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문제 정의
- 본 연구에서는 구강미생물에 대한 인도감나무 줄기 추출물의 항균활성과 바이오필름 생성 억제 효과를 조사하여 천연물 유래 구강건강소재로써 인도감나무 줄기 추출물의 이용 가능성을 알아보고자 한다.
가설 설정
- b: no growth on test medium. c: slow growth on test medium.
- b: no growth on test medium. c: slow growth on test medium. d: non-detection.
제안 방법
- 2 mg/ml였다. P. gingivalis ATCC33277에 대한 추출물의 MIC인 0.4 mg/ml 및 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 배양한 결과 0.4 mg/ml 및 그 이상의 농도에서 colony를 관찰할 수 없었으므로 P. gingivalis ATCC33277의 MBC는 0.4 mg/ml로 결정하였다. 그러나 S.
- P. gingivalis ATCC33277와 S. mutans ATCC25175에 대한항균활성이 다른 추출물에 비해 우수한 인도감나무 줄기 추출물의 최소성장억제 농도와 최소살균농도를 측정하였다(Table 1). 추출물은 P.
- 5 mM dNTP 4 ul, oligo- dT (100 pmol/ul) 1 ul, RNase inhibitor (4 unit/ul) 2 ul, M-MLV reverse transcriptase (5 unit/ul) 2 ul를 반응시켜 합성하였다. RT-PCR은 AccuPower premixⓇ (Bioneer, Daejon, Korea)를 사용하여 95℃에서 5분, 94℃에서 30초, 62℃에서 2분씩 30 cycle을 반복한 다음 72℃에서 10분 동안 수행하였고 유전자의 발현양상은 PCR product를 1.0% agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.
- 구강미생물에 대한 추출물의 항균활성은 agar diffusion method [7]에 따라 추출물의 농도가 1 mg/disc인 paper disc (8 mm diameter, ADVANTEC, Tokyo, Japan)를 P. gingivalis ATCC33277와 S. mutans ATCC25175가 도말된 고체배지에 얹어 배양한 다음 paper disc 주위에 나타난 clear zone의 크기를 측정하여 조사하였다.
- 0 mg/ml 농도로 추출물을 처리한 다음 각각의 배양조건에 따라 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며 각 균주의 증식이 나타나지 않는 최소 농도를 최소성장억제농도로 정하였다. 구강미생물에 대한 추출물의 항균효과가 살균작용에 의한 것인지 정균작용에 의한 것인지 확인하기위해 최소성장억제농도로 확인된 추출물 농도로부터 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 도말하였으며 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 다음 균수의 99.9%가 사멸된추출물의 농도를 최소살균농도(minimal bactericidal concen-tration, MBC)로 정하였다.
- 25% safranin으로 20분 동안 염색하였다. 바이오필름 생성 억제능은 safranin에 염색된 바이오필름을 70% 에탄올에 용해한 후 575 nm에서 spectrophotometer (Softmax M5, Molecular Devices, USA)로 흡광도를 측정하여 확인하였다.
- mutans ATCC25175에 대한 항균활성이 우수하였다. 양성 대조구로 사용한 chlorhex-idine, sodium lauryl sulfate와 triclosan은 시판되고 있는 구강케어제품에서 각각 0.1%, 0.2%와 0.3%의 농도로 사용되고 있으며 본 실험에서는 인도감나무 줄기 추출물과 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan의 항균활성을 1 mg/disc의 농도에서 비교하였다. 그 결과 인도감나무 줄기 추출물은 S.
- 추출물이 S. mutans의 바이오필름 형성 관련 유전자 발현에 미치는 영향은 comC 유전자(Forward: 5‘-GACTGATGAATT AGAGATTATCATTGG-3’, Reverse: 5‘-TTTCCCAAAGCTT GTGTAAAACT-3’)와 comX 유전자(Forward: 5’-GGTTCTA CAATTTCACCTTTACCT-3’, Reverse: 5’-GCTGGCCGGCCC ACTTTTTGGGAAGGCAAAG)를 primer로 이용한 RT-PCR로 확인하였으며 그 결과는 Fig. 3에 나타내었다.
- 6). 희석된 배양액에 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0 mg/ml 농도로 추출물을 처리한 다음 각각의 배양조건에 따라 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며 각 균주의 증식이 나타나지 않는 최소 농도를 최소성장억제농도로 정하였다. 구강미생물에 대한 추출물의 항균효과가 살균작용에 의한 것인지 정균작용에 의한 것인지 확인하기위해 최소성장억제농도로 확인된 추출물 농도로부터 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 도말하였으며 37℃에서 24시간 동안 혐기배양한 다음 균수의 99.
대상 데이터
- 구강미생물에 대한 추출물의 항균활성을 알아보기 위해 사용된 균주는 그람음성균인 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277와 그람양성균인 Streptococcus mutans ATCC25175로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. P.
- mutans ATCC25175는 brain-heart infusion agar (BHIA; BD, Franklin Lakes, USA)에 계대한 다음 37℃에서 혐기배양하였다. 실험에 사용된 추출물은 네팔, 라오스, 몽골, 방글라데시, 베트남, 중국 등지에 자생하는 200여 종의 약용작물에서 추출한 메탄올 추출물이며 한국생명공학연구원 해외생물소재센터(KRIBB, Daejeon, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
- 양성 대조구로는 구강케어제품에 사용되고 있는 chlorhexidine (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), so-dium lauryl sulfate (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), triclosan (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 5회 이상 반복실험을 수행하여 얻어진 결과이며 실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan’s 다중검정법으로 p<0.05 수준에서 통계적 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 인도감나무 줄기 추출물이 P. gingivalis ATCC33277와 S. mutans ATCC25175의 바이오필름 형성에 미치는 영향은 Zhou 등[29]의 방법을 이용하여 조사하였다. 바이오필름의 양적 분석방법은 Zhou 등[29]과 Stepanovic 등[27]의 방법이 많이 사용되고 있으나 세균 종에 따른 분석방법은 아직 정립되지 않았기 때문에 바이오필름을 생성하는 세균 종에 따른 다양한 분석 방법의 정립이 필요하다[4, 18].
- 추출물의 최소성장억제 농도(minimal inhibitory concen-tration, MIC)는 액체 배지 희석법을 이용하여 알아보았다[11]. 구강미생물인 P.
- 추출물이 P. gingivalis ATCC33277와 S. mutans ATCC25175의 바이오필름 생성에 미치는 영향은 Zhou 등[29]의 방법을 이용하여 조사하였다. 구강미생물은 고체배지에 도말하여 24시간 동안 혐기배양한 다음 액체배지에 현탁하여(O.
- 추출물이 구강 미생물의 바이오필름 생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향은 Li 등[16]과 Cramton 등[4]의 방법을 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)으로 확인하였다. Total RNA는 액체배지에 현탁한(O.
성능/효과
- 바이오필름의 양적 분석방법은 Zhou 등[29]과 Stepanovic 등[27]의 방법이 많이 사용되고 있으나 세균 종에 따른 분석방법은 아직 정립되지 않았기 때문에 바이오필름을 생성하는 세균 종에 따른 다양한 분석 방법의 정립이 필요하다[4, 18]. P. gingivalis ATCC 33277와 S. mutans ATCC25175 배양액에 추출물을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0 mg/ml 농도로 처리하였을 때, P. gingivalis ATCC33277 배양액에서는 바이오필름이 생성되었지만(data not shown) S. mutans ATCC25175에서는 바이오필름 생성이억제되는 것을 확인할 수 있었다. 추출물이 0.
- 3에 나타내었다. RT-PCR로 추출물(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/ml) 농도에 따른 comC와 comX 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, S. mutans ATCC2 5175의 comC 유전자 발현은 추출물의 농도에 따라 큰 변화가 없었지만 comX 유전자 발현은 추출물의 농도가 높아질수록 감소하는 경향을 나타내었고 1.0 mg/ml 농도의 추출물과 함께 S. mutans ATCC25175를 배양했을 때 추출물을 처리하지 않고 배양한 S. mutans ATCC25175에 비해 comX 유전자 발현이 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. comX 유전자는 comC, D, E 유전자와 함께 S.
- 3%의 농도로 사용되고 있으며 본 실험에서는 인도감나무 줄기 추출물과 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan의 항균활성을 1 mg/disc의 농도에서 비교하였다. 그 결과 인도감나무 줄기 추출물은 S. mutans ATCC25175에 대해 양성대조구로 사용한 chlorhex-idine, sodium lauryl sulfate, triclosan과 유사한 항균활성을 나타내었다(Fig. 1). 따라서 인도감나무 줄기 메탄올 추출물은 양성대조구인 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan과 비교될 수 있는 우수한 항균활성을 가진 천연물유래 구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단된다.
- 4 mg/ml로 결정하였다. 그러나 S. mutans ATCC25175에 대한 추출물의 MIC 인 0.2 mg/ml 및 그 이상의 농도에 해당하는 배양액을 고체배지에 배양한 결과 0.2 mg/ml 및 그 이상의 농도에서 모두 colony를 관찰할 수 있었다. 따라서 인도감나무 줄기 추출물은 P.
- 네팔, 라오스, 몽골, 방글라데시, 베트남, 중국 등지에 자생하는 200여 종의 약용작물로부터 추출한 메탄올 추출물의 P. gingivalis ATCC33277와 S. mutans ATCC25175에 대한 항균활성을 측정한 결과, 200여 종의 추출물 중 인도감나무(Diospyros malabarica) 줄기 추출물이 P. gingivalis ATCC33277와 S. mu-tans ATCC25175에 대해 가장 우수한 항균활성을 나타내었으며 P. gingivalis ATCC33277에 비해 S. mutans ATCC25175에 대한 항균활성이 우수하였다. 양성 대조구로 사용한 chlorhex-idine, sodium lauryl sulfate와 triclosan은 시판되고 있는 구강케어제품에서 각각 0.
- 따라서 인도감나무 줄기 추출물은 P. gingivalis ATCC33277에 대해서는 살균작용을 하고 S. mutans ATCC25175에 대해서는 정균작용을 하는 것으로 판단된다.
- mutans ATCC25175에 대한항균활성이 다른 추출물에 비해 우수한 인도감나무 줄기 추출물의 최소성장억제 농도와 최소살균농도를 측정하였다(Table 1). 추출물은 P. gingivalis ATCC33277에 비해 S. mutans ATCC 25175에 대해 높은 항균활성을 나타내었으며 P. gingivalis ATCC33277에 대한 추출물의 MIC는 0.4 mg/ml이였고 S. mu-tans ATCC25175에 대한 추출물의 MIC는 0.2 mg/ml였다. P.
- mutans ATCC25175에서는 바이오필름 생성이억제되는 것을 확인할 수 있었다. 추출물이 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0 mg/ml 농도로 처리된 배양액에서 S. mutans ATCC 25175의 바이오필름 생성율은 각각 87.9%, 33.5%, 31.3%, 27%, 24.7%, 18.3%로 추출물의 농도가 높아질수록 바이오필름 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었고 균주의 생육도 추출물의농도(0.2-0.8 mg/ml)가 높아질수록 억제되는 것을 확인할 수있었다(Fig. 2). 이는 식물추출물인 백질려 추출물의 농도가높아질수록 바이오필름 생성율이 감소한다는 백질려 추출물이 S.
후속연구
- 1). 따라서 인도감나무 줄기 메탄올 추출물은 양성대조구인 chlorhexidine, sodium lauryl sulfate, triclosan과 비교될 수 있는 우수한 항균활성을 가진 천연물유래 구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단된다.
- mutans의 항치아우식에 미치는 영향에 관한 Lee [14]등의 보고와도 일치하는 결과이다. 따라서 인도감나무 줄기추출물은 정균작용에 의해 S. mutans의 생육을 억제할 수 있을뿐만 아니라 바이오필름 생성도 억제할 수 있는 천연물유래구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단된다.
- mutans의 genetic competence에 필수적이며 comC, D, E, X 유전자 결손 돌연변이체는 비정상적인 바이오필름을 형성한다고 보고하였다[14]. 따라서 추출물의 처리 농도에 따라 comX 유전자의 발현이 감소하였으므로 인도감나무 줄기 추출물은 바이오필름 생성을 억제할 수 있는 천연물유래 구강건강소재로써 개발 가능성이 있다고 판단된다.
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