[논문]상엽 추출물이 마우스 대식세포의 IL-1α, IL-6, IL-10에 대한 항염활성 연구

박영식; 한효상

doi:10.14400/jdc.2018.16.11.613

상엽 추출물이 마우스 대식세포의 IL-1α, IL-6, IL-10에 대한 항염활성 연구
Anti-inflammatory activity Effects of Mori Folium Water Extracton IL-1α, IL-6 and IL-10 on mouse macrophages 원문보기

디지털융복합연구 = Journal of digital convergence, v.16 no.11, 2018년, pp.613 - 620

초록
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상엽 추출물의 항염 효능을 연구하고자 하였다. 상엽을 열수 추출하여 제조한 시료를 대상으로 RAW 264.7 macrophage cells를 24시간 배양하여 세포생존율과 LPS로 유발된 RAW 264.7 macrophage cells의 일산화질소(NO) 생성증가, $IL-1{\alpha}$, IL-6 그리고 IL-10 등의 사이토카인 생성증가에 미치는 영향을 측정하였다. 상엽 추출물의 MTT assay를 수행한 결과 상엽 추출물은 대식세포의 생존율에는 크게 영향을 주지 않았다. LPS로 활성화된 대식세포의 일산화질소(NO)의 생성증가를 $25{\mu}g/mL$ 이상의 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 억제시켰다. 또한 LPS로 유발된 대식세포에 염증과 연관된 사이토카인인 $IL-1{\alpha}$, IL-6의 생성증가를 $50{\mu}g/mL$ 이상의 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 억제하는 등 항염효과를 가지고 있는 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 상엽이 건강 친화적인 기능성 소재로 활용도가 높을 것으로 기대된다. 또한 향후 지속적인 연구를 통한 대식세포를 항염증과 관련된 신호전달경로를 확인하는 추가 실험이 필요하다고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate of Mori Folium Water Extract (MF) on anti-inflammation activity. MF Water extracts after 24 houres cultivation were examined to ascertain the cell viability of mouse macrophage RAW 264.7 cells. The influence of the Water extracts in RAW 264.7 macrophage cells treated with LPS was investigated. nitric oxide (NO) production, nterleukin$(IL)-1{\alpha}$ IL-6 and IL-10 increased generation of cytokines. mouse macrophage RAW 264.7 cells cell viability changes were no decreas after MTT assay of MF Water extract. The MF water extracts inhibited NO generation caused by LPS in the macrophages over $25{\mu}g/mL$. The MF water extracts increased in the control group the $IL-1{\alpha}$ and IL-6 activation generated by LPS in the macrophages over $50{\mu}g/mL$. Accordingly, it was found that different MF water extract concentrations significantly influenced certain anti-inflammation activities in RAW 264.7 macrophage cells. The results of this study are expected to be highly applicable to health - friendly functional materials. Further studies are needed to confirm the signaling pathways associated with anti-inflammation of macrophages through continuous studies.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Effect of MF on cell viability in RAW 264.7 macrophage cells incubated for 24 hrs. Results are the mean ± SD of three independent experiments.
그림 Fig. 2. Effect of MF on the nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells were incubated for 24 hrs. treated with LPS; 1 ㎍ /mL. Results are the mean ± SD of three independent experiments.
그림 Fig. 3. Effect of MF on the IL-1α production in RAW 264.7 macrophage cells were incubated for 24 hrs. treated with LPS; 1 ㎍/mL. Results are the mean ± SD of three independent experiments.
표 Table 1. Effect of MF on IL-6 Production in Raw 264.7 Cells Treated with LPS
그림 Fig. 4. Effect of MF on the IL-6 production in RAW 264.7 macrophage cells were incubated for 24 hrs. treated with LPS; 1 ㎍/mL. Results are the mean ± SD of three independent experiments.
그림 Fig. 5. Effect of MF on the IL-10 production in RAW 264.7 macrophage cells were incubated for 24 hrs. treated with LPS; 1 ㎍/mL. Results are the mean ± SD of three independent experiments.
표 Table 2. Effect of MF on IL-10 Production in Raw 264.7 Cells Treated with LPS

AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 연구에서는 상엽의 항염효과에 대하여 알아보기 위하여 상엽 물추출(MF = Mori Folium)을 대상으로 RAW 264.7 macrophage cells의 cell viability와 LPS로 활성화된 NO 그리고 IL-1α, IL-6, IL-10의 사이토카인 생성증가에 대한 영향을 확인하고자 하였다.

제안 방법

1×105cells/mL의 cell을 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고 CO2 배양기에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 없애고 포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 다양한 농도의 시료(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)를 각 well에 넣고 동시에 LPS를 단독처리(1 ㎍/mL)한 후 24시간 동안 배양하였다.
1×104 cells/well의 세포를 96 well plate에 100㎕씩 넣고 CO₂ 배양기에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 없애고 배양세포의 표면을 PBS 용액으로 씻어 처리하였다. PBS에 녹인 시료 (25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 동일한 양의 배지를 24 시간 동안 각 well에 처리하고 배양하였다. 배양이 완성된 PBS에 녹인 1 ㎎/mL MTT를 각 well에 100㎕씩 처리하여 빛이 들어오지 않도록 가리개로 막은 후 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
다양한 농도의 시료(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 LPS를 단독처리(1 ㎍/mL)한 후 배지에 담아 각 well에 처리하고 24 시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 후 상등액 100 ㎕을 채취하여 여기에 15분 동안 그리스 시약 100 ㎕을 혼합하여 반응시킨 후 Microplate Reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 일산화질소 생성 공식은 다음과 같다.
배양이 끝나면 세척 완충액로 세척한 뒤 각 well에 스트렙트아비딘-PE를 분주하고 37℃에서 30 분간 300～500 rSB의 조건으로 진동배양한다. 배양이 끝나면 세척 완충액으로 세척한 다음 각 well에 120 ㎕의 판독 완충액을 분주하고 37℃에서 5 분간 300～500 rSB의 조건으로 진동배양한 후 바이오 플렉스 어레이 리더기를 이용하여 측정코자 하는 사이토카인의 발현에 대한 영향을 계산하였다.
본 실험을 위해서 1×PBS(Sigma, USA), ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), FBS(Sigma, USA), penicillin(Sigma, USA), Trypsin-EDTA(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), DMSO(Sigma, USA), streptomycin(Sigma, USA), methyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), cytokine assay kit(Panomics, USA), MTT assay kit(Sigma, USA), NO assay kit(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), Fluo-4 calcium assay kit(Molecular Probes, USA) 등이 사용되었으며 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다.
본 연구에서는 상엽 물추출물(MF)을 대상으로 RAW 264.7 macrophage cells의 세포생존율과 LPS로 활성화된 NO, IL-1α, IL-6, IL-10의 사이토카인의 생성증가에 대한 효과를 측정하였다.
사이토카인 분비와 관련된 영향을 알아보기 위해 사이토카인 분석을 시행하였다. 1×10⁵cells/mL의 cell을 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고 CO₂ 배양기에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 없애고 포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 다양한 농도의 시료(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)를 각 well에 넣고 동시에 LPS를 단독처리(1 ㎍/mL)한 후 24시간 동안 배양하였다.
이에 본 연구에서는 상엽을 물추출하여 얻은 시료(MF)를 대상으로 RAW 264.7 macrophage cells의 세포 생존율과 LPS로 활성화된 NO, IL-1α, IL-6, IL-10의 사이토카인 생성증가에 대한 영향을 측정하였다.

대상 데이터

본 실험을 위해서 1×PBS(Sigma, USA), ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), FBS(Sigma, USA), penicillin(Sigma, USA), Trypsin-EDTA(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), DMSO(Sigma, USA), streptomycin(Sigma, USA), methyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), cytokine assay kit(Panomics, USA), MTT assay kit(Sigma, USA), NO assay kit(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), Fluo-4 calcium assay kit(Molecular Probes, USA) 등이 사용되었으며 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 clean bench (Intron Biotech, Korea), Bio-Plex 200(Bio-Rad, USA), CO₂ incubator(Nuaire, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), centrifuge (Hanil, Korea), fume hood (Hanil, Korea), research microscope (Becton dickinson, USA), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader(Bio-Rad, USA), water bath (Intron Biotech, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
실험에 사용된 상엽(Mori Folium)은 한국 서울의 동양허브 주식회사로부터 2017 년 8 월에 구입(NO; 2017-009)하였으며, 약재는 가천대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고 모든 약재는 실험 전에 불순물을 제거하기 위해 초음파 세척기를 이용하였다.
실험에 사용된 세포주는 mouse macrophage RAW 264.7 cells로서 한국세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
상엽을 50 g으로 측정한 후, 2,000 mL 1 차 증류수와 함께 환류추출기에 넣은 뒤 끓기 시작한 후 2 시간 가열하여 추출하였다. 추출액을 감압 여과한 뒤 농축액을 얻었으며, 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 실험에 사용하였다.

데이터처리

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군과 대조군과의 평균의 차이는 ANOVA test로 분석, Student's t-test로 p-value값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 검증하였다.

이론/모형

시료가 RAW 264.7 macrophage cells에 나타내는 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 1×104 cells/well의 세포를 96 well plate에 100㎕씩 넣고 CO₂ 배양기에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 없애고 배양세포의 표면을 PBS 용액으로 씻어 처리하였다.

성능/효과

1. 상엽 물추출물은 모든 농도에서 RAW 264.7 macrophage cells에 농도 의존적으로 유의한 독성을 유발하지 않았다.
2. 상엽 물추출물은 LPS(1 ㎍/mL)에 의해서 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 NO 생성증가를 모든 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 억제시켰다.
3. 상엽 물추출물은 LPS(1 ㎍/mL)에 의해서 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 IL-1α와 IL-6는 50 ㎍/mL 이상에서 생성증가를 농도 의존적으로 유의하게 억제시켰다.
본 실험에서는 RAW 264.7 macrophage cells에 상엽물추출물을 25 ㎍/mL 이상의 농도로 처리한 뒤에 37℃에서 24 시간동안 배양한 뒤에, MTT assay를 이용하여 확인한 결과 상엽 물추출물은 모든 농도(25 ㎍/mL 이상)에서 농도 의존적으로 RAW 264.7 macrophage cells에 독성을 유발하지 않았으며 이는 상엽 물추출물이 RAW 264.7 macrophage cells에 독성을 유발하지 않는 것을 나타낸다.
상엽 물추출물이 LPS(1 ㎍/mL)로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 IL-10 생성의 증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 24시간 동안 상엽 물추출물을LPS(1 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 macrophage cells에 처리한 결과 모든 농도(25 ㎍/mL 이상)에서 LPS(1 ㎍/mL)에 의한 IL-10 생성증가에 대한 유의한 억제가 나타나지 않았다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells에서 IL-1α 생성의 증가 대한 효과룰 알아보기 위하여 상엽 물추출물을 1 ug/mL LPS와 함께 24 시간 동안 처리한 결과 50 ug/mL 이상 농도에서 LPS에 의한 IL-1α 생성의 증가를 농도 의존적으로 억제하였다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells에서 IL-10 생성의 증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 상엽 물추출물을 1 ug/mL LPS와 함께 24 시간 동안 처리한 결과 LPS에 의한 IL-10 생성증가에 대한 유의한 억제가 나타나지 않았다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells에서 IL-6 생성의 증가 대한 효과를 알아보기 위하여 상엽 물추출물을 1 ug/mL LPS와 함께 24시간 동안 처리한 결과 50 ug/mL 이상 농도에서 LPS에 의한 IL-6 생성의 증가를 농도 의존적으로 억제하였다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 IL-1α 생성증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 24 시간 동안 상엽 물추출물을 LPS(1 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 macrophage cells에 처리한 결과 50 ㎍/mL 이상 농도에서 LPS(1 ㎍/mL)에 의한 IL-1α 생성증가를 농도 의존적으로 유의하게 억제하였다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 IL-6 생성증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 24시간 동안 상엽 물추출물을 LPS(1 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 macrophage cells에 처리한 결과 50 ㎍/mL 이상 농도에서 LPS(1 ㎍/mL)에 의한 IL-6 생성증가를 농도 의존적으로 유의하게 억제하였다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 NO 생성의 증가 대한 효과를 알아보기 위하여 상엽 물추출물을 1 ug/mL LPS와 함께 24시간 동안 처리한 결과 모든 농도(25 ug/mL 이상)에서 LPS에 의한 NO 생성의 증가를 농도 의존적으로 억제하였다.
상엽 물추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 NO 생성의 증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 24 시간 동안 상엽 물추출물을 LPS(1 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 macrophage cells에 처리한 결과 모든 농도(25 ㎍/mL 이상)에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 농도 의존적으로 유의하게 억제하였다. 이와같이 상엽 물추출물이 LPS(1 ㎍/mL)로 활성화된 RAW 264.
상엽 물추출물이 RAW 264.7 macrophage cells의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상엽 물추출물을 24 시간 동안 처리한 결과 25 ug/mL 이상의 모든 농도에서 세포생존률이 농도 의존적으로 증가하였다.
이상의 결과, 상엽 물추출물은 RAW 264.7 macrophage cells에 세포독성을 유발하지 않으면서도 LPS(1 ㎍/mL)로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 NO, IL-1α, IL-6의 생성증가를 25 ㎍/mL 이상의 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 억제시키는 등 RAW 264.7 macrophage cells와 관련된 염증메커니즘을 조절할 수 있는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과, 상엽 물추출물은 RAW 264.7macrophage cells에 유의한 세포독성을 유발하지 않으면서도 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage cells의 NO, IL-1α, IL-6의 생성증가를 유의하게 농도 의존적으로 억제시켰다. 이러한 결과는 상엽 물추출물이 RAW 264.

후속연구

7 macrophage cells와 관련된 염증메커니즘을 조절할 수 있는 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 또한 지속적인 연구를 통한 대식세포를 항염증과 관련된 신호전달경로를 확인하는 추가 실험이 필요하다고 사료된다.
7 macrophage cells의 NO, IL-1α, IL-6의 생성증가를 유의하게 농도 의존적으로 억제시켰다. 이러한 결과는 상엽 물추출물이 RAW 264.7 macrophage cells와 관련된 항염효과가 뛰어나 염증메커니즘을 조절할 수 있는 소재로서 활용가능성이 높음을 의미하며 향후 지속적인 연구를 통한 대식세포를 항염증과 관련된 신호전달경로를 확인하는 추가 실험이 필요하다고 사료된다.
대식세포의 핵으로의 NFκB 전위는 다양한 사이토카인 유전자들의 전사를 개시하는데 이들 전염증 사이토카인 IL-1, IL-6, CXCL8, IL-12 그리고 TNF-α는 감염된 조직에 국한되거나 신체 전부에 나타나는 강력한 효과를 갖는다. 이러한 염증 매개물질을 억제하는데 기여하는 물질을 발견한다면 각종 면역질환 치료에 도움이 될 것이다[9,11].

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	상엽의 기원은?	상엽은『神農本草經』에 처음 기록된 이래 疏散風熱, 淸肺潤燥, 淸肝明目의 효능이 있어, 風熱感冒, 肺熱燥咳, 頭暈頭痛, 目赤昏花를 치료하는 약물로 사용되어 왔다[1]. 상엽의 기원은 대한민국약전외한약(생약)규격집[2]에 “뽕나무 Morus alba Linné 또는 산뽕나무 Morus bombycis Koidz (뽕나무과 Moraceae)의 잎”라고 收載되어 있다.
	상엽의 특징은?	상엽은『神農本草經』에 처음 기록된 이래 疏散風熱, 淸肺潤燥, 淸肝明目의 효능이 있어, 風熱感冒, 肺熱燥咳, 頭暈頭痛, 目赤昏花를 치료하는 약물로 사용되어 왔다[1]. 상엽의 기원은 대한민국약전외한약(생약)규격집[2]에 “뽕나무 Morus alba Linné 또는 산뽕나무 Morus bombycis Koidz (뽕나무과 Moraceae)의 잎”라고 收載되어 있다.
	상엽의 성분으로 얻을 수 있는 효과는 무엇이 있는가?	18%, inkosterone, ecdysterone, hemolysin, chlorogen acid 등이 함유되어 있다[1]. 약리작용으로는 항비만 효과[3], 근위축 억제 효능[4], 간섬유화 억제 효과[5], 항당뇨 효과[6], 항산화 효과[7], 항피부 노화 효과[8] 등이 보고되어 있다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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