[논문]핵산합성 억제제인 decitabine과 NF-κB 활성 저해제인 PDTC의 병용 처리에 의한 인체 위암세포사멸 효과 증진

최원경; 최영현

doi:10.5352/jls.2018.28.11.1268

핵산합성 억제제인 decitabine과 NF-κB 활성 저해제인 PDTC의 병용 처리에 의한 인체 위암세포사멸 효과 증진
Increased Apoptotic Efficacy of Decitabine in Combination with an NF-kappaB Inhibitor in Human Gastric Cancer AGS Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.11 = no.223, 2018년, pp.1268 - 1276

최원경 (김천대학교 스포츠재활학과) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실)

초록
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Cytidine analog decitabine (DEC)은 핵산 합성의 억제제로서 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 치료제로 사용되고 있다. 산화질소 합성에서 번역 단계를 억제하는 것으로 알려진 ammonium pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 $NF-{\kappa}B$의 대표적인 억제제이다. 본 연구에서는 인체 위암 AGS 세포를 대상으로 DEC와 PDTC의 병용 처리에 따른 세포증식 억제 기전을 조사하였다. 본 연구의 결과에 따르면 PDTC에 의한 AGS 세포의 증식 억제 효과는 DEC에 의해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였으며, 이는 G2/M기의 세포주기 정지 및 apoptosis 유도와 관련이 있었다. PDTC와 DEC의 병용 처리에 의한 세포 사멸의 유도는 DNA 손상 유도와 관련이 있음을 H2AX의 인산화 증가로 확인하였다. 아울러 PDTC와 DEC의 병용 처리는 미토콘드리아 막 전위의 파괴를 유도하고, 세포 내 활성산소종(ROS)의 생성과 Bax의 발현을 향상시키고, Bcl-2 발현을 감소시켰으며 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유출을 증가시켰다. 또한 PDTC과 DEC의 병용 처리는 외인성 및 내인성 apoptosis 개시 caspase에 해당하는 caspase-8과 caspase-9의 활성뿐만 아니라 caspase-3의 활성화와 PARP 단백질의 분해를 유도하였다. 결론적으로 본 연구의 결과는 PDTC와 DEC의 병용 처리가 DNA 손상을 유발하고, ROS 증가와 연계된 외인성 및 내인성 apoptosis 사멸 경로를 활성화시킴으로써 AGS 세포의 증식을 억제하였음을 의미한다.

Abstract ▼ AI-Helper

The cytidine analog decitabine (DEC) acts as a nucleic acid synthesis inhibitor, whereas ammonium pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) is an inhibitor of nuclear factor-${\kappa}B$. The aim of this study was to investigate the possible synergistic inhibitory effect of these two inhibitors on proliferation of human gastric cancer AGS cells. The inhibitory effect of PDTC on AGS cell proliferation was significantly increased by DEC in a concentration-dependent manner, and this inhibition was associated with cell cycle arrest at the G2/M phase and the induction of apoptosis. This induction of apoptosis by the co-treatment with PDTC and DEC was related to the induction of DNA damage, as assessed by H2AX phosphorylation. Further studies demonstrated that co-treatment with PDTC and DEC induced the disruption of mitochondrial membrane potential, increased the generation of intracellular reactive oxygen species (ROS) and the expression of pro-apoptotic Bax, and down-regulated the expression of anti-apoptotic Bcl-2, ultimately resulting in the release of cytochrome c from the mitochondria into the cytoplasm. Co-treatment with PDTC and DEC also activated caspase-8 and caspase-9, which are representative caspases of the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. Co-treatment also activated caspase-3, which was accompanied by proteolytic degradation of poly (ADP-ribose) polymerase. Taken together, these data clearly indicated that co-treatment with PDTC and DEC suppressed the proliferation of AGS cells by increasing DNA damage and activating the ROS-mediated extrinsic and intrinsic apoptosis pathways.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Antibodies used in the present study
그림 Fig. 1. Inhibition of cell viability and induction of apoptosis by co-treatment with PDTC and DEC in AGS gastric cancer cells.
그림 Fig. 2. Effects of PDTC and DEC on the cell cycle progression in AGS gastric cancer cells.
그림 Fig. 3. Generation of ROS and induction of DNA damage by co-treatment with PDTC and DEC in AGS gastric cancer cells.
그림 Fig. 4. Effects of combined treatment with PDTC and DEC on the MMP values and cytochrome c expression in AGS gastric cancer cells.
그림 Fig. 5. Activation of caspases and degradation of PARP by combined treatment with PDTC and DEC in AGS MCF-7 gastric cancer cells.
그림 Fig. 6. Effects of combined treatment with PDTC and DEC on the expression of apoptosis regulatory proteins in AGS gastric cancer cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 PDTC와 DEC의 병용 처리에 따른 apoptosis 및 DNA 손상의 증가가 미토콘드리아 기능 손상과 연계되어 있는지를 조사하기 위하여 MMP (Δψm)의 변화를 관찰하였으며, MMP의 소실은 미토콘드리아의 기능이 손상되었음을 나타내는 지표이다[10, 22].
반면에 미토콘드리아가 관여하는 intrinsic 경로는 세포질로 유출된 cytochrome c가 pro-caspase-9 및 apoptotic protease activating factor-1 등과 apoptosome을 형성하여 caspase-9와 caspase-3의 활성을 촉진시킴으로써 기질 단백질의 절단을 촉진하고 apoptosis를 종결하는 공동 경로로 유입된다[13, 31]. 따라서 apoptosis 유도의 핵심 기전인 caspase cascade의 활성이 PDTC와 DEC의 병용 처리 조건에서도 관여하는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 대표적인 extrinsic 및 intrinsic 경로의 개시 caspase에 해당되는 caspase-8 및 caspase-9를 포함한, 두 caspase의 활성에 의하여 활성이 증가되는 effector caspase에 해당되는 caspase-3의 활성 여부를 조사한 결과, PDTC 및 DEC의 단독 처리군에서는 이들 caspase의 활성을 의미하는 active form의 발현이 미비하거나 검출되지 않았으나, 병용 처리군에서는 active form 발현의 증가 또는 비활성 pro-form의 발현이 현저하게 감소되어 병용 처리군에서 단독 처리군에 비하여 3가지 caspase의 활성이 모두 증가되었음을 확인하였다(Fig.
비록 암세포의 증식 차단과 apoptosis 유발 수단으로 NF-κB의 활성 저해제 및 핵산 합성 저해제의 개발이 광범위하게 이루어지고 있으나, 이러한 표적 차단제는 정상세포에서의 세포 독성과 암세포의 저항성을 유발할 수 있어 암세포 증식 제어를 위한 약물로서 한계점을 가진다. 이러한 한계점을 극복하고 표적 치료제의 독성을 최소하면서 암세포 증식 억제 효능을 증진시키기 위한 수단을 발굴하기 위하여 본 연구에서는 인체 위암세포를 대상으로 PDTC와 DEC의 병용 처리 가능성을 조사하였다.

제안 방법

AGS 세포의 증식에 미치는 PDTC 및 DEC의 병용 처리 조건 설정을 위하여 먼저 AGS 세포의 증식에 미치는 PDTC의 영향을 조사하여 80% 정도의 생존력을 보이는 농도인 500 nM 을 설정하였다(data not shown). 아울러 DEC가 AGS 세포의 증식에 미치는 영향을 조사한 결과, 설정된 농도의 범위 내 (5-50 μM)에서 유의적인 증식억제 효과를 관찰할 수 없었다 (Fig.
Caspase의 활성 측정을 위하여 정상 및 PDTC와 DEC가 처리된 배지에서 48시간 배양된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 150 μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 100 μM이 함유된 extraction buffer 50 μl에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100 μl가 되게 하였다.
)를 처리하여 암실, 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. PBS로 두 번 수세 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.
PDTC 및 DEC의 병용 처리에 따른 AGS 세포 증식억제와 연관된 apoptosis 유도 과정에 ROS 생성이 관여하는지를 DCF-DA 염색을 통하여 조사하였다.
PDTC와 DEC 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유발여부를 확인하기 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 준비된 세포를 3.7% formaldehyde 용액을 처리하여 상온에서 10분 동안 고정하였다. 이들 세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 수세 후 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, SigmaAldrich Chemical Co.
PDTC와 DEC가 AGS 세포에 미치는 생존율을 조사하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 AGS 세포를 5×104cells/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 500 nM의 PDTC와 DEC를 적정농도(0-50 μM)로 처리하였다.
PDTC와 DEC의 병용 처리에 의한 apoptosis 유도 과정에 ROS의 생성이 관여하는지를 조사하기 위하여 fluorescent probe 인 2‘,7’-di-chlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA, Molecular Probes, Leiden, Netherlands) 염색을 이용한 flow cytometry (Becton Dickinson) 분석을 실시하였다.
고정된 세포들을 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 propidium iodide (PI, concentration, 50 μg/ml, Sigma-Aldrich Chemical Co.)와 10 kunit의 RNase A (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 처리하여 암실, 4℃에서 1시간 동안 염색하였다.
(Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin G는 Amersham Life Science에서 구입하였다. 동시에 미토콘드리아와 세포질 단백질을 분리하기 위해서는 Active Motif (Carlsbad, CA, USA)의 mitochondria isolation kit를 사용하였다.
한편, intrinsic apoptosis 경로의 활성은 미토콘드리아의 기능 손상에 따른 미토콘드리아의 내막과 외막 사이에 존재하는 대표적인 apoptosis 유도 인자인 cytochrome c의 세포질 방출이 필수적이다[11, 13]. 따라서 세포질과 미토콘드리아 분획 단백질을 이용한 immunoblotting을 수행하여 cytochrome c 의 분포에 미치는 PDTC와 DEC의 단독 및 병용 처리 효과를 비교하였다. Fig.
이를 위하여 PDTC와 DEC가 단독 또는 병합 처리된 AGS 세포를 모아 PBS로 수세 후, 10 μM의 JC-1 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 flow cytometer 에 적용시켜 MMP의 변화를 측정하였다.
5), 250 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride, 5 mM dithiothreitol]로 용해한 후, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Biosciences Co., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들(Table 1)은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
3A에 나타낸 바와 같이, PDTC와 DEC 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 ROS의 축적이 매우 증가되어 산화적 스트레스가 강하게 유발되었음을 알 수 있었다. 세포 내 산화적 스트레스는 미토콘드리아 기능의 교란과 연계된 핵산의 손상을 동반할 가능성이 매우 높기 때문에[25, 40] DNA 손상이 병용 처리군에서 증가 되었는지를 조사하였다. 이를 위하여 DNA 이중 나선 손상 지표인 γH2AX 단백질의 인산화(serine 139) [32, 33]에 미치는 PDTC와 DEC의 단독 및 병용 처리에 따른 영향을 조사하였다.
이상의 결과를 종합하면, 세포독성을 나타내지 않는 범위의 농도에서 DEC는 PDTC에 의한 AGS 세포 증식 억제를 유의적으로 촉진시켰으며, 이는 apoptosis 유도 효과의 증가와 연관성이 있었다. 아울러 PDTC와 DEC의 병용 처리는 단독 처리군에 비하여 산화적 스트레스를 향상시키면서 DNA 손상을 유도하였다. 또한 두 억제제의 병용 처리에 의한 산화적 스트레스는 미토콘드리아 기능 손상을 촉진하였을 것으로 추정되며 이로 인한 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유리 증가는 intrinsic apoptosis 신호 개시에 기여하였을 것이다.
) 용액(1 mg/ml)으로 염색하였다. 이들 세포를 PBS 및 증류수로 다시 세척한 다음 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
이를 위하여 DNA 이중 나선 손상 지표인 γH2AX 단백질의 인산화(serine 139) [32, 33]에 미치는 PDTC와 DEC의 단독 및 병용 처리에 따른 영향을 조사하였다.
이를 위하여 PDTC와 DEC가 단독 또는 병합 처리된 AGS 세포를 모아 PBS로 수세 후, 10 μM의 JC-1 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다.
이를 위하여 다양한 조건에서 배양된 세포들을 PBS로 수세 후 10 μM의 DCF-DA 용액으로 20분간 염색 후 flow cytometer를 적용시켜 ROS 값의 변화를 분석하였다.
실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-GluVal-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고 caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도에서 활성의 정도를 측정하였다.

대상 데이터

MMP를 측정하기 위해 dual-emission fluorescent dye인 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine lodide (JC-1, Amersham Biosciences Co.)을 사용하였다.
)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. PDTC와 DEC는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co.)에 녹여 stock 용액을 만들었다. PDTC와 DEC가 AGS 세포에 미치는 생존율을 조사하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 AGS 세포를 5×10⁴cells/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 500 nM의 PDTC와 DEC를 적정농도(0-50 μM)로 처리하였다.
, Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들(Table 1)은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin G는 Amersham Life Science에서 구입하였다. 동시에 미토콘드리아와 세포질 단백질을 분리하기 위해서는 Active Motif (Carlsbad, CA, USA)의 mitochondria isolation kit를 사용하였다.
본 실험에 사용한 인체 위암 AGS 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS, WelGENE Inc., Daegu, Republic of Korea) 와 L-glutamine (2 mM), streptomycin (100 mg/ml) 및 penicillin (100 U/ml)이 함유된 RPMI 1640 배지 (WelGENE Inc.)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. PDTC와 DEC는 Sigma-Aldrich Chemical Co.
Caspase의 활성 측정을 위하여 정상 및 PDTC와 DEC가 처리된 배지에서 48시간 배양된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 150 μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 100 μM이 함유된 extraction buffer 50 μl에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100 μl가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-GluVal-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고 caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도에서 활성의 정도를 측정하였다.
)를 성장배지로 희석하여 2 ml씩 분주하고 3시간 동안 반응시킨 다음 DMSO로 well에 생성된 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 실험에 사용된 초순수는 Milli-Q Water를 이용하였다.

데이터처리

모든 실험결과는 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 SigmaPlot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 Student t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

성능/효과

Fig. 3B의 Western blot 분석 결과에 의하면 γH2AX 단백질의 전체적인 발현에는 큰 변화 없이 PDTC와 DEC 단독 처리군에서 γH2AX 단백질의 인산화 정도가 대조군에 비하여 다소 증가되었으나, 병용 처리군에서는 더욱 증가되어 두 억제제의 단독 처리에 비하여 병용 처리군에서는 DNA 손상 유발이 증대되었음을 알 수 있었다.
따라서 PDTC와 DEC의 병용 처리에 따른 apoptosis 및 DNA 손상의 증가가 미토콘드리아 기능 손상과 연계되어 있는지를 조사하기 위하여 MMP (Δψm)의 변화를 관찰하였으며, MMP의 소실은 미토콘드리아의 기능이 손상되었음을 나타내는 지표이다[10, 22]. Fig. 4A에 나타낸 JC-1 염색에 의한 결과에 따르면, PDTC와 DEC의 단독 처리군에서 MMP의 소실이 각각 12.7% 및 8.3%로 대조군(5.9%)에 비하여 각각 2.2 및 1.4배 정도 증가된 반면, 두 저해제의 병용 처리군에서는 54.8%로 나타나 대준군에 비하여 9.3배 이상 증가되어 미토콘드리아 손상이 매우 증가되었음을 알 수 있었다.
따라서 세포질과 미토콘드리아 분획 단백질을 이용한 immunoblotting을 수행하여 cytochrome c 의 분포에 미치는 PDTC와 DEC의 단독 및 병용 처리 효과를 비교하였다. Fig. 4B의 결과에 의하면, PDTC 및 DEC의 단독 처리군에서 세포질에서의 cytochrome c의 발현이 대조군에 비하여 유사하거나 다소 증가하였음에 비하여, 병용 처리군에서는 매우 증가되었다. 아울러 미토콘드리아에서의 cyto-chrome c 발현은 PDTC와 DEC의 병용 처리군에서 거의 검출 되지 않아, 병용 처리군에서 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유리 현상이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다.
1A). 그러나 500 nM의 PDTC가 처리된 조건에서 DEC의 병용 처리 농도의 증가에 따라 AGS 세포의 증식이 DEC 처리 농도 의존적으로 감소되었으며(Fig. 1A), AGS 세포의 분지 형성과 부착력 상실과 같은 형태적 변화가 유발되었다(Fig. 1B). 이러한 PDTC 및 DEC의 병용 처리에 따른 AGS 세포의 증식 억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지를 조사한 결과, 전형적인 apoptosis가 유도된 세포에서 관찰되는 염색질의 응축 (chromatin condensation)에 의한 apoptotic body의 형성과 같은 핵의 형태적 변형이 PDTC 및 DEC 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 높은 빈도로 나타났다(Fig.
그리고 50 μM의 DEC 단독 처리군에서도 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가 다소 증가되었으나, PDTC 단독 처리군에서 비하여 변화의 정도가 상대적으로 낮게 나타났다.
Bcl-2 family에 속하는 단백질은 중, Bax를 포함한 pro-apoptotic 단백질이 Bcl-2와 같은 anti-apoptotic 단백질과 비교하여 상대적으로 발현이 증가하면 Bax가 미토콘드리아로 이동하여 MMP의 소실과 세포질로의 cytochrome c 방출을 유도하여 intrinsic apoptosis 경로의 활성을 촉진한다[11, 14] 아울러 Bcl-2 family에 속하는 pro-apoptotic BH3-interacting domain death agonist인 Bid는 extrinsic과 intrinsic 경로의 신호 전달 증폭에 관여할 수 있는데, 활성화된 caspase-8에 의하여 Bid가 활성형인 tBid (truncated form of Bid)로 전환하게 되면 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 방출을 촉진한다[9, 37]. 따라서 PDTC와 DEC 병용 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도에서 이들 Bcl-2 family 단백질의 발현 변화를 조사한 결과, Bcl-2의 발현은 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 현저하게 감소된 반면, Bax의 발현은 매우 증가 되었다(Fig. 6). 또한 Bid의 발현은 PDTC와 DEC 병용 처리군에서 단독 처리군에 비하여 현저한 감소를 보여 tBid로 전환되었을 가능성을 보여 주었다.
아울러 PDTC 및 DEC의 병용 처리군에서는 PDTC 단독 처리군에서와 유사한 경향성을 보여 주었다. 따라서 PDTC와 DEC의 병용 처리가 단독 처리에 비하여 AGS 위암세포의 증식 억제에 상승 효과를 보여주었으며, 비록 세포주기 특정 시기의 arrest 현상에 대한 증폭 효과는 미비하였으나, PDTC와 DEC의 병용 처리에 의한 AGS 세포의 증식 억제는 apoptosis 유발과 연관이 있음을 알 수 있었다.
3B의 Western blot 분석 결과에 의하면 γH2AX 단백질의 전체적인 발현에는 큰 변화 없이 PDTC와 DEC 단독 처리군에서 γH2AX 단백질의 인산화 정도가 대조군에 비하여 다소 증가되었으나, 병용 처리군에서는 더욱 증가되어 두 억제제의 단독 처리에 비하여 병용 처리군에서는 DNA 손상 유발이 증대되었음을 알 수 있었다. 따라서 PDTC와 DEC의 병용 처리에 따른 DNA 손상의 증가는 산화적 스트레스 및 apoptosis 유발의 증가와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
6). 또한 Bid의 발현은 PDTC와 DEC 병용 처리군에서 단독 처리군에 비하여 현저한 감소를 보여 tBid로 전환되었을 가능성을 보여 주었다. 한편 inhibitor of apoptosis protein (IAP) family에 속하는 단백질들은 caspase와의 직접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제하여 apoptotic 활성을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다[4, 24].
한편 inhibitor of apoptosis protein (IAP) family에 속하는 단백질들은 caspase와의 직접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제하여 apoptotic 활성을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다[4, 24]. 본 연구의 결과에 의하면 PDTC와 DEC가 함께 처리된 AGS 세포에서 IAP family에 해당되는 단백질들(XIAP, cIAP-1 및 cIAP-2)의 발현이 매우 감소되었으며(Fig. 6), 이러한 감소는 caspase의 활성 증가에 기여하여 apoptosis 유도를 촉진하였을 것으로 생각된다.
4B의 결과에 의하면, PDTC 및 DEC의 단독 처리군에서 세포질에서의 cytochrome c의 발현이 대조군에 비하여 유사하거나 다소 증가하였음에 비하여, 병용 처리군에서는 매우 증가되었다. 아울러 미토콘드리아에서의 cyto-chrome c 발현은 PDTC와 DEC의 병용 처리군에서 거의 검출 되지 않아, 병용 처리군에서 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유리 현상이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다. 따라서 이러한 병용 처리군에서 단독 처리군에 비하여 cytochrome c의 세포질로의 유출이 증가한 것은 MMP의 소실 증대와 직접적인 연관성이 있음을 의미한다.
1C). 아울러 세포주기 분포에서 apoptosis 유발을 의미하는 sub-G1기의 빈도가 PDTC 및 DEC 단독 처리군(각각 8.14% 및 5.18%)에서는 대조군(2.67%)에 비하여 낮은 수준으로 증가되었으나, 병용 처리군(21.31%)에서는 대조군에 비하여 약 8배 이상 증가되었다(Fig. 2).
5B). 아울러 활성화된 caspase-3의 기질 단백질로서 전형적인 apoptosis 유도 과정에서 분해가 관찰되는 PARP의 발현[7, 11]을 조사해 본 결과, 단독 처리군에서는 관찰되지 않았던 PARP의 단편화가 병용 처리군에서 매우 증가되어 PDTC와 DEC 병용 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도에는 caspase의 활성 증가가 관여하고 있음을 유추할 수 있다. 특히 PARP의 단편화는 산화적 스트레스에 의한 DNA damage 손상과도 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 [7], PDTC와 DEC 병용 처리에 의한 ROS의 발생 증가는 apoptosis 유도 촉진 인자로 작용할 가능성을 보여 주었다.
이러한 PDTC 및 DEC의 병용 처리에 따른 AGS 세포의 증식 억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지를 조사한 결과, 전형적인 apoptosis가 유도된 세포에서 관찰되는 염색질의 응축 (chromatin condensation)에 의한 apoptotic body의 형성과 같은 핵의 형태적 변형이 PDTC 및 DEC 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 높은 빈도로 나타났다(Fig. 1C).
5A). 이러한 각각의 caspase 활성의 정도를 정량적으로 평가하기 위하여 in vitro caspase 활성을 해당 caspase의 기질을 이용하여 조사한 결과에서도 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 그들의 활성이 유의적으로 증가되었음을 알 수 있었다(Fig. 5B). 아울러 활성화된 caspase-3의 기질 단백질로서 전형적인 apoptosis 유도 과정에서 분해가 관찰되는 PARP의 발현[7, 11]을 조사해 본 결과, 단독 처리군에서는 관찰되지 않았던 PARP의 단편화가 병용 처리군에서 매우 증가되어 PDTC와 DEC 병용 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도에는 caspase의 활성 증가가 관여하고 있음을 유추할 수 있다.
따라서 apoptosis 유도의 핵심 기전인 caspase cascade의 활성이 PDTC와 DEC의 병용 처리 조건에서도 관여하는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 대표적인 extrinsic 및 intrinsic 경로의 개시 caspase에 해당되는 caspase-8 및 caspase-9를 포함한, 두 caspase의 활성에 의하여 활성이 증가되는 effector caspase에 해당되는 caspase-3의 활성 여부를 조사한 결과, PDTC 및 DEC의 단독 처리군에서는 이들 caspase의 활성을 의미하는 active form의 발현이 미비하거나 검출되지 않았으나, 병용 처리군에서는 active form 발현의 증가 또는 비활성 pro-form의 발현이 현저하게 감소되어 병용 처리군에서 단독 처리군에 비하여 3가지 caspase의 활성이 모두 증가되었음을 확인하였다(Fig. 5A). 이러한 각각의 caspase 활성의 정도를 정량적으로 평가하기 위하여 in vitro caspase 활성을 해당 caspase의 기질을 이용하여 조사한 결과에서도 단독 처리군에 비하여 병용 처리군에서 그들의 활성이 유의적으로 증가되었음을 알 수 있었다(Fig.
이상에서 관찰된 PDTC 및 DEC의 병용 처리에 따른 AGS 세포 증식억제가 세포주기 진행에 어떤 영향을 주는지를 조사한 결과, 500 nM의 PDTC가 단독 처리된 AGS 세포에서는 대조군에 비하여 S 및 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가 다소 증가되었으며, 반면에 G1기의 빈도는 감소되었다(Fig. 2). 그리고 50 μM의 DEC 단독 처리군에서도 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가 다소 증가되었으나, PDTC 단독 처리군에서 비하여 변화의 정도가 상대적으로 낮게 나타났다.
이상의 결과를 종합하면, 세포독성을 나타내지 않는 범위의 농도에서 DEC는 PDTC에 의한 AGS 세포 증식 억제를 유의적으로 촉진시켰으며, 이는 apoptosis 유도 효과의 증가와 연관성이 있었다. 아울러 PDTC와 DEC의 병용 처리는 단독 처리군에 비하여 산화적 스트레스를 향상시키면서 DNA 손상을 유도하였다.

후속연구

비록 핵산 합성 및 NF-κB 신호계와 연계된 지속적인 연구가 요구되지만, 본 연구의 결과는 두 억제제의 독성을 최소화하면서 암세포 증식 제어를 위한 가능성을 보여준 것으로 항암제 병용 처리에 대한 근거 자료로서의 활용도가 매우 높을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	세포사멸은 어떤 역할을 하는가?	능동적 세포죽음의 대표적인 양식인 세포사멸(apoptosis)은 개체의 항상성 유지와 발생 과정에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 다양한 질환의 발병과 진행에 핵심적인 역할을 한다[11, 15]. 따라서 표적 질환 예방과 치료를 위한 apoptosis 조절 경로의 파악은 필수적인 연구 분야이다.
	decitabine는 어떤 기능을 하는 억제제 인가?	그 중 decitabine (5-aza-2'-deoxycytidine, DEC)은 cytidine 유도체로서 핵산 합성의 대표적인 억제제이다[1, 6]. DEC는 암 억제 유전자의 활성을 방해하는 demethylation을 저해하여 암 억제유전자가 정상적인 기능을 갖게 하는 hypomethylating agent의 일종으로[1, 35], 특정 혈액 세포가 기능을 못하는 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes)의 치료를 위해 개발된 약물이다. 비록 DEC는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)의 치료제로 널리 사용되고 있으나, 혈구 수의 감소를 포함한 다양한 부작용을 유발한다[6, 30, 39].
	암세포의 증식 제어를 위한 수단으로 개발되는 약물은 크게 어떻게 대별되는가?	암세포의 증식 제어를 위한 수단으로 개발되는 약물은 크게 핵산 생성의 저해와 세포 내 신호전달 교란 유도제로 대별될 수 있다. 그 중 decitabine (5-aza-2'-deoxycytidine, DEC)은 cytidine 유도체로서 핵산 합성의 대표적인 억제제이다[1, 6].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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