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문제 정의
- 따라서 본 연구는 명월초, 여주 및 울금을 이용하여 in vitro에서 항산화 및 α-glucosidase 저해활성을 확인하고, 돼지감자 농축액에 대한 최적 혼합비를 선정함으로써 항산화 및 항당뇨 활성이 증대된 돼지감자 복합물을 제조하고자 수행되었다.
제안 방법
- 준비된 membrane에 1차 항체인 phospho-AMPK-α 및 AMPK-α (1:1,000 dilution, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 처리하여 4℃에서 overnight한 후 재차 수세하였다. 2차 항체(1:10,000 dilution, anti-rabbit antibody)를 처리하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 enhanced chemiluminocsence 용액(Dogen, Seoul, Korea)을 처리한 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 단백질의 발현을 확인하였으며, ImageJ software (version 1.49, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 단백질의 발현을 정량화하였다.
- 96 well plate에 시료 40 μl, FRAP 기질용액 100 μl 및 증류수 40 μl를 차례로 가하여 잘 혼합한 다음 37℃에서 4분간 반응시켜 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 환원력은 FeSO4·7H2O (Sigma-Aldrich Co.)를 사용한 표준 검량선에 따라 계산하였다[3].
- C2C12 근육세포에서 시료액에 의한 당 유입 활성을 확인하기 위해 glucose uptake Cell-Based Assay kit (Cayman, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하였다. 96-well plate에 3×10⁴ cells/ well로 세포를 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
- 96-well plate에 3×10⁴ cells/ well로 세포를 분주하여 24시간 동안 배양하였다. Glucose가 포함되지 않은 DMEM에 각 시료액 및 fluorescent 2-[N-(7- nitrobenz-2-oxa 1,3-diazol-4yl) amino]-2-deoxy (2-NBDG; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 조제하였으며, 이를 세포 에 처리하여 3시간 동안 반응시켰다. 이를 400× g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후, cell-based assay 완충액으로 세포를 2회 세척하였으며, 세포내로 유입되는 2-NBDG를 형광으로 측정하였다.
- 이 기질용액 100 μl에 시료 추출물 50 μl를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다[47]. 라디칼 소거활성은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도 비(%)로 계산하였다. Ferric-reducing antioxidant potential (FRAP) 법에 의한 환원력은 300 mM acetate 완충용액(pH 3.
- 명월초, 여주 및 울금의 물과 70% 에탄올 추출물의 항산화 활성은 100~10,000 μg/ml의 농도범위에서 DPPH, ABTS 라디칼 소거활성과 환원력으로 측정하였으며, DPPH 및 ABTS 라디칼의 50% 소거 및 환원력으로써 FeSO4·7H2O의 50 μM에 해당되는 시료 추출물의 함량(EC50)은 Table 3과 같다.
- 명월초, 여주 및 울금의 에탄올 추출물은 물 추출물에 비해 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해활성이 높아 이를 돼지감자 농축액과 혼합하여 혼합비가 다른 5종의 복합물을 제조하였다.
- 3 ml를 차례로 가하여 혼합한 후 실온의 암실에서 40분간 반응시켜 시료 무첨가구를 대조로 하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 표준품으로써 각각 gallic acid 및 quercetin을 사용하여 얻은 표준 검량선에 따라 계산하였다.
- 이를 400× g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후, cell-based assay 완충액으로 세포를 2회 세척하였으며, 세포내로 유입되는 2-NBDG를 형광으로 측정하였다.
대상 데이터
- 2,2'-azinobis-(3-ethyl-benzo-thiazoline-6-sulfonate) (ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거활성은 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM 되도록 용해시켜 냉암소에서 12~16시간 반응시킨 후 415 nm에서 1.5~1.6의 흡광도로 조절된 ABTS 기질용액을 사용하였다.
- Ferric-reducing antioxidant potential (FRAP) 법에 의한 환원력은 300 mM acetate 완충용액(pH 3.6), 10 mM 의 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, Sigma-Aldrich Co.) 용액 및 20 mM FeCl3·6H2O 용액을 혼합한 기질용액을 37℃로 조정하여 사용하였다.
- , Maidstone, England) 회전식 진공증발농축기로 완전 건조시켰다. 돼지감자 농축액(60 brix)은 산청기능성콩영농조합법인에서 시판되는 것을 구입하여 사용하였다. 명월초, 여주 및 울금 추출물의 추출 수율은 물 및 70% 에탄올 추출 전·후 시료의 중량비(%)로 계산하였으며, 이때 수율은 명월초, 여주 및 울금의 물 추출물에서 각각 11.
- 돼지감자 복합물은 돼지감자 농축액에 명월초, 여주 및 울금 에탄올 추출물의 혼합비를 달리하여 Table 1과 같이 5종을 제조하였다.
- 인체 정상 간세포주인 Chang Liver (Chang) 및 생쥐 근육 세포주인 C2C12는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 penicillin (100 U/ml)/ streptomycin (100 μg/ml, Gibco)이 포함된 Dulbeco's modifide eagle medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균±표준편차로 표시하였고, 실험구별 유의성 검정은 Student t-test 및 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 유의수준 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests로 사후검정을 하였다.
이론/모형
- 조건 하에서 배양하였다. 세포독성 및 세포 생존율을 측정 하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Duchefa, Haarlem, The Netherlands)방법을 이용하였다. 세포 배양용 96-well plate에 1×104 cells/ml로 세포를 분주하고 시료액을 처리하였다.
- 시료 추출물 및 복합물의 총 페놀 함량은 Folin-Denis법[10]에 따라 시료액 1 ml에 Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)시약 및 10% Na2CO3용액을 각각 1 ml씩 차례로 가하여 5초간 혼합한 후 실온의 암실에서 1시간 반응시켜 시료 무첨가구를 대조로 하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 Moreno 등[40]의 방법에 따라 상기의 시료액 1 ml에 10% aluminum nitrate 0.
- Louis, MO, USA)시약 및 10% Na2CO3용액을 각각 1 ml씩 차례로 가하여 5초간 혼합한 후 실온의 암실에서 1시간 반응시켜 시료 무첨가구를 대조로 하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 Moreno 등[40]의 방법에 따라 상기의 시료액 1 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml, 1 M potassium acetate 용액 0.1 ml, 80% ethanol 4.3 ml를 차례로 가하여 혼합한 후 실온의 암실에서 40분간 반응시켜 시료 무첨가구를 대조로 하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 표준품으로써 각각 gallic acid 및 quercetin을 사용하여 얻은 표준 검량선에 따라 계산하였다.
성능/효과
- 1)Effective concentration values (EC50, μg/ml) were calculated from the regression lines using seven different concentrations(100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000 and 10,000 μg/ml) and their data were presented as 50% scavenging activity of DPPH and ABTS radical.
- 1,000 μg/ml의 농도에서 돼지감자 농축액의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 각각 36.15%, 27.79%였으며, 환원력은 90.11 μM FeSO4·7H2O이었다.
- 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D ribofuranoside (AICAR)는 AMPK 활성의 양성 대조물질로 사용되어 AICAR의 처리로 AMPK 활성이 증가됨을 볼 수 있었으며, 반면 compound C (CC)의 전처리로 AMPK 활성이 감소되었다.
- 5종의 복합물은 돼지감자 농축액에 비해 DPPH라디칼 소거활성은 1.1~2.0배, ABTS라디칼 소거활성은 2.4~2.7배, 환원력은 1.3~3.2배 증가되었는데, 특히 JA1의 활성이 유의적으로 높았다. 따라서 돼지감자 농축액에 명월초, 여주 및 울금 추출물의 혼합은 돼지감자 농축액의 항산화 활성 증대에 효과적이었으며, JA1의 활성이 우수한 것은 명월초의 활성에 기인된 결과로 해석된다.
- 9%에 불과하여 울금 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 월등히 높은 것으로 판단된다. ABTS 라디칼 소거활성은 물 추출물에서 명월초가 유의적으로 높았으며, 에탄올 추출물에서는 명월초와 울금의 활성이 비슷한 경향이었다. 여주는 물 추출물에 비해 에탄올 추출물의 EC50값이 2배 정도 많아 물 추출물의 활성이 더 높았으며, 울금은 에탄올의 활성이 물 추출물에 비해 유의적으로 높았다.
- 이들 복합물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 비교한 결과는 Table 3에 나타내었다. 돼지감자 농축액 자체의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 20.50 mg GAE/g 및 16.61 mg QE/g이었으며, 명월초, 여주 및 울금 추출물이 첨가된 복합물은 돼지감자 농축액에 비해 더 높은 함량이었다. 특히 복합물 JA1과 JA2의 총 페놀 함량은 31.
- 돼지감자 농축액(1,000 μg/ml)은 12.91%의 저해활성을 보인 반면, 복합물에서는 28.99~46.51%의 저해활성으로 특히 JA3의 활성이 유의적으로 높았다.
- 돼지감자 농축액에 비해 식물류의 에탄올 추출물이 혼합된 돼지감자 복합물에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 증가되었으며, 이에 따른 항산화 활성도 향상된 것으로 판단된다. 따라서 단일 시료의 추출물에 비해 여러 시료가 혼합된 복합물이 상대적인 유효물질의 함량 증가와 함께 생리활성의 안정화를 유지함으로써[30] 항산화 활성에 긍정적인 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D ribofuranoside (AICAR)는 AMPK 활성의 양성 대조물질로 사용되어 AICAR의 처리로 AMPK 활성이 증가됨을 볼 수 있었으며, 반면 compound C (CC)의 전처리로 AMPK 활성이 감소되었다. 돼지감자 복합물 처리구는 무처리구에 비해 세포 내 당 유입을 유의적으로 증가시켰는데, 특히, JA1은 무처리구에 비해 약 3.8배의 높은 활성을 보였다. 이는 양성 대조물질로 사용한 AICAR의 활성과도 유사한 수준이었다(Fig.
- 2배 증가되었는데, 특히 JA1의 활성이 유의적으로 높았다. 따라서 돼지감자 농축액에 명월초, 여주 및 울금 추출물의 혼합은 돼지감자 농축액의 항산화 활성 증대에 효과적이었으며, JA1의 활성이 우수한 것은 명월초의 활성에 기인된 결과로 해석된다.
- 따라서 본 연구에 사용된 돼지감자 복합물의 경우 최대농도인 100 μg/ml에서 상대적으로 다른 추출물에 비해 안전성이 확보됨으로서 실험동물 및 인체 적용 시 안전성의 장점이 있을 것으로 사료된다[29].
- 따라서 본 연구에서 돼지감자 복합물은 in vitro에서 항산화 및 α-glucosidase 저해활성이 확인되어 생체 내에서 혈당강하에도 효과적일 것으로 생각된다.
- 울금의 냉수, 열수 및 메탄올 추출물에서 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 메탄올 추출물에서 가장 높아 유기 용매에 용출되는 대부분의 물질이 페놀성 화합물이나 플라보노이드류이기 때문에 이들 물질의 함량과 항산화 활성간에 유의적 상관성이 성립된다고 보고되어 있다[45]. 따라서 본 연구에서도 명월초, 여주 및 울금의 항산화 활성이 시료 중의 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량에 의존적인 것으로 판단된다.
- 명월초, 여주 및 울금 추출물의 추출 수율은 물 및 70% 에탄올 추출 전·후 시료의 중량비(%)로 계산하였으며, 이때 수율은 명월초, 여주 및 울금의 물 추출물에서 각각 11.56%, 19.54% 및 13.73%였으며, 에탄올 추출물에서는 30.70%, 24.72% 및 11.95%였다.
- 물 추출물 중 명월초에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 많았으며, 에탄올 추출물에서는 울금에서 그 함량이 가장 많았다. 명월초와 여주 추출물에서 플라보노이드 함량은 총 페놀 함량에 대해 56.8~69.0%인 반면, 울금의 에탄올 추출물에서 플라보노이드 함량은 총 페놀 함량에 대해 1.6배 정도 많았다.
- 명월초의 물 및 에탄올 추출물은 시료량이 많아질수록 α-glucosidase 저해활성이 유의적으로 증가하였으며, 물 추출물은 5,000 μg/ml 이상, 에탄올 추출물은 2,000 μg/ml 농도에서 50% 이상의 저해활성을 보였다.
- 에탄올 추출물은 물 추출물에 비해 더 많은 함량이었으며, 여주는 추출 용매에 따른 차이가 적었다. 물 추출물 중 명월초에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 많았으며, 에탄올 추출물에서는 울금에서 그 함량이 가장 많았다. 명월초와 여주 추출물에서 플라보노이드 함량은 총 페놀 함량에 대해 56.
- DPPH 라디칼 소거활성은 여주 및 울금의 경우 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 유의적으로 높았으나, 명월초는 추출 용매에 따른 유의적인 차이가 없었다. 물 추출물에서는 명월초가 여주 및 울금에 비해 유의적으로 높았으나, 에탄올 추출물에서는 명월초와 울금의 활성이 비슷한 경향이었다. 특히 울금의 에탄올 추출물에서 EC50값은 물 추출물의 5.
- 세포에 독성을 나타내지 않은 시료의 농도로써 100 μg/ml의 돼지감자 복합물 유의적으로 증가시켰는데 처리구는 무처리구에 비해 모두 AMPK 활성이 증가되었다.
- 실험에 사용한 돼지감자 복합물은 1~100 μg/ml의 농도범위에서 독성을 나타내지 않았으며, JA1, JA2 및 JA5 처리구에서는 무처리구에 비해 오히려 세포 생존율이 유의적으로 증가되었다.
- 명월초, 여주, 울금의 물 및 에탄올 추출물에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 에탄올 추출물은 물 추출물에 비해 더 많은 함량이었으며, 여주는 추출 용매에 따른 차이가 적었다. 물 추출물 중 명월초에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 많았으며, 에탄올 추출물에서는 울금에서 그 함량이 가장 많았다.
- ABTS 라디칼 소거활성은 물 추출물에서 명월초가 유의적으로 높았으며, 에탄올 추출물에서는 명월초와 울금의 활성이 비슷한 경향이었다. 여주는 물 추출물에 비해 에탄올 추출물의 EC50값이 2배 정도 많아 물 추출물의 활성이 더 높았으며, 울금은 에탄올의 활성이 물 추출물에 비해 유의적으로 높았다. 환원력은 모든 시료의 EC50값이 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 1.
- 61 mg QE/g이었으며, 명월초, 여주 및 울금 추출물이 첨가된 복합물은 돼지감자 농축액에 비해 더 높은 함량이었다. 특히 복합물 JA1과 JA2의 총 페놀 함량은 31.58~32.25 mg GAE/g으로 타 복합물에 비해 유의적으로 높은 함량이었으며, 플라보노이드 함량은 JA2에서 가장 많았다.
- 세포에 독성을 나타내지 않은 시료의 농도로써 100 μg/ml의 돼지감자 복합물 유의적으로 증가시켰는데 처리구는 무처리구에 비해 모두 AMPK 활성이 증가되었다. 특히, JA1 처리구는 무처리구에 비해 63배 더 높았으며, JA2, JA3 및 JA4는 32~40배의 수준이었으나, JA5는 10배 수준으로 활성화된 AMPK의 발현 정도가 가장 낮았다(Fig. 4A). 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D ribofuranoside (AICAR)는 AMPK 활성의 양성 대조물질로 사용되어 AICAR의 처리로 AMPK 활성이 증가됨을 볼 수 있었으며, 반면 compound C (CC)의 전처리로 AMPK 활성이 감소되었다.
- 여주는 물 추출물에 비해 에탄올 추출물의 EC50값이 2배 정도 많아 물 추출물의 활성이 더 높았으며, 울금은 에탄올의 활성이 물 추출물에 비해 유의적으로 높았다. 환원력은 모든 시료의 EC50값이 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 1.9~2.2배 정도 높았으며, 특히 명월초의 에탄올 추출물에서 환원력이 다소 높은 경향이 었다.
후속연구
- 본 연구에서 돼지감자 복합물은 간세포에서 AMPK 활성화와 근육세포에서의 당 유입을 촉진함으로써 항당뇨 효과를 나타내는 것으로 판단되며, 상기의 돼지감자 복합물은 STZ에 의해 유도된 당뇨쥐에 4주간 급이 시 혈당강하 활성이 있었다는 보고[13]로 볼 때 AMPK 활성화를 통하여 항당뇨 활성이 확인된 명월초, 여주 및 울금이 혼합된 돼지감자 복합물은 돼지감자 농축액 단독의 항당뇨 활성에 시너지 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.
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