선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 귀리의 볶음 공정 이후 메탄올(methanol), 발효주정, 물 추출물을 제조하여 아베난쓰라마이드를 포함한 폴리페놀 함량의 변화를 볶음 시간과 온도 별로 비교하고, 항산화 효능을 비교 분석하고자 하였다. 이를 통해 아베난쓰라마이드와 그밖의 생리활성 성분이 많이 함유된 귀리의 적정 볶음 조건을 탐색하고 이를 차 등의 개발에 이용하고자 한다.
가설 설정
- 2)ND, Not detected.
제안 방법
- DPPH 라디칼을 이용한 분석법으로, DPPH 용액(0.2 mM) 1 mL을 볶음귀리 추출물 50 µL과 혼합하여 상온에서30분간 반응시켰다.
- 귀리의 볶음처리 이후 외형변화 관측을 위해서 길이, 폭, 두께,수분함량, 백립중을 측정하였다(Table 1). 귀리 알곡의 길이는 열을 가한 이후 대조군 9.
- DCFH-DA (25 µM)을 추가로 1시간 처리한 후, 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하였다.그 다음으로 1 mM의 삼차뷰틸 하이드로과산화물(tert-butyl hydro-peroxide, t-BHP)를 세포에 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였으며, 1시간 이후 형광을 485/530 nm (excitation/emission) 파장에서 측정하여 세포 내 ROS 생성량을 분석하였다.
- 2 mM) 1 mL을 볶음귀리 추출물 50 µL과 혼합하여 상온에서30분간 반응시켰다. 반응물은 96-well plate로 옮긴 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 라티칼 제거능을 구하였으며, 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 사용하여 비교 분석하였다. 결과는 mg 트롤록스 당량 산화방지능(Trolox eqvivalent antioxidant capacity, TEAC)/g 추출물으로 표기하였다(18).
- 발색법을 이용하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼제거능을 측정하는 방법으로 볶음귀리 추출물의 항산화 효능을분석하였다.
- 정선된 귀리를 50 g 정량하여 볶음기(FEC-006, Biotech, Incheon, Korea)에 넣고 150, 200, 250℃에서 각 15, 30분간 볶음공정을 거쳤다. 볶아진 시료는 분쇄하여 5g씩 소분하고, 메탄올, 발효주정, 증류수를50 mL씩 가하여 24시간 실온에서 교반추출하였다. 추출물은 거름종이(Whatman, Maidstone, UK)로 침전물을 거른 후 질소농축기(Buchi, Flawil, Switzerland)로 추출용매를 제거하고 실험목적에맞게 재용해하여 분석에 사용하였다.
- 볶음공정을 통한 귀리의 외형변화 측정을 위하여 분쇄 전 형태의 볶음귀리를 이용하여 길이, 폭, 두께, 색도, 수분함량 등을측정하였다. 시료의 길이, 폭, 두께는 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo, Kawasaki, Japan)으로 측정하였으며, 10개 종실에 대한 평균값을구하였다.
- 색도는 색도는 색차계(CM-3500d, Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 헌터 값(Hunter’s value)인 명도(L-value), 적색도(a-value)와 황색도(b-value)를 측정하였다.
- 세포 내 항산화 활성을 측정하기 위한 목적으로, 볶음 귀리를간세포주인 HepG2 세포에 처리하고, t-BHP로 산화적 스트레스를 유발한 이후 세포 내 ROS 농도를 측정하였다(Fig. 1). t-BHP처리는 세포내 ROS 농도를 크게 증가시켰으며, 귀리의 메탄올추출물을 100 µg/mL 농도로 처리하였을 때 유의적으로 ROS 함량이 감소하여 산화적 스트레스로부터 세포 보호 효능이 있는 것을 확인하였다.
- 시료의 길이, 폭, 두께는 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo, Kawasaki, Japan)으로 측정하였으며, 10개 종실에 대한 평균값을구하였다. 수분함량은 수분함량분석계(Adam Equipment, Oxford, CT, USA)에 0.5 g의 원곡을 넣고 121℃로 가열하여 증발된 수분질량 값으로 도출하였다. 색도는 색도는 색차계(CM-3500d, Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 헌터 값(Hunter’s value)인 명도(L-value), 적색도(a-value)와 황색도(b-value)를 측정하였다.
- 볶음공정을 통한 귀리의 외형변화 측정을 위하여 분쇄 전 형태의 볶음귀리를 이용하여 길이, 폭, 두께, 색도, 수분함량 등을측정하였다. 시료의 길이, 폭, 두께는 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo, Kawasaki, Japan)으로 측정하였으며, 10개 종실에 대한 평균값을구하였다. 수분함량은 수분함량분석계(Adam Equipment, Oxford, CT, USA)에 0.
- Louis, MO, USA)을 DMSO에 녹여농도를 100 μg/mL로 만든 후 냉장보관하고, 이 용액을 희석하여농도가 25, 50, 75, 100 μg/mL가 되도록 표준용액을 만들었다. 이용액 일정량을 취하여 농도와 UPLC 상에서의 머무름 시간과 피크 면적과의 상관관계를 이용하여 보정선을 작성하였으며, 귀리농축물 g당 아베난쓰라마이드 함량을 산출하였다.
- 정량분석은 아베난쓰라마이드 표준물질 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 DMSO에 녹여농도를 100 μg/mL로 만든 후 냉장보관하고, 이 용액을 희석하여농도가 25, 50, 75, 100 μg/mL가 되도록 표준용액을 만들었다.
- 본 연구에서 사용된 귀리는 대양 품종으로, 국립식량과학원 중부작물부 시험포장인 수원에서 2016년 수확되었다. 정선된 귀리를 50 g 정량하여 볶음기(FEC-006, Biotech, Incheon, Korea)에 넣고 150, 200, 250℃에서 각 15, 30분간 볶음공정을 거쳤다. 볶아진 시료는 분쇄하여 5g씩 소분하고, 메탄올, 발효주정, 증류수를50 mL씩 가하여 24시간 실온에서 교반추출하였다.
- 질소농축기를 이용하여 농축한 추출물에다시 80% 에탄올 2mL을 넣어 재용해 하고 0.2 µm PVDF 필터로 여과한 후, UPLC로 분석하였다.
- 희석한 ABTS 반응 용액 1mL에 볶음귀리 추출물 50 µL를 첨가하여 60분간 반응시켰고, 734 nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 제거능을 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 귀리는 대양 품종으로, 국립식량과학원 중부작물부 시험포장인 수원에서 2016년 수확되었다. 정선된 귀리를 50 g 정량하여 볶음기(FEC-006, Biotech, Incheon, Korea)에 넣고 150, 200, 250℃에서 각 15, 30분간 볶음공정을 거쳤다.
- 분석 컬럼은 Acquity UPLC-HSS C18 (1.8 µm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MI, USA)이고 이동상은 A: 0.01 M 인산 완충용액(pH 2.8), B: 100% 아세토나이트릴을 이용하였다.
- 세포 내 ROS는 2', 7'-dichlorofluo-rescin diacetate (DCFA-DA) 형광 표지물질을 이용하여 측정하였다.
- 실험을 위한 HepG2 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서구매하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s 배지(Caisson, North Logan, UT, USA)에 10% 소태아혈청(Gendepot, Barker, TX, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Caisson, USA)을 첨가하여 배양하였다.
- 볶아진 시료는 분쇄하여 5g씩 소분하고, 메탄올, 발효주정, 증류수를50 mL씩 가하여 24시간 실온에서 교반추출하였다. 추출물은 거름종이(Whatman, Maidstone, UK)로 침전물을 거른 후 질소농축기(Buchi, Flawil, Switzerland)로 추출용매를 제거하고 실험목적에맞게 재용해하여 분석에 사용하였다.
- 상온에서 3분간 반응을 거친 후 생성된 청색의반응물을 96 well plate에 200 µL씩 옮기고 750 nm에서 흡광도를측정하여 함량을 구하였다. 표준물질로 갈산(gallic acid)이 사용되었으며, 결과값은 mg 갈산 당량(gallic acid eqvivalent, GAE)/g 추출물로 표기하였다. 플라보노이드(flavonoid) 함량 분석도 발색법을 이용하여 진행하였다.
데이터처리
- Correlation coefficients between cellular ROS level and other factors. Means of cellular ROS level were compared with the total polyphenol, flavonoid, avenanthramide, DPPH, and ABTS, respectively and correlation coefficients (CC) were obtained.
- 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 결과에 대한 유의성 검정은 GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 ANOVA 분석 하였고, Tukey test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 총 폴리페놀 함량 분석은 폴린시오칼토 페놀 시약(Folin-Ci℃alteu phenol reagent)을 이용한 발색법으로 측정하였다(15). 이를 위해서, 추출물 100 µL과 2% 탄산소듐 용액 2mL을 혼합 하고 상온에서 3분간 반응시켰다.
- 표준물질로 갈산(gallic acid)이 사용되었으며, 결과값은 mg 갈산 당량(gallic acid eqvivalent, GAE)/g 추출물로 표기하였다. 플라보노이드(flavonoid) 함량 분석도 발색법을 이용하여 진행하였다. 분석을 위해서 볶음귀리 추출물별 시료250 µL을 증류수 1 mL으로 희석하고, 75 µL의 5% 아질산소듐을첨가하여 상온에서 5분간 반응시켰다.
성능/효과
- 반면에 카테킨과 같은 일부 폴리페놀의 경우, 추출 효율이 극성 용매보다 물을 사용한 경우에 더 뛰어났다(25). Turkmen 등의 차 유래 폴리페놀 연구에서는 물 추출물이 100% 메탄올보다 폴리페놀의 추출 효율이 더 높았으며, 에탄올의 추출 효율은 물 추출물의 10% 미만 수준이었다. 반면에 50, 80% (v/v) 메탄올 또는 에탄올을 추출 용매로 사용한 경우, 100% 유기용매만을 사용한 실험군보다 폴리페놀 추출 효율이 높았다(26).
- t-BHP처리는 세포내 ROS 농도를 크게 증가시켰으며, 귀리의 메탄올추출물을 100 µg/mL 농도로 처리하였을 때 유의적으로 ROS 함량이 감소하여 산화적 스트레스로부터 세포 보호 효능이 있는 것을 확인하였다.
- 추출용매에 따라 폴리페놀의 함량의 차이가 있었으며 가장 추출 수율이 좋은 용매는 메탄올로 나타났다(Table 2). 대조군의 총폴리페놀 함량은 메탄올 77.0 mg GAE/g, 발효주정 11.0 mg GAE/g, 증류수 27.6 mg GAE/g으로 나타났다. 메탄올 추출물을 기준으로 볶음 온도와 시간이 증가할수록 총 폴리페놀의 농도가 증가함을 확인하였으며, 250℃, 30분 볶음 조건에서는 134.
- 따라서, DPPH 라디칼제거 활성은 ABTS에 비하여 페놀화합물 외의 항산화 성분에 더민감하게 작용한 것으로 분석되며, 볶음 귀리 추출물에서도 수용성 항산화 성분에 의해 DPPH 라디칼 제거 활성이 높게 나타났을 가능성이 있을 것으로 예측된다. 둘째, DPPH 라디칼 제거 활성은 추출물의 극성, 추출물의 구성물질, pH등에 영향을 받으며(35), ABTS 실험법에 비해 외적 요인에 민감하게 반응한다(36).특히, DPPH 라디칼 제거능 실험에 일반적으로 사용되는 메탄올용매는 수소원자와 강하게 결합하여 수소원자이동을 억제하지만,물은 그 결합을 해제하여 라디칼 제거 반응 속도를 향상시킨다.
- 첫째, Spirulina platensis 추출물의 항산화능을 평가한 실험에서도 유사한 결과가 보고된 바 있는데, 증류수 추출물에서 항산화 효능을 가진 색소단백질인 피코빌리단백질(phycobiliprotein)의 함량이 더 높게 나타났고, 이것이 DPPH 라디칼 제거에 더 뛰어난 활성을 보인 반면, ABTS 라디칼 제거 활성은 페놀화합물함량에 의존적인 결과를 나타내었다(34). 따라서, DPPH 라디칼제거 활성은 ABTS에 비하여 페놀화합물 외의 항산화 성분에 더민감하게 작용한 것으로 분석되며, 볶음 귀리 추출물에서도 수용성 항산화 성분에 의해 DPPH 라디칼 제거 활성이 높게 나타났을 가능성이 있을 것으로 예측된다. 둘째, DPPH 라디칼 제거 활성은 추출물의 극성, 추출물의 구성물질, pH등에 영향을 받으며(35), ABTS 실험법에 비해 외적 요인에 민감하게 반응한다(36).
- 또한, 볶음 귀리의 메탄올 추출물(100 µg/mL)을처리하였을 때, 볶음 온도 및 시간에 따라 ROS 농도가 낮아지는 경향을 보여, 250℃ 15분, 30분 처리군의 경우 일반 귀리와비교하여 유의적 수준으로 ROS를 낮췄으며, t-BHP를 처리하기이전의 정상세포 수준의 ROS 농도로 회복하였다.
- 6 mg GAE/g으로 나타났다. 메탄올 추출물을 기준으로 볶음 온도와 시간이 증가할수록 총 폴리페놀의 농도가 증가함을 확인하였으며, 250℃, 30분 볶음 조건에서는 134.7 mg GAE/g까지 증가하여 대조군 대비 74% 증가하였다. 이전 연구결과에따르면 귀리 추출물의 용매별로 폴리페놀 함량을 측정한 결과,메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone) 순으로 함량이 낮아졌고(23), 쌀을 이용한 Oki 등의 연구에서도 유사한 결과를 보인바 있어, 폴리페놀의 추출 효율은 용매의 극성에 비례하여 증가함을 시사하였다(24).
- 메탄올 추출물의 경우 볶음 온도 및 시간이 증가함에 따라DPPH 라디칼 제거능이 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며,대조군 9.3 mg TEAC/g에서 250℃, 30분 처리시 18.8 mg TEAC/g으로 2배 이상 향상되었다(Table 4). ABTS 라디칼 제거능 실험에서도 메탄올 추출물군은 볶음 온도와 시간에 비례하여 활성이증가하는 경향을 보였다.
- 7 mm로 감소하였으나 가열 온도 간의 차이는 보이지 않았다. 반면 귀리 알곡의 폭과 두께는 가열온도와 시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보여 볶음귀리는 대조군과 대비하여 길이가 짧고 폭과 두께가 두꺼워지는특징을 보였다. 수분함량은 대조군 6.
- 아베난쓰라마이드는 볶음처리 시, 추출량이 증가하는 경향을 보였지만 메탄올 추출물에서는 볶음 온도와 시간에 의존적으로 증가하지는 않았다(Table 3).반면, 발효주정과 증류수 추출물에서는 250℃ 볶음에서 아베난쓰라마이드 함량이 가장 높게 측정되었다. 총 폴리페놀을 비롯한유용 성분들이 볶음 처리 후, 추출량이 증가하는 현상은 가열공정에 의한 곡물 내부 구조의 변성과 내부공간 증대, 세포 구성성분간 결합력 파괴로 인한 고형물 추출량의 증가에 따른 결과로 해석되며(11) 이는 감국(27), 율무(28)등을 이용한 볶음 실험에서도 유사한 경향을 보였다.
- 27로 낮은 정의 상관관계를 보였다. 본 결과에서는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 세포내 ROS 제거에 미치는 영향이 큰 것으로 분석되며, 폴리페놀과 플라보노이드의 수산기는 ROS에 수소원자를 공여함으로써 안정화된 페녹시 라디칼(phenoxy radical) 중간생성물로 전환되며 이후의 라티칼 반응을 억제시키는 것으로 보인다(38). 즉,귀리 볶음 공정에 의해 증가된 폴리페놀 추출량은 t-BHP와 같이산화적 스트레스 유도제에 의해 비정상적으로 증가된 ROS를 효과적으로 제거하는데 관여한 것으로 보이며 이는 체내에서 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 억제 또는 예방하는 역할을 할수 있을 것으로 기대된다.
- 곡물의 볶음은 열이 동반되는 공정으로 물리화학적 특성을 변화시킨다. 본 연구에서는 외형적으로 크기의 변화가 관찰되었으며, 기존 귀리 볶음의 품질특성 연구에서도 볶음 후 장폭비가 감소하는 경향을 보였다(20). 또한 색의 변화도 관찰되었는데 이는 가열 과정에 의한 비효소적 갈색화 반응인 메일라드(Maillard) 반응 때문인 것으로 생각된다(21).
- 상관관계를 분석한 결과에서(Fig. 2) 세포내 ROS 함량은 추출물의 총 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라티칼 제거능, ABTS 라디칼 제거능과 −0.8 이상의 높은 부의 상관관계를나타내었으며, 아베난쓰라마이드 함량과는 0.27로 낮은 정의 상관관계를 보였다.
- 8% 범위로 감소하였으나 온도에 따른 변화는 나타나지 않았다.색도분석에서 명도를 나타내는 L값은 볶음 온도 및 시간이 증가할수록 감소하는 경향을 보였으며 이는 어두운 색에 가까워짐을의미한다. 적색 정도를 나타내는 a값은 200℃, 30분 볶음에서 13.
- 증류수 추출물에서의 DPPH 라디칼 제거 활성은 볶음 전 14.4 mg TEAC/g에서 250℃, 30분 볶음시 215.3 mg TEAC/g으로 약15배 증가하였으며, 메탄올과 발효주정 추출물과 비교하여 가장큰 활성을 보였다(Table 4). 특이적으로 DPPH 라디칼 제거 활성이 폴리페놀 함량이 높은 메탄올 추출물에 비해 증류수 추출물에서 더 높게 나타난 것은 다음의 요인들에 따른 현상으로 생각된다.
- 추출용매에 따라 폴리페놀의 함량의 차이가 있었으며 가장 추출 수율이 좋은 용매는 메탄올로 나타났다(Table 2). 대조군의 총폴리페놀 함량은 메탄올 77.
- 플라보노이드와 아베난쓰라마이드의 함량을 용매별로 측정하고 비교한 결과에서(Table 2, 3), 플라보노이드는 메탄올과 발효주정 추출물의 함량이 유사한 수준이었으며, 메탄올 추출물을 기준으로 대조군 13.0 mg CE/g에서 250℃, 30분 볶음처리 시 29.3mg CE/g으로 유의성 있게 증가하였다. 아베난쓰라마이드는 볶음처리 시, 추출량이 증가하는 경향을 보였지만 메탄올 추출물에서는 볶음 온도와 시간에 의존적으로 증가하지는 않았다(Table 3).
후속연구
- 본 연구에서는 귀리의 볶음 공정 이후 메탄올(methanol), 발효주정, 물 추출물을 제조하여 아베난쓰라마이드를 포함한 폴리페놀 함량의 변화를 볶음 시간과 온도 별로 비교하고, 항산화 효능을 비교 분석하고자 하였다. 이를 통해 아베난쓰라마이드와 그밖의 생리활성 성분이 많이 함유된 귀리의 적정 볶음 조건을 탐색하고 이를 차 등의 개발에 이용하고자 한다.
- 본 결과에서는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 세포내 ROS 제거에 미치는 영향이 큰 것으로 분석되며, 폴리페놀과 플라보노이드의 수산기는 ROS에 수소원자를 공여함으로써 안정화된 페녹시 라디칼(phenoxy radical) 중간생성물로 전환되며 이후의 라티칼 반응을 억제시키는 것으로 보인다(38). 즉,귀리 볶음 공정에 의해 증가된 폴리페놀 추출량은 t-BHP와 같이산화적 스트레스 유도제에 의해 비정상적으로 증가된 ROS를 효과적으로 제거하는데 관여한 것으로 보이며 이는 체내에서 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 억제 또는 예방하는 역할을 할수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.