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문제 정의
- 최근 크리스퍼 유전자 가위 기술의 발달과 관심 증대로 전기천공을 이용한 단백질 전달연구가 다양한 세포 종에 대해 시도되고 있으나 미세조류에서의 체계적인 단백질 전달 연구는 미흡하다. 따라서 본 연구를 시작으로 미세조류 내 단백질 전달 연구를 체계적으로 접근하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 기 개발된 액적 접촉충전 기반의 디지털 전기천공 기술을 이용해 미세조류에 단백질을 전달하는 연구를 수행하였다. 보다 일관되고 안정적인 실험을 위해 기존 칩 제작 방법을 보완하여 3D 프린터를 이용한 칩 제작 방법을 도입, 기존 칩의 문제를 해결한 실험을 수행하였다.
- 하지만 이전 연구에서 사용한 칩 제작 방법의 문제점은 아크릴 구조를 이용해 오일을 담는 구조 제작 시 틈새로 오일이 새는 문제가 발생하는 것이었다. 본 연구에서는 이러한 오일 누유 문제를 해결하기 위해 칩의 제작 시 PDMS (Polydimethylsiloxane) 재질로 아크릴 구조물을 대체하였다. Fig.
- 본 연구에서는 크리스퍼 유전자 가위 기술을 디지털 전기천공 기술에 접목하기 위한 사전 연구로 디지털 전기천공을 이용한 미세조류 내 단백질 전달 연구를 수행 하였다. 대표적인 미세조류 종인 Chlamydomonas reinhardtii 중 세포벽이 존재하는 야생종 cc-125에 적용한 결과, 살아 있는 세포의 핵 내부로 형광 단백질 GFP가 10% 이상의 비교적 높은 효율로 전달될 수 있음을 확인하였다.
- 전달되는 물질의 크기에 따른 영향을 살펴보기 위해 단백질보다 크기가 매우 작고 세포핵 내부로의 전달 유무를 확실히 확인할 수 있는 DNA 형광 염료인 Yo-Pro-1을 이용한 실험을 병행함으로써 물질 크기에 따른 전달 특성 거동을 살펴보았다. 전기장의 크기 변화에 따른 단백질 전달 효율을 살펴봄으로써 최적의 단백질 전달을 위한 전기천공 조건을 도출하고자 하였다. 마지막으로 본 연구 결과의 의미 및 향후 활용방안에 대해서 논의하였다.
제안 방법
- Fig. 2의 결과로부터 디지털 전기천공을 이용해 살아 있는 세포에 Yo-Pro-1을 세포를 죽이지 않은 상태에서 세포 핵 내부까지 전달이 가능함을 확인하였으나 정량적으로 얼만큼의 효율로 세포 내 전달이 가능한 지에 대한 분석을 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 외부 물질의 전달 효율은 전체 세포 중 전달 물질을 받아 형광을 나타내는 세포의 수를 백분율로 정의하였으며 FACS를 통해 각각의 실험 조건 당 약 10,000개 세포를 분석하였다.
- 정상 세포는 Yo-Pro-1을 흡수하지 않기 때문에 외부 물질의 세포 내로의 전달 유무를 확인 하는 용도로도 사용되기도 한다[25]. Yo-Pro-1의 형광은 핵산과 결합 후 6 시간 이내에 사라지기 때문에 실험 당일 전기천공 후 곧바로 전달 유무 및 전달 효율을 측정하였다.
- 각 실험 조건 하에서의 외부 물질 전달 결과는 공초점 현미경과(LSM 700, ZEISS, Germany) 유세포분석기(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS, FACSVerse, BD)를 이용해 계측하였으며 세포의 생존도(cell viability)는 Propidium Iodide (PI, 1 μg/mL) 염색을 한 후 FACS를 통해 측정하였다.
- 단백질의 세포 내 전달 실험에 앞서, 우선 기존에 전기천공을 통해 세포 내부로의 전달이 가능함이 알려진 핵산 염색 물질인 Yo-Pro-1을 이용해 디지털 전기천공을 이용한 세포 내 물질 전달 특성을 살펴보았다. Fig.
- 실험에 사용된 단백질은 잘 알려진 Green Fluorescence Protein (GFP)를 사용하였으며 이렇게 형광 단백질을 이용하면 전기천공을 통해 세포 내로 전달 후 당일 바로 전달 유무 및 효율을 측정할 수 있는 장점이 있다. 단백질의 전달 효율 실험에서 전달 물질의 크기에 따른 영향을 살펴보기 위해 DNA를 염색하는데 활용되는 형광 염료인 Yo-Pro-1을 추가로 사용하였다. Yo-Pro-1은 DNA 나 RNA와 같은 핵산과 결합할 때만 초록색 형광을 나타내는 형광 염료로 주로 세포의 활성도 및 생존도 등을 테스트하는 용도로 사용되는 형광염료이다.
- 두 번째 대조군은 1×106 개의 세포를 9 μL 배지에 준비하고 1 μL의 단백질 혹은 Yo-Pro-1 수용액을 첨가한 그룹으로 세포가 자연적으로 외부 물질을 받아들이는 정도를 나타내는 대조군 그룹이다(이후 C-EP로 명명).
- Chlamydomonas reinhardtii 미세조류 종은 이 분야에서 오랜 시간 많은 사람들에 의해 연구되어 유전정보 등 관련 내용이 잘 알려진 모델 종이다. 디지털 전기천공 기술의 높은 전달 효율을 추가로 검증하기 위해 Chlamydomonas reinhardtii의 여러 종들 중 세포벽이 존재하는 야생종인 cc-125를 이용해 단백질 및 Yo-Pro-1 전달 실험을 수행하였다. 세포는 기본적으로 액체 Tris/acetate/phosphate (TAP) 배지 13 mL가 담긴 배양 플라스크 내에서 일정한 조도(1250 lx) 및 온도가(25 °C) 유지되는 배양기(JSPC-200C, JSR, Korea) 내에서 배양되었다.
- 특히 사용된 단백질의 양이 기존 크리스퍼 유전자 가위 기술에 사용되는 양 대비 100분의 1 수준의 낮은 양에서도 높은 단백질 전달 효율을 보인 것은 디지털 전기천공 기술의 뛰어난 외부 물질 전달 능력을 다시 한번 입증한 것으로 판단된다. 또한 인가 전기장의 크기 변화에 따른 단백질 전달 효율을 살펴봄으로써 최적의 단백질 전달 효율을 위한 전기천공 전기장 조건을 도출하였다(960 V/cm). 전달 물질의 크기에 따른 영향 분석을 위해 추가로 수행한 핵산 염색 형광 염료 Yo-Pro-1의 전달 특성 분석 결과, 크기에 따른 차이가 존재함에도 최적의 전달 효율을 나타내는 인가 전기장의 세기 조건은 매우 유사한 경향을 보였다.
- 마지막 세 번째 그룹은 1×106 개의 세포를 10 μL 배지에 준비하고 전기천공만을 수행한 그룹으로 전기적 자극에 의해 세포가 손상을 받아 자가형광(autofluorescence)을 나타내는 정도를 측정하기 위한 대조군으로써 통상 전기천공 실험에서 가장 많이 사용되는 대조군 종류이다(이후 C-DNA로 명명).
- 따라서 본 연구에서는 기 개발된 액적 접촉충전 기반의 디지털 전기천공 기술을 이용해 미세조류에 단백질을 전달하는 연구를 수행하였다. 보다 일관되고 안정적인 실험을 위해 기존 칩 제작 방법을 보완하여 3D 프린터를 이용한 칩 제작 방법을 도입, 기존 칩의 문제를 해결한 실험을 수행하였다. 전달되는 물질의 크기에 따른 영향을 살펴보기 위해 단백질보다 크기가 매우 작고 세포핵 내부로의 전달 유무를 확실히 확인할 수 있는 DNA 형광 염료인 Yo-Pro-1을 이용한 실험을 병행함으로써 물질 크기에 따른 전달 특성 거동을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 총 세 가지 종류의 대조군 실험을 수행하였다. 먼저 NC의 경우, 자연적인 세포 상태를 대변하는 그룹으로 실험에 사용된 세포의 자연적인 생존율과(94.
- 세포는 기본적으로 액체 Tris/acetate/phosphate (TAP) 배지 13 mL가 담긴 배양 플라스크 내에서 일정한 조도(1250 lx) 및 온도가(25 °C) 유지되는 배양기(JSPC-200C, JSR, Korea) 내에서 배양되었다. 실험 만 하루 전에 세포들의 배지를 새로 교체하여 실험 당시 세포 분열이 충분히 활성화된 상태의 세포를 확보하여 실험을 수행하였다.
- 2의 결과로부터 디지털 전기천공을 이용해 살아 있는 세포에 Yo-Pro-1을 세포를 죽이지 않은 상태에서 세포 핵 내부까지 전달이 가능함을 확인하였으나 정량적으로 얼만큼의 효율로 세포 내 전달이 가능한 지에 대한 분석을 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 외부 물질의 전달 효율은 전체 세포 중 전달 물질을 받아 형광을 나타내는 세포의 수를 백분율로 정의하였으며 FACS를 통해 각각의 실험 조건 당 약 10,000개 세포를 분석하였다. 전기천공의 주요 변수 중 가장 중요하고 큰 영향을 주는 요인은 가해주는 전기장의 세기이기 때문에 인가 전기장의 크기에 따른 전달 효율의 변화를 Fig.
- 전기천공 결과에 대한 보다 정확한 FACS 분석을 위해 본 연구에서는 총 세 가지 대조군을 준비하였다. 첫 번째 대조군은 1×106 개의 세포를 10 μL 배지에 준비하고 아무런 조치도 하지 않은 그룹이다 (이후 NC로 명명).
- 준비된 10 μL 혼합 세포 수용액을 모두 처리하기 위해 실험은 총 4회 반복 수행되었다. 전기천공이 완료된 액적은 EP needle에 연결된 주사기를 통해 수집 후 실험 당일 바로 결과 분석을 수행하였다.
- 보다 일관되고 안정적인 실험을 위해 기존 칩 제작 방법을 보완하여 3D 프린터를 이용한 칩 제작 방법을 도입, 기존 칩의 문제를 해결한 실험을 수행하였다. 전달되는 물질의 크기에 따른 영향을 살펴보기 위해 단백질보다 크기가 매우 작고 세포핵 내부로의 전달 유무를 확실히 확인할 수 있는 DNA 형광 염료인 Yo-Pro-1을 이용한 실험을 병행함으로써 물질 크기에 따른 전달 특성 거동을 살펴보았다. 전기장의 크기 변화에 따른 단백질 전달 효율을 살펴봄으로써 최적의 단백질 전달을 위한 전기천공 조건을 도출하고자 하였다.
- 이전 연구에서 본 연구자는 액적 접촉충전 현상[11-20] 기반의 디지털 전기천공 기술을 미세조류 형질전환에 적용하여 높은 세포 생존율 및 유전체 발현 효율을 달성하였다[21]. 제안된 디지털 전기천공 기술은 기존에 상용화된 전기천공 장치의 단점들을 극복하기 위해 디지털 미세유체 기술을[21-23] 적용한 시스템으로 크기가 매우 작기 때문에 작동 전압과 전류를 획기적으로 낮추어 기존 문제점들을 근본적으로 해결하였다. 또한 하나의 단위 액적 내에 최대 수십만 개의 세포를 담아 실험함으로써 기존 미세유체 전기천공 기술의 한계인 낮은 수율 문제를 해결하였다[21].
- 준비된 10 μL 혼합 세포 수용액을 모두 처리하기 위해 실험은 총 4회 반복 수행되었다.
- 준비된 세포 수용액에 단백질(1.33 mg) 또는 Yo-Pro-1을(0.1 mmol) 포함한 수용액 1 μL를 추가하여 혼합된 세포 수용액을 만들었다.
- 1 mmol) 포함한 수용액 1 μL를 추가하여 혼합된 세포 수용액을 만들었다. 준비된 혼합 세포 수용액을 마이크로 피펫을 이용해 2.5 mL 크기의 액적 형태로 PDMS 칩과 전기천공용 전극(EP needle) 사이 1 mm 간격에 공급한 후 일정 크기의 전기펄스를 인가하여(자세한 전기천공조건은 결과에서 기술) 전기천공을 수행하였다. 준비된 10 μL 혼합 세포 수용액을 모두 처리하기 위해 실험은 총 4회 반복 수행되었다.
- 1b에 나타난 바와 같이 전기천공용 전극(EP needle)을 추가하여 전기천공용 전원장치와 릴레이 스위치에 연결이 된다. 컴퓨터를 통해 릴레이 스위치를 조작함으로써 전기천공에 인가되는 전기펄스의 횟수와 인가 시간을 조절하였다. 전기천공은 약 2.
- 이렇게 제작된 PDMS 칩은 전극 구조체나 벽체 등에 틈이 없기 때문에 오일의 누유 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 하지만 이렇게 제작된 PMDS 칩의 경우, 실리콘 오일을 사용하게 되면 오일이 PDMS에 침투하여 칩이 부풀어 오르는 문제가 생기기 때문에 미네랄 오일을 이용해 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 디지털 전기천공 실험을 위해 약 1×106 개의 세포를 9 μL 배지에 준비하였다.
- 세포 내로 전달된 단백질의 전달 효율을 쉽고 빠르게 정량화 하기 위해 형광 단백질을 사용하였다. 실험에 사용된 단백질은 잘 알려진 Green Fluorescence Protein (GFP)를 사용하였으며 이렇게 형광 단백질을 이용하면 전기천공을 통해 세포 내로 전달 후 당일 바로 전달 유무 및 효율을 측정할 수 있는 장점이 있다.
- 세포 내로 전달된 단백질의 전달 효율을 쉽고 빠르게 정량화 하기 위해 형광 단백질을 사용하였다. 실험에 사용된 단백질은 잘 알려진 Green Fluorescence Protein (GFP)를 사용하였으며 이렇게 형광 단백질을 이용하면 전기천공을 통해 세포 내로 전달 후 당일 바로 전달 유무 및 효율을 측정할 수 있는 장점이 있다. 단백질의 전달 효율 실험에서 전달 물질의 크기에 따른 영향을 살펴보기 위해 DNA를 염색하는데 활용되는 형광 염료인 Yo-Pro-1을 추가로 사용하였다.
- 첫 번째 대조군은 1×106 개의 세포를 10 μL 배지에 준비하고 아무런 조치도 하지 않은 그룹이다 (이후 NC로 명명).
성능/효과
- 4%로부터 자연 상태의 식물 세포가 낮은 확률이지만 외부 단백질을 세포 내로 받아들일 수 있음이 확인되었다. C-DNA 대조군 결과로부터 손상된 세포에서 발생하는 자가발광 수준은 형광 단백질 GFP에서 발생되는 형광과 구분됨을 확인하였다.
- NC 대조군의 상대적으로 낮은 세포 생존율로부터 실험에 사용된 세포의 상태가 이전 Yo-Pro-1 실험군 대비 상대적으로 좋은 않음을 확인 하였다. C-EP 그룹의 단백질 전달효율 1.4%로부터 자연 상태의 식물 세포가 낮은 확률이지만 외부 단백질을 세포 내로 받아들일 수 있음이 확인되었다. C-DNA 대조군 결과로부터 손상된 세포에서 발생하는 자가발광 수준은 형광 단백질 GFP에서 발생되는 형광과 구분됨을 확인하였다.
- 단백질의 세포 내 전달 실험에 앞서, 우선 기존에 전기천공을 통해 세포 내부로의 전달이 가능함이 알려진 핵산 염색 물질인 Yo-Pro-1을 이용해 디지털 전기천공을 이용한 세포 내 물질 전달 특성을 살펴보았다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 디지털 전기천공을 이용해 세포 내부 특히 세포 내 핵에 Yo-Pro-1이 성공적으로 전달되어 세포핵에서 초록색 형광을 나타냄을 확인할 수 있다. 근접한 다른 세포의 경우 Yo-Pro-1이 전달되지 않은 것을 확인할 수 있으며 핵에서 초록색 형광을 나타내는 세포의 chlorophyll 형광 강도와 세포의 모양 그리고 세포 움직임에 의해 생성된 세포 외곽의 잔상들로부터 살아 있는 세포의 핵 내부로 Yo-Pro-1이 성공적으로 전달되었음을 확인할 수 있다.
- 마지막으로 C-DNA 그룹의 경우 전기천공만으로 세포가 자가발광(autofluorescence) 하는 정도를 확인 할 수 있으며 FACS 기기의 설정을 조정함으로써 이러한 자가발광에 의한 신호를 최소화 하여 실제 Yo-Pro-1에서 발생된 신호와 구분할 수 있게 조절하는 데 기준 역할을 한다. Fig. 3 결과에서 확인할 수 있듯이 전기천공에 의해 손상 받은 세포에서 발생될 수 있는 자가발광 비율은 0.2% 수준으로 Yo-Pro-1에서 발생되는 형광과는 구분됨을 확인할 수 있다.
- 더욱이 매우 단단한 세포 벽이 존재하는 야생종 미세조류의 세포핵에 단백질을 전달하기 위해서는 매우 높은 전달효율을 지닌 시스템이 필요하다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 디지털 전기천공 시스템을 이용해 GFP가 살아 있는 세포핵에 성공적으로 전달됨을 확인하였다. 초록색 형광이 가장 밝게 빛나는 위치는 컵 모양의 엽록체에 싸여 있는 세포 핵의 위치와 일치한다.
- 5에 나타난 것과 같은 결과를 확인하였다. NC 대조군의 상대적으로 낮은 세포 생존율로부터 실험에 사용된 세포의 상태가 이전 Yo-Pro-1 실험군 대비 상대적으로 좋은 않음을 확인 하였다. C-EP 그룹의 단백질 전달효율 1.
- 2에 나타난 바와 같이 디지털 전기천공을 이용해 세포 내부 특히 세포 내 핵에 Yo-Pro-1이 성공적으로 전달되어 세포핵에서 초록색 형광을 나타냄을 확인할 수 있다. 근접한 다른 세포의 경우 Yo-Pro-1이 전달되지 않은 것을 확인할 수 있으며 핵에서 초록색 형광을 나타내는 세포의 chlorophyll 형광 강도와 세포의 모양 그리고 세포 움직임에 의해 생성된 세포 외곽의 잔상들로부터 살아 있는 세포의 핵 내부로 Yo-Pro-1이 성공적으로 전달되었음을 확인할 수 있다. 따라서 디지털 전기천공을 통해 살아있는 세포 내 핵에 Yo-Pro-1의 전달이 가능함을 확인하였으며 Yo-Pro-1이 전달된 세포의 생존 또한 확인하였다.
- 본 연구에서는 크리스퍼 유전자 가위 기술을 디지털 전기천공 기술에 접목하기 위한 사전 연구로 디지털 전기천공을 이용한 미세조류 내 단백질 전달 연구를 수행 하였다. 대표적인 미세조류 종인 Chlamydomonas reinhardtii 중 세포벽이 존재하는 야생종 cc-125에 적용한 결과, 살아 있는 세포의 핵 내부로 형광 단백질 GFP가 10% 이상의 비교적 높은 효율로 전달될 수 있음을 확인하였다. 특히 사용된 단백질의 양이 기존 크리스퍼 유전자 가위 기술에 사용되는 양 대비 100분의 1 수준의 낮은 양에서도 높은 단백질 전달 효율을 보인 것은 디지털 전기천공 기술의 뛰어난 외부 물질 전달 능력을 다시 한번 입증한 것으로 판단된다.
- 즉, 너무 많은 Yo-Pro-1의 전달로 많은 수의 세포가 파괴되어 결과적으로 낮은 Yo-Pro-1 전달 효율 결과로 나타난 것으로 추정된다. 따라서 Yo-Pro-1 전달에 있어서는 약 96 V 전압을 (전기장 960 V/cm) 인가하는 것이 최적의 전달 효율을 보임을 확인하였다.
- 근접한 다른 세포의 경우 Yo-Pro-1이 전달되지 않은 것을 확인할 수 있으며 핵에서 초록색 형광을 나타내는 세포의 chlorophyll 형광 강도와 세포의 모양 그리고 세포 움직임에 의해 생성된 세포 외곽의 잔상들로부터 살아 있는 세포의 핵 내부로 Yo-Pro-1이 성공적으로 전달되었음을 확인할 수 있다. 따라서 디지털 전기천공을 통해 살아있는 세포 내 핵에 Yo-Pro-1의 전달이 가능함을 확인하였으며 Yo-Pro-1이 전달된 세포의 생존 또한 확인하였다.
- 일반적으로 인가 전압이 높아짐에 따라 세포의 생존율은 감소하고 외부 물질의 전달 효율은 증가한다. 따라서 이러한 결과는 인가 전압이 높아짐에 따라 Yo-Pro-1의 전달이 덜 되어 나타난 결과라기 보다는 증가된 전달효율로 세포의 생존율이 급격히 감소함에 따라 나타난 결과로 판단되며 이러한 가설은 192 V 조건에서 50% 미만의 매우 낮은 세포 생존율 데이터에서 유추가 가능하다. 즉, 너무 많은 Yo-Pro-1의 전달로 많은 수의 세포가 파괴되어 결과적으로 낮은 Yo-Pro-1 전달 효율 결과로 나타난 것으로 추정된다.
- 초록색 형광이 가장 밝게 빛나는 위치는 컵 모양의 엽록체에 싸여 있는 세포 핵의 위치와 일치한다. 또한 Chlorophyll 사진에서 보이는 선명한 모양과 강한 적색 엽록소 형광 신호로부터 단백질이 세포 핵에 전달 되었음에도 세포가 살아 있는 상태로 존재함을 알 수 있다.
- 본 연구를 통해 세포벽이 존재하는 야생종 미세조류에 세포벽의 제거 없이 외부 단백질의 전달이 가능함을 확인하였다. 특히 디지털 전기천공 기술의 높은 전달 효율 덕분에 크기가 매우 큰 단백질임에도 전달 효율 14.
- 이는 상태적으로 크기가 매우 큰 단백질이 전달되는 과정에서 많은 수의 세포들이 파괴되어 나타난 결과로 추정된다. 인가 전압 증가에 따른 단백질 전달효율 역시 Yo-Pro-1과 유사한 경향을 나타내며 96V에서 가장 높은 효율을 보였다. 특히 192 V에서는 48 V 조건에서의 결과와 거의 비슷한 수준의 단백질 전달 효율을 보여 앞선 가설을 뒷받침 하는 결과를 확인하였다.
- 인가 전압의 증가에 따른 세포 생존율 변화 경향은 이전 Yo-Pro-1과 유사하게 감소 하는 경향을 나타냈으나 그 감소 폭이 훨씬 크게 나타나 192 V 조건에서는 세포 생존율이 20%로 매우 낮게 나타났다. 이는 상태적으로 크기가 매우 큰 단백질이 전달되는 과정에서 많은 수의 세포들이 파괴되어 나타난 결과로 추정된다.
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3-3. 형광 단백질의 세포 내 전달
전기천공 방법이 다른 유전자 전달 방법 대비 가지는 큰 장점 중 하나는 DNA 등 유전 물질뿐 아니라 앞선 실험 결과에서 본 바와 같이 염료나 단백질 혹은 미세 입자 등 세포보다 작은 임의의 물질을 전달할 수 있다는 것이다. 하지만 실제 단백질을 직접 세포에 전달하는 연구는 특정 동물 세포에 국한해 매우 제한적으로 이루어지며 식물 세포에의 전달은 사실상 전무한 실정이다.
- 특히 실험에 사용된 단백질의 양은 기존 크리스퍼 유전자 가위에 사용한 양 대비 약 100분의 1 수준으로 상대적으로 적은 양을 사용했음에도 시스템의 뛰어난 전달 효율 덕분에 높은 단백질 전달효율 결과를 얻었다. 전달 물질의 크기에 따른 영향 분석을 위해 추가로 수행한 핵산 염색 형광 염료 Yo-Pro-1의 전달 특성 분석 결과, 크기에 따른 차이가 존재함에도 최적의 전달 효율을 나타내는 인가 전기장의 세기 조건은 매우 유사한 경향을 보였다. 이러한 유사성은 상대적으로 비용이 적게 들고 실험 결과의 확인 또한 용이한 Yo-Pro-1 염료의 전기천공 최적화 연구에의 활용 가능성이 높음을 시사한다.
- 특히 192 V에서는 48 V 조건에서의 결과와 거의 비슷한 수준의 단백질 전달 효율을 보여 앞선 가설을 뒷받침 하는 결과를 확인하였다. 즉, 너무 높은 전달 효율로 다수의 세포들이 전달되는 물질에 의해 파괴되는 영향으로 결과적으로 낮은 전달 효율을 보이게 됨을 본 결과를 통해 다시 한 번 확인하였다. 따라서 단백질 전달 역시 최적의 인가 전압이 존재함을 확인 하였다.
- 따라서 이러한 결과는 인가 전압이 높아짐에 따라 Yo-Pro-1의 전달이 덜 되어 나타난 결과라기 보다는 증가된 전달효율로 세포의 생존율이 급격히 감소함에 따라 나타난 결과로 판단되며 이러한 가설은 192 V 조건에서 50% 미만의 매우 낮은 세포 생존율 데이터에서 유추가 가능하다. 즉, 너무 많은 Yo-Pro-1의 전달로 많은 수의 세포가 파괴되어 결과적으로 낮은 Yo-Pro-1 전달 효율 결과로 나타난 것으로 추정된다. 따라서 Yo-Pro-1 전달에 있어서는 약 96 V 전압을 (전기장 960 V/cm) 인가하는 것이 최적의 전달 효율을 보임을 확인하였다.
- 본 연구를 통해 세포벽이 존재하는 야생종 미세조류에 세포벽의 제거 없이 외부 단백질의 전달이 가능함을 확인하였다. 특히 디지털 전기천공 기술의 높은 전달 효율 덕분에 크기가 매우 큰 단백질임에도 전달 효율 14.3%의 비교적 높은 전달 효율을 보임으로써 향후 미세조류 내에 단백질 전달 시 디지털 전기천공 기술의 활용 가능성이 매우 큼을 확인하였다. 특히 실험에 사용된 단백질의 양은 기존 크리스퍼 유전자 가위에 사용한 양 대비 약 100분의 1 수준으로 상대적으로 적은 양을 사용했음에도 시스템의 뛰어난 전달 효율 덕분에 높은 단백질 전달효율 결과를 얻었다.
- 3%의 비교적 높은 전달 효율을 보임으로써 향후 미세조류 내에 단백질 전달 시 디지털 전기천공 기술의 활용 가능성이 매우 큼을 확인하였다. 특히 실험에 사용된 단백질의 양은 기존 크리스퍼 유전자 가위에 사용한 양 대비 약 100분의 1 수준으로 상대적으로 적은 양을 사용했음에도 시스템의 뛰어난 전달 효율 덕분에 높은 단백질 전달효율 결과를 얻었다. 전달 물질의 크기에 따른 영향 분석을 위해 추가로 수행한 핵산 염색 형광 염료 Yo-Pro-1의 전달 특성 분석 결과, 크기에 따른 차이가 존재함에도 최적의 전달 효율을 나타내는 인가 전기장의 세기 조건은 매우 유사한 경향을 보였다.
- 3에 나타난 바와 같이 인가 전압이 두 배씩 증가함에 따라 세포의 생존율은 급격히 감소하는 뚜렷한 경향을 나타내었다. 하지만 인가 전압에 따른 Yo-Pro-1 전달 효율의 변화는 단순히 증가하기 보다 96 V에서 최대 효율을 나타내고 더 높은 전압에서는 오히려 효율이 다소 감소됨을 확인할 수 있다. 일반적으로 인가 전압이 높아짐에 따라 세포의 생존율은 감소하고 외부 물질의 전달 효율은 증가한다.
후속연구
- 현재 크리스퍼 유전자 가위 기술 적용을 위해서는 한 번 실험에 수십 만원에 이르는 시약이 사용되어야 하는데 디지털 전기천공 기술의 높은 전달효율과 미세유체 기술의 장점인 적은 시료의 사용으로 실험이 가능한 점 등을 활용한다면 보다 경제적이고 효율적인 적용이 가능할 것으로 기대된다. 또한 미세조류 형질전환에 크리스퍼 유전자 가위를 적용함에 있어 현재의 기술적 어려움 등을 극복하고 근본적인 원인 해결의 실마리를 찾는데 본 연구결과가 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 향후 본 연구결과를 토대로 CAS9 단백질 전달 효율 및 가이드 RNA 손상 여부 등 관련한 추가적인 연구를 통해 크리스퍼 유전자 가위 기술을 활용한 미세조류 형질전환기술을 보완, 완성하고자 한다.
- 이러한 유사성은 상대적으로 비용이 적게 들고 실험 결과의 확인 또한 용이한 Yo-Pro-1 염료의 전기천공 최적화 연구에의 활용 가능성이 높음을 시사한다. 본 연구 결과는 크리스퍼 유전자가위 기술의 미세조류 형질전환 적용에 있어 기존에 제기된 문제를 해결하는데 단초를 제공하는 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.
- 과량의 단백질 복합체가 사용되어야 하는 이유 중 하나로 세포벽과 엽록체의 존재 때문에 크기가 큰 단백질의 전달이 방해를 받아 효율적인 전달이 되지 못하기 때문인 것을 생각할 수 있다. 이 경우 본 연구에 사용된 디지털 전기천공 기술을 적용한다면 본 연구결과에서 확인한 것과같이 높은 단백질 전달 효율을 바탕으로 보다 효율적인 전달이 가능할 것으로 기대된다. 하지만 단순히 단백질 전달 효율만의 문제로 보기에는 같이 사용되는 가이드 RNA의 손상 문제 등 보다 복합적인 문제들이 혼재되어 있을 수 있는 등 관련한 체계적인 분석 및 연구가 뒷받침 되어야 현재의 문제를 근본적으로 해결할 수 있을 것으로 판단된다.
- 전달 물질의 크기에 따른 영향 분석을 위해 추가로 수행한 핵산 염색 형광 염료 Yo-Pro-1의 전달 특성 분석 결과, 크기에 따른 차이가 존재함에도 최적의 전달 효율을 나타내는 인가 전기장의 세기 조건은 매우 유사한 경향을 보였다. 이러한 유사성은 상대적으로 비용이 적게 들고 실험 결과의 확인 또한 용이한 Yo-Pro-1 염료의 전기천공 최적화 연구에의 활용 가능성이 높음을 시사한다. 하지만 Yo-Pro-1을 활용한 최적화 연구 시적정한 Yo-Pro-1 농도를 해당 세포에 맞게 찾는 것이 반드시 필요하다.
- 이 경우 본 연구에 사용된 디지털 전기천공 기술을 적용한다면 본 연구결과에서 확인한 것과같이 높은 단백질 전달 효율을 바탕으로 보다 효율적인 전달이 가능할 것으로 기대된다. 하지만 단순히 단백질 전달 효율만의 문제로 보기에는 같이 사용되는 가이드 RNA의 손상 문제 등 보다 복합적인 문제들이 혼재되어 있을 수 있는 등 관련한 체계적인 분석 및 연구가 뒷받침 되어야 현재의 문제를 근본적으로 해결할 수 있을 것으로 판단된다.
- 또한 미세조류 형질전환에 크리스퍼 유전자 가위를 적용함에 있어 현재의 기술적 어려움 등을 극복하고 근본적인 원인 해결의 실마리를 찾는데 본 연구결과가 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 향후 본 연구결과를 토대로 CAS9 단백질 전달 효율 및 가이드 RNA 손상 여부 등 관련한 추가적인 연구를 통해 크리스퍼 유전자 가위 기술을 활용한 미세조류 형질전환기술을 보완, 완성하고자 한다.
- 현재 크리스퍼 유전자 가위 기술 적용을 위해서는 한 번 실험에 수십 만원에 이르는 시약이 사용되어야 하는데 디지털 전기천공 기술의 높은 전달효율과 미세유체 기술의 장점인 적은 시료의 사용으로 실험이 가능한 점 등을 활용한다면 보다 경제적이고 효율적인 적용이 가능할 것으로 기대된다. 또한 미세조류 형질전환에 크리스퍼 유전자 가위를 적용함에 있어 현재의 기술적 어려움 등을 극복하고 근본적인 원인 해결의 실마리를 찾는데 본 연구결과가 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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