성능/효과

• 식품유해미생물에 대한 항균 활성은 효소활성측정을 통하여 선별한 1차 분리주 9종을 대상으로 조사하였다. KCTC 3624와 KCCM 40935의 B. cereus 2종에 대하여 항균 활성을 측정한 결과 9종의 선별 균주 모두 유해미생물에 대하여 항균 활성을 갖고 있었으며, 분리주 중에서도 SBB07, SBB11, SBBJ43, SBBJ56, SOD62 등 5종이 B. cereus에 대하여 우수한 항균 활성을 지니고 있었다(Table 1). 따라서 앞서 선발한 9종의 분리주는 식품 유해미생물에 대해 항균 활성을 모두 지니므로 식품내 부패균의 증식을 억제하여 식품 보존 및 유통과정에서의 산업적 적용이 가능한 분리주로 활용성이 높음을 확인하였다.
• 유산균이 식품과 함께 섭취 시 프로바이오틱스로서의 효과를 나타내기 위해서는 소화액 수준인 pH 3 이하의 낮은 pH조건과, 장내 담즙산의 농도보다 고농도의 담즙산이 함유된 배지에서 생장 수 있는 조건이 요구되어야 한다[10]. SBB07의 내산성 조사 결과 초기 접종 균수와 비교하였을 때 pH 3까지는 전혀 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, pH 2에서 약 14%가 감소하였지만 약 86%의 생육이 가능함을 나타내었다(Fig. 3A). 일반적으로 프로바이오틱스 생균의 주요 사멸 원인은 낮은 pH이며, Lactobacillus 균주는 일반적으로 1% 내외의 생존율을 보이지만 L.
• 따라서 분리주를 대상으로 전구체 히스티딘과 티로신이 포함된 액체 배지에 선별 균주 5종을 접종 및 배양하여 분리주가 생성한 히스타민, 티라민의 함량을 HPLC로 측정하였다(Table 1). SBB11, SBBJ56, SOD62 분리주 3종에서는 바이오제닉 아민이 검출은 되었지만 정량이 되지 않는 매우 낮은 수치로 검출되었으며, SBB07, SBBJ43의 2종의 분리주에서는 히스타민과 티라민이 모두 검출되지 않은 것을 확인하였다. 식품내 히스타민과 티라민은 약 100 mg 이상을 섭취해야 중독 증상을 일으킬 수 있다고 보고되고 있어[4] 정량은 되지 않았지만 검출이 된 3종의 분리주도 모두 유해한 수준은 아님을 확인하였다.
• Lactobacillus 계열의 미생물은 다른 종류의 미생물에 비해 내열성이 가장 약한 것으로 보고되고 있으며[5], 생균의 제품 가공 처리 공정이 보통 60~80℃에서 이뤄지기 때문에 펠렛화 공정과 같이 균주가 유산균일 경우 특히 내열성에 대한 고려가 필요하다. 결론적으로 SBB07은 유산균 제제의 제품화에 가장 큰 문제점이 되는 안정성과 보존성이 우수하며, 이로 인해 급격한 활력 저하와 사멸율에 대해 유리한 프로바이오틱스 소재로 활용 가능함을 확인하였다.
• 05), oligofructose와 같은 짧은 사슬의 프리바이오틱스에서는 더 빨리 발효가 이루어진다는 보고와 일치하는 것을 확인하였다[17]. 결론적으로 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 SBB07은 세포외 효소 및 항균 활성이 우수하며, 내담즙, 내산성, 내열성 및 항생제 내성을 지니고 있고, GOS와 같은 프리바이오틱스 기질 이용 능력도 우수한 프로바이오틱스 소재로 활용 가능성이 높은 균주로 판단된다.
• 5로 설정하였으며, gap penalty 5, K-tuple size 2, top diagonals 4, window size 4로 설정하였다. 그 결과 SBB07 (1302 bp)는 Lactobacillus brevis ATCC 367 (NC 008497)과 99% 의 상동성을 나타내었다. 염기서열을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하기 위해 evolutionary distances의 추론은 maximum composite Likehood 방법을 모델로 사용하였다(Fig.
• 항산화제는 식용 유지나 지방질 식품의 가공 및 저장 중 산화로 인한 산패, 냄새, 풍미의 변화, 변색의 방지를 위해 free radical에 전자를 공여하는 식품 내 지방질 산화를 억제하는 역할을 하며[12], 인체 내 산소 free radical 반응이 생체 조직의 노화나 질병에 영향을 주는데 다양한 페놀성 물질들은 이러한 free radical 소거능이 우수하여 노화나 질병 예방하는데 중요한 역할을 한다[26]. 따라서 DPPH를 이용하여 분리주의 항산화 활성을 측정한 결과(Fig. 1) 선별 균주 중 SBB07, SBBJ56, SOD62이 15% 이상의 DPPH 활성을 나타냈으며, SBB07이 24.25%로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다.
• 따라서 최종 선별 균주 SBB07에 대한 항생제 감수성을 조사한 결과 amoxicillin/clavulanic acid, doxycycline, erythromycin에 대하여 생육이 억제됨을 확인하였고, amikacin, cephalothin, cipro-floxacin, colistin, lincomycin, kanamycin, norfloxacin, strep-tomycin, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole 계열의 항생제에 대하여는 내성을 지니고 있음을 확인하였다(Table 3). 따라서 SBB07 균주를 사용하여 프로바이오틱스 제품 개발 시 다양한 항생제와 병행하여 사용 가능하며, 장내에 존재하는 항생물질에 강한 내성을 지니게 되므로, 동일한 종의 타 균주 보다 우수한 항생제 내성을 보유하는 기능성 프로바이오틱스로 판단된다.
• 식품내 히스타민과 티라민은 약 100 mg 이상을 섭취해야 중독 증상을 일으킬 수 있다고 보고되고 있어[4] 정량은 되지 않았지만 검출이 된 3종의 분리주도 모두 유해한 수준은 아님을 확인하였다. 따라서 선별한 균주 5종을 대상으로 효소 활성, 항균 활성, 항산화 활성 등의 조사결과와 바이오제닉 아민 분석결과를 비교하였을 때 SBB07의 활성이 가장 우수하고 다양한 식품 분야에 적용이 가능하기 때문에 최종 선별 균주로 SBB07을 선택하였다.
• cereus에 대하여 우수한 항균 활성을 지니고 있었다(Table 1). 따라서 앞서 선발한 9종의 분리주는 식품 유해미생물에 대해 항균 활성을 모두 지니므로 식품내 부패균의 증식을 억제하여 식품 보존 및 유통과정에서의 산업적 적용이 가능한 분리주로 활용성이 높음을 확인하였다.
• 따라서 앞서 선별한 42종의 분리주를 대상으로 protease, cellulase, β-glucosidase 3종에 대한 세포외 효소활성을 측정하였고, 분리주 중 9종에서 protease, cellulase 및 β-glucosidase 3가지 효소를 모두 생성하는 것을 확인하였다(Table 1).
• 특히 vancomycin에 대한 저항성은 많은 유산균의 본질적 특성이며, erythromycin과 tetracycline에 대한 저항성은 균주에 따라 다양하고, 사람의 경우 약이나 식품에 항생제가 들어있어서 섭취한 프로바이오틱스 유산균은 항생제와 쉽게 접촉하게 되므로 항생제에 대한 내성이 강할수록 생존 가능성이 높아 장관 내 증식하여 유용한 기능성을 발휘할 수 있다고 알려져 있다[11]. 따라서 최종 선별 균주 SBB07에 대한 항생제 감수성을 조사한 결과 amoxicillin/clavulanic acid, doxycycline, erythromycin에 대하여 생육이 억제됨을 확인하였고, amikacin, cephalothin, cipro-floxacin, colistin, lincomycin, kanamycin, norfloxacin, strep-tomycin, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole 계열의 항생제에 대하여는 내성을 지니고 있음을 확인하였다(Table 3). 따라서 SBB07 균주를 사용하여 프로바이오틱스 제품 개발 시 다양한 항생제와 병행하여 사용 가능하며, 장내에 존재하는 항생물질에 강한 내성을 지니게 되므로, 동일한 종의 타 균주 보다 우수한 항생제 내성을 보유하는 기능성 프로바이오틱스로 판단된다.
• 최근 프로바이오틱스 균주와 프리바이오틱스를 함께 처리하는 신바이오틱스 제제가 개발되고 있는 추세이며, 프로바이오틱스 균주를 활용한 제제와 비교해 증식 및 장내 정착 능력이 더욱 우수한 것으로 밝혀졌다[2]. 따라서 최종 선별 균주 SBB07의 프리바이오틱스 기질 이용 능력을 조사하기 위해 프리바이오틱스 기질원으로써 glucose, xylitol, D-tagatose, inulin, lactitol, lactulose, frutooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS) 등의 8가지를 이용하여 24시간 동안 균의 생장율을 측정한 결과(Fig. 4), GOS에서 glucose 대비 O.D 1.27로 가장 높은 성장률을 나타내었고, 다음으로 FOS와 inulin 순으로 높게 측정되었다. 하지만 lactitol, lactulose, tagatose, xylitol에서는 O.
• 또한 발암 효소로 알려진 β-glucuronidase의 경우 benzopyrene과 같은 독성물질이 체내 들어왔을 때, 간에서 gluculonic acid와 결합되어 그 독성이 증가하며, 결합된 물질이 소장에서 담즙과 함께 장내배설되어 장내 세균의 β-glucuronidase에 의해 탈포합 되면서다시 독성이 생길 수 있기 때문에[7] 프로바이오틱스 유산균으로 사용되기 위해서는 활성이 낮은 균주가 바람직하며 SBB07의 경우 10 nmole 이하로 활성이 미약하여 프로바이오틱스균주로 인한 발암 유발의 위험이 없음을 확인하였다(Table 2).
• 3B), 일반적으로 내산성을 보인 균주는 십이지장에서 분비되는 비교적 산성이 강한 담즙에도 역시 내성을 나타내는 특성을 지닌다는 보고와 일치하는 결과를 얻었다[31]. 분리 균주의 내열성은 MRS broth 배지에 분리 균주 SBB07을 접종 후 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 80℃에서 10분간 정치 후 생존하는 수를 측정한 결과 60℃에서도 약 113% 생존율을 보여 매우 높은 내열성을 나타내었다(Fig. 3C). Lactobacillus 계열의 미생물은 다른 종류의 미생물에 비해 내열성이 가장 약한 것으로 보고되고 있으며[5], 생균의 제품 가공 처리 공정이 보통 60~80℃에서 이뤄지기 때문에 펠렛화 공정과 같이 균주가 유산균일 경우 특히 내열성에 대한 고려가 필요하다.
• 1N HCl (Sigma-aldrich))로 조정한 MRS broth에 균주를 접종(106 CFU/ml)하여 30분 정치 후 시료를 회수하여 생균수를 측정하였다. 생존율은 대조구와 비교하여 생균수가 증가한 실험구를 내산성을 가진 것으로 평가하였다. 내담즙성 평가는 Oxgall (Sigma-aldrich)을 0, 0.
• brevis 는 높은 내산성을 지닌다는 보고와 일치하는 결과를 얻었다[28]. 인공 담즙에 대한 저항성은 장내 담즙 농도(0.3%)보다 높은 oxgall이 0.5% 함유된 배지에서 약 54%, 1.0% 함유된 배지에서는 약 46%가 생육한 것을 확인하여 내담즙성 또한 우수한 것을 확인하였고(Fig. 3B), 일반적으로 내산성을 보인 균주는 십이지장에서 분비되는 비교적 산성이 강한 담즙에도 역시 내성을 나타내는 특성을 지닌다는 보고와 일치하는 결과를 얻었다[31]. 분리 균주의 내열성은 MRS broth 배지에 분리 균주 SBB07을 접종 후 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 80℃에서 10분간 정치 후 생존하는 수를 측정한 결과 60℃에서도 약 113% 생존율을 보여 매우 높은 내열성을 나타내었다(Fig.
• 최종 선별한 SBB07의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 이용하여 BLAST search 결과 Lactobacillus brevis로 판명되었으며, Eztaxon serve에서 표준 균주와 상동성을 비교 분석하였다. Sequence alignment 분석에 사용한 parameter 및 option 값은 protein weight matrix로 Gonnet series를 사용하였고, gap opening 15, gap extension 6.