Newcastle disease virus (NDV) 감염된 baby hamster kidney 세포에서 Syncytium (합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutinin-neuramidase에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25과 $3.2{\mu}g/mL$ 사이에서는 현저하게 감소하였으나, $25{\mu}g/mL$ 농도에서는 NDV 감염된 HAD (%)는 광범위한 흡착능의 감소를 나타났으나 바이러스 당단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로 오배자 추출물은 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 활성을 갖는 것으로 결론된다. 또한 오배자 추출물의 저해활성을 조사한 결과 ${\alpha}-glucosidase$에 대한 추출물의 $IC_{50}$은 $12.5{\mu}g/mL$이었으며, ${\beta}-glucosidase$, ${\alpha}-glucosidase$, ${\beta}-mannosidase$에 대한 오배자 추출물의 $IC_{50}$은 각각 26, 36, $50{\mu}g/mL$로 나타나 ${\beta}-type$ glycosidases 보다 ${\alpha}-type$ glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 $IC_{50}$ 농도에서는 세포내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 사료된다.
Newcastle disease virus (NDV) 감염된 baby hamster kidney 세포에서 Syncytium (합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutinin-neuramidase에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25과 $3.2{\mu}g/mL$ 사이에서는 현저하게 감소하였으나, $25{\mu}g/mL$ 농도에서는 NDV 감염된 HAD (%)는 광범위한 흡착능의 감소를 나타났으나 바이러스 당단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로 오배자 추출물은 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 활성을 갖는 것으로 결론된다. 또한 오배자 추출물의 저해활성을 조사한 결과 ${\alpha}-glucosidase$에 대한 추출물의 $IC_{50}$은 $12.5{\mu}g/mL$이었으며, ${\beta}-glucosidase$, ${\alpha}-glucosidase$, ${\beta}-mannosidase$에 대한 오배자 추출물의 $IC_{50}$은 각각 26, 36, $50{\mu}g/mL$로 나타나 ${\beta}-type$ glycosidases 보다 ${\alpha}-type$ glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 $IC_{50}$ 농도에서는 세포내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 사료된다.
Trafficking process of viral glycoprotein to cell surface results in the syncytium formation when baby hamster kidney (BHK) cells was infected by Newcastle disease virus (NDV). Rhus chinensis gall, well-known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of glyco...
Trafficking process of viral glycoprotein to cell surface results in the syncytium formation when baby hamster kidney (BHK) cells was infected by Newcastle disease virus (NDV). Rhus chinensis gall, well-known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of glycoprotein, hemagglutinin-neuramidase (HN) to the cell-surface. Modification of viral glycoprotein is processed within the endoplasmic reticulum and golgi body during trafficking into surface. R. chinensis gall extracts showed the strong inhibitory activities ($IC_{50}$$12.5{\mu}g/mL$) against ${\alpha}-glucosidase$, when compared with the ${\beta}-glucosidase$. And this inhibitory activities is increased by the samples in a dose-depedent pattern. These data showed that the extracts of R. chinensis gall inhibited the cell-surface expression of NDV-hemagglutinin-neuramidase glycoprotein without significantly affecting HN glycoprotein synthesis in NDV-infected BHK cells.
Trafficking process of viral glycoprotein to cell surface results in the syncytium formation when baby hamster kidney (BHK) cells was infected by Newcastle disease virus (NDV). Rhus chinensis gall, well-known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of glycoprotein, hemagglutinin-neuramidase (HN) to the cell-surface. Modification of viral glycoprotein is processed within the endoplasmic reticulum and golgi body during trafficking into surface. R. chinensis gall extracts showed the strong inhibitory activities ($IC_{50}$$12.5{\mu}g/mL$) against ${\alpha}-glucosidase$, when compared with the ${\beta}-glucosidase$. And this inhibitory activities is increased by the samples in a dose-depedent pattern. These data showed that the extracts of R. chinensis gall inhibited the cell-surface expression of NDV-hemagglutinin-neuramidase glycoprotein without significantly affecting HN glycoprotein synthesis in NDV-infected BHK cells.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 오배자 추출액의 항바이러스 작용기작에 대한 연구로써 α-glucosidase 저해활성과 세포내 바이러스 당단백질 분비과정의 저해작용에 대한 활성을 규명하고자 연구를 수행하였다.
본 연구는 세포수준에서 오배자 추출물의 항바이러스 억제활성을 조사하기 위하여, NDV 감염된 BHK 세포 내에서 발현되는 바이러스 당단백질(NDV-HN)의 생합성 및 세포표면으로의 분비 효능을 알아보았다.
오배자 추추물에 의한 바이러스 당단백질의 세포표면으로의 발현 억제는 세포내에서 바이러스 당단백질의 세포내 생합성 저해에 의해 일어날 가능성이 있으므로, 추출물에 의한 당단백질생합성 저해능을 검토하였다. NDV-감염 BHK 세포에서 바이러스 당단백질 NDV-NH의 총 생합성 양은 세포 용해물에서 전체 HAU 측정으로 정량화한다는 연구가 보고되었다[23].
제안 방법
Glucosidase 저해제 스크리닝 시스템을 이용하여 α-glucosidase에 대하여 활성저해능을 갖는 오배자 추출물을 선별하여 조사하였다.
NDV 감염된 세포배양액을 초음파 파쇄하여 닭 적혈구 (chicken red blood cells)을 첨가한 후, 용해물에서 hemagglutination 활성을 측정하였다.
BHK cell의 표적 세포 단일층(monolayer)은 96 well microtiter plate에 5 multiplicity of infection 농도의 NDV를 감염시킨 후 표시된 농도의 시료를 첨가하여 배양하였다. 그런 후 NDV 감염 세포주에서 syncytium 형성여부와 cytopathic 효능 (CPE), cytopathic units (CPU) 정량을 광학현미경으로 관찰하였다[23].
배양한 배지를 제거한 후 냉각된 식염수(chilled saline)에 있는 1% (v/v) 닭 적혈구 (chicken red blood) 세포 2 mL를 각각의 well에 분주 한 후 4℃, 30분간 정치하였으며, 가끔씩 가겹게 흔들어 주었다.
세포 표면에서 NDV-HN 발현유무는 혈구흡착(hemadsorption, HAD)의 정량으로 결정하였다[23].
7)을 조제하여 사용하였다. 시료를 완충용액에 첨가하고 37℃, 5분 효소 반응 개시 후 기질을 첨가하여 37℃, 10분 간 효소 반응을 수행하였다. 효소반응 종료는 3배 vol.
효소반응 종료는 3배 vol.의 1 M Na2CO3를 첨가하여 반응을 종한 후 OD405를 측정하여 흡광도 변화로부터 효소저해활성을 계산하였다. 활성단위인 1 unit는 활성측정 조건에서, 1분 동안 PNP 1.
증식된 바이러스 stock 들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units의 assay를 통하여 적정하였다.
Glucosidase 저해제 스크리닝 시스템을 이용하여 α-glucosidase에 대하여 활성저해능을 갖는 오배자 추출물을 선별하여 조사하였다. 추출물의 저해활성을 조사하기 위하여 50% inhibition(IC50) values을 결정하였으며, 효소활성 저해능은 샘플 추출액 농도의 로그 값에 대한 상대활성 %을 정하여 나타내었다. Fig.
대상 데이터
BHK 세포주(일본 이화학연구소 분양)는 37℃, humidified CO2 incubator (5% CO2-95% air)내에서 10% calf serum (BD)이 포함된 Eagle’s minimum essential medium (BD, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
NDV; Miyadera strain는 국립보건 연구원(National Institute of Health, Seoul, Korea)에서 분양받은 BHK 세포에서 증식하였다.
증식된 바이러스 stock 들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units의 assay를 통하여 적정하였다. 모든 시험에 사용된 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구입하여 사용하였다.
오배자 시료는 대구시내에 위치한 한약방으로부터 구입하여 사용하였다. 오배자 시료 10 g을 각각 메탄올(100 mL)로 상온에서 24시간동안 추출하여 Whatman filter paper을 사용하여 여과하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며, 실험 결과는 SAS (Statistical Analysis System, SAS Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시하였으며, Duncan의 다범위 검정(Ducan’s multiple range test)을 통하여 5% 수준에 서 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다[24].
이론/모형
incubator에서 배양하였다. BHK 세포 성장은 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (SigmaAldrich)를 이용한 colorimetric 방법에 준하여 결정하였다.
오배자 추추물은 시판하는 다양한 glucosidase에 대하여 효소활성 억제를 보였다. glycosidase의 assay는 Lee 등[22]의 방법에 따라 수행하였다. α-glucosidase와 다른 glucosidase의 활성분석을 위하여 기질로 p-nitrophenol (PNP) glycosides (1 mM)를 포함하는 50 mM phosphate 완충용액(pH 6.
성능/효과
오배자 추추물은 시판하는 다양한 glucosidase에 대하여 효소활성 억제를 보였다. glycosidase의 assay는 Lee 등[22]의 방법에 따라 수행하였다.
즉, NDV 감염된 세포에 대하여 오배자 추출물 처리한 결과, 추출물 25 μg/mL 농도로 처리한 샘플 구에서 바이러스 당 단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않으나(Fig. 2, white bar □), 당단백질이 세포표면으로의 분비가 저해되어 혈구흡착이 되지는 않았다(Fig 2, black bar ■).
즉, 오배자 추출물은 β-type glycosidases 보다 α-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다.
후속연구
따라서, Fig. 1과 같이 α-glucosidase 억제 활성을 보이는 오배자 추출물이 세포내에서 바이러스 당단백질의 합성과정 및 세포표면으로의 분비과정 등을 이해하는데 유용한 재료로 이용될 수 있을 것이라 기대된다.
이러한 결과는 오배자 추출물이 NDV 감염된 BHK 세포에서 바이러스 당단백질의 분비과정을 저해함으로써 세포표면으로의 당단백질 발현을 억제함으로써 결국 항바이러스 작용을 하는 것으로 추론이 된다. 향후 오배자 추출물로부터 항바이러스 활성 물질의 분리 및 작용 기작 연구가 필요하다고 사료된다.
특히 HIV-1 envelope glycoprotein (Env)으로 알려진 outer membrane gp120와 transmembrane gp41 subunits은 precursor gp160의 절단으로부터 유래된다[13]. T helper cell 표면에 위치한 HIV 수용체인 gp41와 gp120은 lymphocytes 표면의 CD4 수용체에 결합하며, 이러한 상호작용을 통하여 거대하고 비기능적인 막융합을 야기시켜 합포체를 형성한다[8,14]. α-glucosidase inhibitor로써 Deoxynojirimycin와 그 유사체들은[8], gp160으로부터 gp41와 gp120으로의 절단 활성을 감소시켜 정상적인 glycan processing을 저해함으로써 감염세포내에서 HIV 수용체의 형성을 방해한다. HIV 감염된 세포에서의 합포체 형성은 Newcastle disease virus (NDV) 감염된 baby hamster kidney (BHK) 세포에서도 관찰되며[9], 이러한 수식과정은 HIV바이러스 감염성에 중요한 envelope glycoprotein의 수식과정과 도 유사하다[15]. 따라서 항바이러스 활성물들을 탐색하기 위한 전략으로 합포체 형성을 저해하는 저해제 탐색방법과 αglucosidase 활성 저해제 탐색방법이 기대된다.
오배자란?
오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)의 낙엽소교목인 붉나무(Rhus chinensis Mill.)에 오배자면충(Melaphis chinensis)이 기생하여 발생한 벌레집(insect gall)을 건조한 것으로 예로부터 수렴제나 해독제의 기능을 하며 설사, 충혈, 출혈, 해독 및 구강염 등에 약제로 사용되었으며, 타닌 함량이 높아 매염제 및 잉크 등의 제조에 사용 되었다[16,17]. 또한 오배자 중 gallotanin 류 및 triterpenoid 화합물 등은 항산화, 항혈전, 항바이러스 및 멜라닌 생합성 억제 활성 등에 관에 관여하는 것으로 보고되었다[16,18-21].
오배자의 용도는 무엇인가?
오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)의 낙엽소교목인 붉나무(Rhus chinensis Mill.)에 오배자면충(Melaphis chinensis)이 기생하여 발생한 벌레집(insect gall)을 건조한 것으로 예로부터 수렴제나 해독제의 기능을 하며 설사, 충혈, 출혈, 해독 및 구강염 등에 약제로 사용되었으며, 타닌 함량이 높아 매염제 및 잉크 등의 제조에 사용 되었다[16,17]. 또한 오배자 중 gallotanin 류 및 triterpenoid 화합물 등은 항산화, 항혈전, 항바이러스 및 멜라닌 생합성 억제 활성 등에 관에 관여하는 것으로 보고되었다[16,18-21].
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