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문제 정의
- 알러지성 비염에 대한 청연산 추출물의 항염증효과를 관찰하기 위한 본 연구에서 Balb/c계 수컷 생쥐 비강 점막에 OVA 항원을 자극하여 인위적인 알러지성 비염을 유발시킨 뒤, 청연산 추출물을 투여하였다. 확인 결과 비강 코점막 상피세포 손상, 부종, 소양감이 감소하였고 TNF-α 생성 감소, NF-κB p65 활성 억제, iNOS와 COX-2 생성 감소를 통하여 항염증효과를 보였다.
- 알러지성 비염의 치료는 과도한 면역반응과 염증반응을 억제시키는 것으로 비강 점막조직의 손상정도로 효과를 확인할 수 있다17). 이에 본 연구는 Balb/c 생쥐 비강 점막에 인위적으로 알러지성비염을 유발한 후, 청연산 추출물의 비염 완화 효과를 살펴보기 위하여 청연산 추출물의 염증조절 성분을 분석하였다. GC/MS를 실시한 결과 염증억제능이 있는 Undecanoic acid를 확인하였다 (Fig.
- 반면 본 실험과 유사한 방법으로 荊芥連翹湯과 防風通聖散을 사용한 연구에서 알러지성 비염을 유발한 생쥐의 항염증 매개물질을 조절하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다10,11). 이에 본 연구에서는 청연산 추출물로 알러지성 비염 치료에 활용할 수 있는 근거를 마련하기 위하여 청연산 추출물의 비강 점막손상의 완화와 항염증효과를 관찰한 결과, 유의성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
- 3). 이에 저자들은 항염증기전과 관련된 매개물질들에 대한 변화를 조사하였다.
제안 방법
- 0.01% HCl과 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB)이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색을 하였다.
- 1시간 동안 50-60 ℃Bouin 용액에서 매염 처리한 후 picric acid를 70% 에탄올에서 제거하였다. 10분 동안 Weigert iron hematoxylin에 반응시켜 핵을 염색하고, 15분 동안 phosphomolybdic-phosphotungstic acid와 Biebrich scalet-acid fuchsin에서, 5분간 Aniline blue에서 처리 후 관찰하였다.
- 1차 항체인 mouse anti-matrix metallopeptidase (MMP)-9 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-substance P (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-tumor necrosis factor (TNF)-α (1:50, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-nuclear factor (NF)-κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS) (1:250, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-cyclooxygenase (COX)-2(1:100, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 mouse anti-nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 72시간 동안 4 ℃ humidified chamber에서 반응시켰다.
- 최종 감작 일주일 경과 후 5일 동안 OVA 100 ㎍ : PBS 20 ㎕로 구성된 OVA용액을 생쥐 비강에 점적하여 알러지성 비염을 1차 유발하였다. 7일 경과 후 1차와 동일한 방법으로 2차 유발을 진행하였으며, 콧물과 코 긁기 행동으로 유발을 확인하였다 (Fig. 1).
- 대한실험동물센터에서 태령 6주된 Balb/c계 수컷 생쥐를 분양 받은 후, 무균사육장치내에서 2주 동안 적응시킨 뒤 체중이 20 g이 된 생쥐를 선별하였다. Ctrl (정상군), ARE (알러지성 비염 유발군), CRT (알러지성 비염 유발 후 청연산 추출물 투여군)으로 나누고 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- 이에 본 연구는 Balb/c 생쥐 비강 점막에 인위적으로 알러지성비염을 유발한 후, 청연산 추출물의 비염 완화 효과를 살펴보기 위하여 청연산 추출물의 염증조절 성분을 분석하였다. GC/MS를 실시한 결과 염증억제능이 있는 Undecanoic acid를 확인하였다 (Fig. 2). Undecanoic acid는 화학식 CH3(CH2)9COOH를 가진 자연 발생적인 카르복시산으로 백선이나 무좀 치료에 항진균제로 자주 사용되며, 미국에서는 특허 받은 국소적 항염증제 (특허발행번호: US 4343798 A)의 성분 중 하나로 알려져 있다.
- 1시간 동안 Anti-digoxigenin-peroxidase에 반응시킨 이후 DAB를 처리하였다. Methyl green으로 대조염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin,NBF), vascular rinse으로 심장관류고정을 하였다. 머리를 분리한 후 비강 주변 구조물을 제거하고 10% NBF에 24시간 동안 실온에서 고정하였다.
- 면역조직화학과 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용하여 영상분석을 했고 이를 수치화 (means ± standard error)했다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 점막을 x400 배율에서 촬영한 후 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상을 분석하였다.
- 1차 항체인 mouse anti-matrix metallopeptidase (MMP)-9 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-substance P (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-tumor necrosis factor (TNF)-α (1:50, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-nuclear factor (NF)-κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS) (1:250, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-cyclooxygenase (COX)-2(1:100, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 mouse anti-nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 72시간 동안 4 ℃ humidified chamber에서 반응시켰다. 그 후 실온에서 24시간 동안 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG1 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 반응하였고, 이후 1시간 동안 실온에서 avidin biotin complex kit (Vector Lab, USA)를 사용하여 반응시켰다. 0.
- 0 mL/min으로 설정하였다. 시료 주입구, 연결부분, 이온 원의 온도는 각각 280 ℃, 230 ℃ 및 150 ℃로 맞추었다. 질량분석범위 50∼800 m/z를 가지는 이온들을 scan monitoring (순차적으로 반복 검출하는 방법)으로 분석하였다.
- 질량분석범위 50∼800 m/z를 가지는 이온들을 scan monitoring (순차적으로 반복 검출하는 방법)으로 분석하였다.
- 코점막내 apoptosis 변화를 관찰하기 위해 in situ apoptosis detection kit (Apoptag, Intergen, USA)로 TUNEL을 실시하였다. 먼저 5분간 조직 절편을 proteinase K에 proteolysis 시킨 후 20초간 equilibration buffer에서 처리하였다.
- 코점막내 염증 변화를 조사하기 위해 조직을 5분 동안 proteinase K (20 ㎍/㎖)에서 proteolysis 과정을 거친 후 실온에서 blocking serum인 10% normal goat serum에 4시간 동안 반응시켰다. 1차 항체인 mouse anti-matrix metallopeptidase (MMP)-9 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-substance P (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-tumor necrosis factor (TNF)-α (1:50, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-nuclear factor (NF)-κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS) (1:250, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-cyclooxygenase (COX)-2(1:100, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 mouse anti-nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 72시간 동안 4 ℃ humidified chamber에서 반응시켰다.
- 2%)을 얻어 사용하였다. 투여량은 400 ㎎/㎏로 결정하였고, 알러지성 비염 유발 후 경구 투여하였다.
대상 데이터
- 청연산 추출물의 염증조절 성분의 분석을 위한 GC/MS로 6890N GC/ 5975i MS (Agilent, USA)를 사용하였다. GC/MS 분석을 위한 컬럼은 DB-5MS UI (30m, 0.25 mm, 0.25 mm)를 사용하였다. 오븐 온도는 처음 80 ℃에서 2분을 유지한 후 1분당 10 ℃씩 올려 300℃까지 올리고 5분 동안 머물게 하였다.
- 대한실험동물센터에서 태령 6주된 Balb/c계 수컷 생쥐를 분양 받은 후, 무균사육장치내에서 2주 동안 적응시킨 뒤 체중이 20 g이 된 생쥐를 선별하였다. Ctrl (정상군), ARE (알러지성 비염 유발군), CRT (알러지성 비염 유발 후 청연산 추출물 투여군)으로 나누고 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- 질량분석범위 50∼800 m/z를 가지는 이온들을 scan monitoring (순차적으로 반복 검출하는 방법)으로 분석하였다. 분석은 RT (retention time)에 대하여 library 검색을 하였고, Wiley 7 library을 기준으로 하였다.
- 실험에 사용된 청연산은 부산대학교한방병원에서 제조하였다 (Table 1). 청연산 2첩을 증류수 1500 ㎖에 넣어 3시간 전탕 후 여과하였다.
- 알러지성 비염 유발을 위한 항원으로 ovalbumin (OVA: chicken egg albumine, grade V, Sigma)를 사용하였다. OVA 25 ㎍ : 수산화알루미늄겔 (Al(OH)3 gel) 1 ㎎ : 인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS) 300 ㎕로 구성된 0.
- 청연산 추출물의 염증조절 성분의 분석을 위한 GC/MS로 6890N GC/ 5975i MS (Agilent, USA)를 사용하였다. GC/MS 분석을 위한 컬럼은 DB-5MS UI (30m, 0.
데이터처리
- SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)로 이루어졌고, one-way ANOVA를 시행하여 유의성 (P<0.05) 검증 후, LSD (Least significant difference)로 사후 검증하였다.
- 면역조직화학과 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용하여 영상분석을 했고 이를 수치화 (means ± standard error)했다.
성능/효과
- ARE에 비해 CRT은 87%의 유의성 있는 증가를 보였다. Apoptotic cell의 핵에서 나타나는 강한 양성반응은 ARE에 비해 CRT은 84%의 유의성 있는 증가를 보였다 (Fig. 8).
- 분비된 MMP-9는 type IV collagen과 fibronectin, elastin, laminin을 선택적으로 분해하여 세포외기질 분해와 기저막의 파괴에 핵심적인 역할을 하며21) 이로 인해 부종을 일으키는 것으로 알려져 있다22). MMP-9의 양성반응을 관찰한 결과 ARE군에 비해 CRT군에서 58%의 유의성 있는 감소가 보였다 (Fig. 4). 이러한 결과로 볼 때, 청연산 추출물은 MMP-9의 분비를 억제시키는 것으로 보인다.
- Masson trichrome 염색 결과, 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 호흡상피의 손상이 증가하였다. CRT는 ARE에 비해 손상된 호흡상피가 적었다 (Fig.
- 이러한 작용으로 피하조직내로 백혈구 침윤이 일어나고, 혈관내피세포에 작용하여 혈관확장, 발진 및 가려움이 유발된다24). Substance P의 양성반응을 관찰한 결과 CRT군이 ARE군에 비해 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 5). 청연산 추출물이 Substance P 분비를 억제시킴으로써 비만세포의 활성을 저하시켜 탈과립을 억제하는 것으로 보인다.
- 또한 apoptosis의 조절을 관찰하기 위한 TUNEL assay 결과, apoptotic cell의 핵에서 나타나는 강한 양성반응이 CRT군에서 ARE군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다 (Fig. 8). 이는 청연산 추출물이 염증 조절기전에 작용하여 과도한 염증반응을 일으키는 세포를 사멸하도록 조절하여, 염증반응에 의해 손상된 피부가 감소되는 것이라 생각된다28).
- 청연산이 알러지성 비염에도 효과가 있을 것으로 생각되어 청연산의 알러지성 비염 치료효과에 대한 선행 연구를 조사해 보았지만 관련된 연구는 찾을 수 없었다. 반면 본 실험과 유사한 방법으로 荊芥連翹湯과 防風通聖散을 사용한 연구에서 알러지성 비염을 유발한 생쥐의 항염증 매개물질을 조절하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다10,11). 이에 본 연구에서는 청연산 추출물로 알러지성 비염 치료에 활용할 수 있는 근거를 마련하기 위하여 청연산 추출물의 비강 점막손상의 완화와 항염증효과를 관찰한 결과, 유의성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
- 실제로 코점막조직표본을 Masson trichrome 염색을 통해 확인한 결과, CRT군의 아래코선반의 호흡상피 손상이 ARE에 비해 적은 것을 확인하였다 (Fig. 3). 이에 저자들은 항염증기전과 관련된 매개물질들에 대한 변화를 조사하였다.
- 염증억제능이 있는 Undecanoic acid (RT 11.659 / Area 1.22%)을 확인하였다.
- 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 청연산 추출물은 알러지성 비염으로 인한 비강 점막 손상을 완화시키며항염증효과도 있음을 확인하였다. 그러나 청연산 추출물이 알러지성 비염의 발병 기전 중 어느 단계에 어떻게 작용하는지에 대해서는 구체적인 확인이 필요하다.
- 이러한 기전을 고려할 때, CRT군이 ARE군에 비해 TNF-α, NF-kB p65 양성반응이 감소하였다 (Fig. 6)는 것은 청연산 추출물이 TNF-α, NF-kB p65와 같은 전염증효소의 활성화를 감소시키고, NF-kB p65의 신호에 의해 활성화 되는 iNOS의 발현과 COX-2의 활성을 억제시킴으로써 (Fig.
- 청연산 추출물의 항염증효과를 알아보기 위해 Nrf2의 양성반응을 살펴본 결과, CRT군에서 ARE군에 비해 유의성 있는 증가를 확인할 수 있었다 (Fig. 8). Nrf2는 항산화 유전자를 발현하는 대표적인 전사인자로서 산화적 스트레스로부터 다양한 항산화 효소 (주로 Phase II enzyme)를 유도하여 세포 및 조직을 보호한다.
- 1% OVA용액을 알러지성 비염 유발 시작 21, 14, 7일 전에 복강주사하여 감작시켰다. 최종 감작 일주일 경과 후 5일 동안 OVA 100 ㎍ : PBS 20 ㎕로 구성된 OVA용액을 생쥐 비강에 점적하여 알러지성 비염을 1차 유발하였다. 7일 경과 후 1차와 동일한 방법으로 2차 유발을 진행하였으며, 콧물과 코 긁기 행동으로 유발을 확인하였다 (Fig.
- 확인 결과 비강 코점막 상피세포 손상, 부종, 소양감이 감소하였고 TNF-α 생성 감소, NF-κB p65 활성 억제, iNOS와 COX-2 생성 감소를 통하여 항염증효과를 보였다. 항염증작용의 원인으로 작용할 수 있는 Nrf2의 항산화와 apoptosis 증가가 유의하게 관찰되었다. 이상의 결과로 청연산은 알러지성 비염으로 인한 코점막 손상을 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
- 확인 결과 비강 코점막 상피세포 손상, 부종, 소양감이 감소하였고 TNF-α 생성 감소, NF-κB p65 활성 억제, iNOS와 COX-2 생성 감소를 통하여 항염증효과를 보였다.
후속연구
- 항염증작용의 원인으로 작용할 수 있는 Nrf2의 항산화와 apoptosis 증가가 유의하게 관찰되었다. 이상의 결과로 청연산은 알러지성 비염으로 인한 코점막 손상을 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 쥐를 이용한 동물 실험이기에 인간의 알러지성비염 유발에 영향을 주는 유전적 요인은 고려되지 않았다. 향후 치료기전에 대한 추가적인 연구와 임상연구가 필요하다고 생각된다.
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