로 35회 반복하여 진행하였고 최종적으로 72℃에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA 염기서열 분석 서비스(Macrogen, Korea)를 의뢰하여 염기서열 분석을 진행하였다.
추출된 DNA의 농도는 OptizenTM NanoQ (K Lab Kiswire,Korea)를 이용하여 측정하였고, 추출된 genomic DNA의 농도를 10 ng/μl로 맞추어 real-time PCR template로 사용하였다.
추출된 plasmid DNA는 옥돔과 옥두어의 판별을 위한standard curve를 확인하기 위한 standard plasmid DNA로서 각각 10 ng/μl, 1 ng/μl, 100 pg/μl, 10 pg/μl, 1 pg/μl, 100fg/μl, 10 fg/μl로 희석하여 template로 사용하였다.
확보된 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 DNA 서열 중에서 보존적인 COI 유전자 염기서열을 이용하여 유전자 염기서열정렬을 하였으며, European Molecular Biology Laboratory의Clustal omega (EMBL, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)를 사용하여 옥돔과 옥두어 각각의 COI 유전자 1,534bp의 염기서열을 분석하였다. 두 종에서 얻어진 COI 영역 염기서열은 종간 특이성을 나타내는 염기서열 변이 부분을 탐색하였다.
확보된 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 DNA 서열 중에서 보존적인 COI 유전자 염기서열을 이용하여유전자 서열 정렬(sequence alignment)를 통해 옥돔과 옥두어를 공통적으로 증폭할 수 있는 forward primer (Br_COI_U_F,5’-TCATTCGAGCAGAACTTAGC-3’)와 reverse primer (Br_COI_U_R, 5’-GTAGCGGATGTAAAGTATGCA-3’) 쌍을 제작하여 종 확인에 사용하였다.
대상 데이터
Real-time PCR 반응액 조성은 template DNA 1 μl, forward primer 1μl (10 pmole), reverse primer 1 μl (10 pmole), 2X GreenStar Master Mix 10 μl, distilled water 7 μl로 총 20 μl로 준비하였다.
종 특이 프라이머는 real-time PCR을 고려하여 증폭산물의 크기는 80~200 base pair 사이가 되도록 하였고, 염기서열 변이 부위는 프라이머의 3’말단에 위치하도록 제작하였다. Tm 값은 57~62℃ 범위를 가지며 30~70%의 GC 비율을 고려하여 Table 1과 같이 최종적으로 디자인하여 올리고 합성(Bioneer, Korea)을 의뢰, 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 옥돔(Branchiostegus japonicus, 5마리, 체장25~35 cm)과 옥두어(Branchiostegus albus, 10마리, 체장 25~35cm)는 2016년 8월, 2016년 10월, 2017년 6월에 제주 동문시장,제주 올레시장, 제주시 수산업협동조합에서 구입하였으며, 구입 후 실험 전까지 -20℃에 보관하였다. 옥돔 및 옥두어의 원물, 건조 등의 제품을 액체 질소와 막자 사발을 이용하여 균질하게 분쇄한 것을 분석 검체로 사용하였다.
실험에 사용한 옥돔(Branchiostegus japonicus, 5마리, 체장25~35 cm)과 옥두어(Branchiostegus albus, 10마리, 체장 25~35cm)는 2016년 8월, 2016년 10월, 2017년 6월에 제주 동문시장,제주 올레시장, 제주시 수산업협동조합에서 구입하였으며, 구입 후 실험 전까지 -20℃에 보관하였다. 옥돔 및 옥두어의 원물, 건조 등의 제품을 액체 질소와 막자 사발을 이용하여 균질하게 분쇄한 것을 분석 검체로 사용하였다.
옥돔과 옥두어 판별을 위한 종 특이 프라이머를 디자인하기 위하여 미국 국립보건원에서 운영하는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih)에 등록 되어 있는 COI 유전자 염기서열을 이용하였다. 실험 대상 시료의 COI 유전자 염기서열을 각각 3종류 이상 선정하여 이들의 유전적 상동성을 확인하였으며, 이 결과로부터 real-time PCR의 적용성을 고려하여 옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 최적의 프라이머를 선정하였고 프라이머의 위치는 Fig.
옥돔과 옥두어의 COI 유전자의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 옥돔 미토콘드리아 전체 염기서열(NC_012904.1)과 옥두어 미토콘드리아 전체 염기서열(NC_012905.1)로부터 확보하였다. 확보된 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 DNA 서열 중에서 보존적인 COI 유전자 염기서열을 이용하여유전자 서열 정렬(sequence alignment)를 통해 옥돔과 옥두어를 공통적으로 증폭할 수 있는 forward primer (Br_COI_U_F,5’-TCATTCGAGCAGAACTTAGC-3’)와 reverse primer (Br_COI_U_R, 5’-GTAGCGGATGTAAAGTATGCA-3’) 쌍을 제작하여 종 확인에 사용하였다.
이론/모형
전통적으로 종 구분을 위한 분석법은 각종이 나타내는 특이적인 단백질 및 DNA 다형성을 바탕으로 한다. 단백질을 이용한 종 판별법은 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis,CE), 고속액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC), 그리고 항체를 이용하는 면역분석법(immunoassay)을 이용한다[5, 12, 23, 27, 30]. 이처럼 단백질을 이용한 종 판별법은 열처리 및 건조 같은 물리·화학적 조성의 변화와 단백질 구조의 변화로 분석결과의 판독에 대한 신뢰성이 낮아져 가공식품에는 적합하지 못하고, 항체를 필요로하는 면역학적 방법은 유사한 단백질 사이의 교차 반응에 의해 영향을 받을 수 있다[16, 27].
성능/효과
2C). 각 프라이머의 검출한계를 standard plasmid DNA의 real-time PCR 결과를 통해 계산 하였을 때 약 2.94x103 copy number까지 증폭이 가능하였다.
그리고 옥두어 시료의 genomic DNA에서 옥두어 종 특이적 프라이머(Bal-j_02)를 이용한 Ct 평균값은 22.49±0.908이었고, 옥돔 시료의 genomic DNA에서 옥두어 종 특이 프라아머를 이용한 Ct 평균값은 33.93±0.479을 나타내었다.
동일한 시료 조건으로 옥두어 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 real-time PCR 결과 옥돔 시료의 genomic DNA에서 옥돔 종 특이적 프라이머(Bj-al_02)를 이용한 Ct 평균값은 21.85±3.599이었고, 옥두어 시료의 genomic DNA에서 옥돔 종 특이프라아머를 이용한 Ct 평균값은 33.49±1.183이었다.
2B)를 확보하였다. 또한 Table 2에서 나타나는 것과 같이 3회 반복한 결과에서 거의 유사한 threshold cycle(Ct) 값을 나타내며, 옥돔 프라이머 세트(Bj-al_2)의 standard curves 결과에서 기울기(Slop)는 -3.445, 상관 계수(R2)는 0.999,효율은 95%이상을 나타내며, 옥두어 프라이머 세트(Bal-j_2)의 standard curves 결과에서 기울기(Slop)는 -3.401, 상관 계수(R2)는 0.999, 효율은 약 97%을 나타내고 있다(Fig. 2C). 각 프라이머의 검출한계를 standard plasmid DNA의 real-time PCR 결과를 통해 계산 하였을 때 약 2.
3B의 결과에서 보듯이 각 종 특이 프라이머를 사용하였을 때 유사종의 증폭곡선은 목적종의 증폭곡선과 명확한 차이를 나타내고 있다. 또한, 각 종 특이 프라이머 세트에 의한 Ct 값의 평균을 분석하더라도, 평균 10 cycle 이상의 차이를 나타내고 있으므로 종 판별을 위한 좀 더 명확한 차이를 확인할 수 있다(Table 3).
이에 본 연구에서도 기존의 종 판별 문제점을 극복하기 위한 방법으로 real-time PCR을 이용하여 옥돔과 옥두어의 종 판별을 위한 조건을 확립하였다. 옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 real-time PCR system에 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 Ct 값을 비교 분석하여 종 판별이 가능하며, real-time PCR 조건에서 반응 반복횟수를 30회 이내로 축소하면 종 판별에 검출/비검출의 판별법으로 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 옥돔과 옥두어 뿐만 아니라 종 구분 문제를 야기하는생물 종의 경우, 종 판별에 적합한 종 특이 프라이머 세트를 설계하여 명확한 종 판별 시스템으로 적용할 수 있으며, 본연구에서 개발된 옥돔과 옥두어 종 판별 분석법은 사용되는 식품 원료의 안전성 확보, 유통질서 확립 및 소비자 보호와 생산자에 대한 소비자 신뢰를 회복을 위해 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
옥돔과 옥두어의 각 5개 시료의 genomic DNA를 동일한농도로 맞추어 template로 사용하고 옥돔의 종 특이 프라이머 세트(Bj-al_2)와 옥두어의 종 특이 프라이머 세트(Bal-j_2)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 옥돔과 옥두어의 각 5개의 시료에서 옥돔 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 realtime PCR 결과를 분석 결과, 옥돔의 시료에서 Ct 값 평균이 21.85, 옥두어 시료에서 Ct 값 평균이 33.49로 분석되었다. 동일한 시료 조건으로 옥두어 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 real-time PCR 결과 옥돔 시료의 genomic DNA에서 옥돔 종 특이적 프라이머(Bj-al_02)를 이용한 Ct 평균값은 21.
479을 나타내었다. 옥돔과 옥두어의 각종 특이 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성 측정은 통계적으로 유의한 차이를 보여 주었다. 옥돔과 옥두어 시료의 genomic DNA에 대하여 각 종의 종 특이 프라이머 세트를 사용한 경우에 Ct 평균값은 23 이하로 나타나는 반면, 종의 종 특이 프라이머 세트가 아닌 경우에는 Ct 값이 33 이상으로 나타나고 있어 옥돔과 옥두어 종 특이 프라이머 세트의 비특이적 교차 반응이 나타난다고 볼 수 있다(Fig.
후속연구
옥돔과 옥두어 종 판별을 위한 real-time PCR system에 종 특이 프라이머 세트를 사용하여 Ct 값을 비교 분석하여 종 판별이 가능하며, real-time PCR 조건에서 반응 반복횟수를 30회 이내로 축소하면 종 판별에 검출/비검출의 판별법으로 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 옥돔과 옥두어 뿐만 아니라 종 구분 문제를 야기하는생물 종의 경우, 종 판별에 적합한 종 특이 프라이머 세트를 설계하여 명확한 종 판별 시스템으로 적용할 수 있으며, 본연구에서 개발된 옥돔과 옥두어 종 판별 분석법은 사용되는 식품 원료의 안전성 확보, 유통질서 확립 및 소비자 보호와 생산자에 대한 소비자 신뢰를 회복을 위해 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
시토크롬C 산화효소 서브유닛 I유전자(COI)는 세포 내 어디에 존재하고 있는가?
미토콘드리아 게놈에 존재하는 시토크롬C 산화효소 서브유닛 I (cytochrome C oxidase subunit I, COI) 유전자의 DNA 염기서열을 기반으로 하는 종 판별은 수산물 자원의 지속적인 개발과 어류 다양성 보존을 위해 폭넓게 적용되고 있다. 본 연구에서는 한국에서 소비되는 옥돔과 가짜 옥돔으로 둔갑하는 옥두어의 종 판별을 위한 분석법을 개발하였다.
옥돔과 형태학적 옥돔 유사종인 옥두어, 두 종간 유사DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 나타나는 유전자는 무엇인가?
옥돔과 옥두어, 두 종의 종 판별과 검증을 위해 미토콘드리아 게놈의 DNA 염기서열 차이를 이용하여 real-time PCR법에 의해 분석하였다. 미토콘드리아 DNA 서열의 생물정복학적 분석에서 옥돔과 형태학적 옥돔 유사종인 옥두어, 두 종 사이에 COI 유전자 내에서 상당히 유사한 DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 확인되었다. 명확하게 종 판별을 하기 위해 COI 유전자 내에서 일부 변화된 서열에서 종 특이적 프라이머를 디자인하였다.
종 구분을 위한 분석법 중 단백질을 이용한 종 판별법이 가진 단점은 무엇인가?
단백질을 이용한 종 판별법은 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis,CE), 고속액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC), 그리고 항체를 이용하는 면역분석법(immunoassay)을 이용한다[5, 12, 23, 27, 30]. 이처럼 단백질을 이용한 종 판별법은 열처리 및 건조 같은 물리·화학적 조성의 변화와 단백질 구조의 변화로 분석결과의 판독에 대한 신뢰성이 낮아져 가공식품에는 적합하지 못하고, 항체를 필요로하는 면역학적 방법은 유사한 단백질 사이의 교차 반응에 의해 영향을 받을 수 있다[16, 27]. 이와 대조적으로 핵산 기반의 분석법은 특이적이고 민감한 방법으로 열처리나 건조 같은가공과정을 거친 식품에도 적용이 가능하여 신뢰할 수 있는 종 구분을 위한 분석법이 될 수 있다[6-10, 13-15, 18, 19, 39].
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