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문제 정의
- 이전 연구에서 berberine 물질에 관한 약리학적 효능이 충분히 진행되었으나, 항주름 화장품 소 재개발을 위한 MMPs와 그 조절인자 TIMPs의 연관성에 대한 검증은 미비하였다. 본 연구에서는 황련에서 분리한 berberine 을 이용하여 항산화 및 항주름 효과에 대해 검증하였다.
제안 방법
- 5% skim milk가 함유된 tris 완충 용액으로 1시간 blocking 한 후, MMP-2, MMP-9, TNFα, TIMP-1, TIMP-2, β-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다.
- Berberine의 MMP-2, MMP-9, TNF-α, TIMP-1, TIMP-2, GAPDH유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 CCD986sk 세포를 6 well에 1×105 cells/well에 되도록 분주하고 48시간 동안 배양하였다.
- Berberine의 섬유아세포에서의 TIMP-1, -2의 활성을 관찰하 고자 CCD-986sk 세포에 UVB조사 후 농도별(5, 10, 25) μg/ mL 시료를 처치하여 48시간 배양 후 단백질을 western blot analysis를 시행하였다(Fig. 5A).
- Berberine의 세포독성 여부를 확인하기 위해(6.25, 12.5, 25, 50, 100) μg/mL의 농도를 세포에 처리한 결과, 25 μg/mL 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타나 CCD-986sk세포에 독성이 없는 것으로 사료되어 25 μg/mL이하의 농도로 실험을 진행하였다(Fig. 1).
- Berberine이 피부 수분량 및 탄력성에 영향을 미치는지 알아 보기 위하여 CCD-986sk 세포에 UVB조사 후 농도별(5, 10, 25) μg/mL 시료를 처리하여 Hyaluronic acid 생성 효과를 측정하였다.
- Bradford assay로 단백질을 정량하였으며, 20 μL 의 단백질을 10%의 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 전기 영동한 후, 항체의 비특이 적결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 60 V에서 2시간 이상 transfer하였다.
- CCD-986sk 세포를 1×105 cell/wells로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후에 20 mJ/cm2 의 UVB로 자극 한 뒤 berberine 을 농도별(5, 10, 25 μg/mL)로 처리하여 48시간 배양하였다.
- CCD-986sk세포를 96 well plate에 5×103 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, berberine을 각각 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37 o C, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- Total RNA 2 μg과 PCR primer oligonucleotide를 RT-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 시행하였다.
- 동일 배지로 교체한 후 20 mJ/cm2 의 UVB로 자극 한 뒤, berberine을 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 따라 ROS Glo H2O2 assay를 수행하였다.
- 동일 배지로 교체한 후 20 mJ/cm2 의 UVB로 자극 한 뒤, berberine을 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다.
- 5% skim milk가 함유된 tris 완충 용액으로 1시간 blocking 한 후, MMP-2, MMP-9, TNFα, TIMP-1, TIMP-2, β-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore, MA, USA)를 이용하여 60분간 반응시킨 후 LAS 4000 분석기(Fuji Film Life Science, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상하였다.
- 배지를 제거한 후 20 mJ/cm2 의 UVB로 자극 한 뒤, berberine을 농도별(5, 10, 25) μg/mL로 처리하여 48시간 배양하였다.
- 세포배양액 내의 HA 생성량은 ELISA kit (Echelon, Salt Lake City, UT, USA)를 이용하여 측정하였다. CCD-986sk 세포는 DMEM 배지를 이용하여 5×104 cells/mL로 조절한 후 48 well plate에 접종하고, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- 세포에 20 mJ/cm2의 UVB를 자극한 뒤 5, 10, 25 μg/mL의 berberine을 처리하여 48시간 배양하였다.
- 25 g을 Sephadex LH20 컬 럼 크로마토그래피로 분리하였다. 용매는 H2O-MeOH을 0-100% 까지 농도로 높였으며 TLC를 실시하여 4개의 분획(Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4)으로 나누었다. Fr.
- RT의 조건은 42 o C에서 1시간 방치하여 cDNA를 제 조하고 94 o C에서 5분간 방치하여 reverse transcriptase를 불활성화 시켰다. 이후의 PCR 조건은 94에서 30초(denaturation), 50 o C에서 30초(annealing), 72 o C에서 90초(extension)의 반응을 30회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.
- 이후의 PCR 조건은 94에서 30초(denaturation), 50 o C에서 30초(annealing), 72 o C에서 90초(extension)의 반응을 30회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.2% agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 LAS 4000 image analyzer으로 확인하였다.
대상 데이터
- MMP-2, MMP-9, TNF-α, TIMP-1, TIMP-2, GAPDH 의 primary antibody와 secondary antibody는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 황련은 2016년 경북 의성군 봉양면 (주)옴니 허브로부터 건조된 시료를 구입하였으며, 깨끗이 세척한 뒤 실험재료로 사용하였다. 각 표본 및 추출물은 대구한의대학교 화장품약리학과 피부면역약리 실험실에 보관하고 있다.
- MMP-2, MMP-9, TNF-α, TIMP-1, TIMP-2, GAPDH 의 primary antibody와 secondary antibody는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37 o C, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 세포 독성 측정 및 배양을 위한 배지조성을 위해 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, 0.4% trypan blue stain 은 Gibco BRL Co. (Rockville, NE, USA)에서 구입하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 세포 독성 측정에 사용된 섬유아세포 CCD-986sk는 American Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 및 배양을 위한 배지조성을 위해 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, 0.
데이터처리
- 결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분 산분석(ANOVA: analysis of variance)프로그램을 이용하여 ttest를 이용하여 통계적 유의수준 p <0.05, 0.01에서 검증하였다.
이론/모형
- 광노화 된 피부는 세포 외 기질을 분해하는 MMP-1, -2, -9과 같은 MMPs의 발현 증가로 피부건조증과 주름이 형성된다. Berberine이 섬유아세포 내 UVB 자극에 의해 발현이 증가되는 MMP-2, -9에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 시행하였다. 그 결과 섬유아세포에 처리된 berberine 의 농도가 증가할수록 처리하지 않은 군에 비해 MMP-2, -9의 protein level 발현이 억제되었으며, MMP-2는 (10, 25) μg/mL, MMP-9은 25 μg/mL 농도에서 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
성능/효과
- Berberine이inflammatory cytokine의 발현에 영향을 주는지 알아보기 위해 섬유아세포에 UVB를 조사 후 berberine을 농도별 (5, 10, 25) μg/mL로 처리한 결과 UVB군에서는 TNF-α가 현저하게 증가되었으며 berberine을 처리한 군에서는 TNF-α 단백질 및 mRNA 발현이 낮아졌음을 확인하였다(Fig. 6).
- 많은 양의 자외선에 노출되면 피부에는 높은 농도의 활성산소종이 생성되며 피부세포 내에서의 신호전달 과정에 영향을 미쳐 피부주름과 관련된 전사인자들을 활성화 시킨다(Pentland등, 1995; Park등, 2010). CCD-986sk 세포에 대한 UVB 조사에 따른 ROS 생성량을 측정한 결과, UVB를 20 mJ/cm2의 선량을 조사한 그룹은 대조군에 비해 ROS 생성량이 약 2배 증가 되었다. UVB 조사 후 berberine을 농도별(5, 10, 25) μg/mL로 처리한 군은 농도의존 적으로 ROS 생성량이 감소되었으며 특히 25 μg/mL 농도에서 는 40% 이상의 높은 감소를 보였다(Fig.
- 그 결과 UVB군에서 TIMP-1, -2 발현을 현저히 감소시켰으며, berberine처리 후 농도의존적으 로 TIMP-1, -2 단백질 발현을 증가시켰다. RT-PCR 결과에서도 TIMP-1, -2의 mRNA 발현량이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 5B). TIMPs의 주된 생물학적 작용이 MMPs를 억제하는 것이며 그 중 TIMP-1은 MMP-9을, TIMP-2는 MMP-2에 각각 대항하여 피부 기저층의 기질분해작용을 억제한다는 보고가 있다(Terada 등, 1996; Gong 등, 2000).
- UVB 조사 후 berberine을 농도별(5, 10, 25) μg/mL로 처리한 군은 농도의존 적으로 ROS 생성량이 감소되었으며 특히 25 μg/mL 농도에서 는 40% 이상의 높은 감소를 보였다(Fig. 2)
- 5A). 그 결과 UVB군에서 TIMP-1, -2 발현을 현저히 감소시켰으며, berberine처리 후 농도의존적으 로 TIMP-1, -2 단백질 발현을 증가시켰다. RT-PCR 결과에서도 TIMP-1, -2의 mRNA 발현량이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig.
- Berberine이 피부 수분량 및 탄력성에 영향을 미치는지 알아 보기 위하여 CCD-986sk 세포에 UVB조사 후 농도별(5, 10, 25) μg/mL 시료를 처리하여 Hyaluronic acid 생성 효과를 측정하였다. 그 결과 berberine을 처리하였을 때 hyaluronic acid 양은 유의적으로 농도의존적 증가를 나타내었으며 이는 berberine 이 피부 보습력 개선 및 피부노화 방지에 효과가 있는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
- 그 결과 섬유아세포에 처리된 berberine 의 농도가 증가할수록 처리하지 않은 군에 비해 MMP-2, -9의 protein level 발현이 억제되었으며, MMP-2는 (10, 25) μg/mL, MMP-9은 25 μg/mL 농도에서 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4A).
- 또한 berberine의 처리에 따른 mRNA 발현을 관찰하고자 RT-PCR로 수행한 결과, house keeping gene 인 GAPDH 발현을 기준으로 수치 한 결과 농도가 높아짐에 따라 MMP-2, -9의 발현이 감소되었고 25 μg/mL 농도에서 유의성을 확인하였다(Fig. 4B).
- TIMPs의 주된 생물학적 작용이 MMPs를 억제하는 것이며 그 중 TIMP-1은 MMP-9을, TIMP-2는 MMP-2에 각각 대항하여 피부 기저층의 기질분해작용을 억제한다는 보고가 있다(Terada 등, 1996; Gong 등, 2000). 본 실험 결과에 따라 berberine에 의한 단백질 및 mRNA발현에서 MMP-2와 MMP-9은 감소하였고, TIMP-1과 TIMP-2는 증가함을 보여 berberine이 CCD-986sk 세포내에서 TIMP-1, -2 발현을 조절하여 MMP-2, -9을 감소시킴으로써 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 추측된다.
- 본 실험결과에도 UVB 단독 처리한 군에서 TNF-α와 MMP-9 발현이 증가되었으며 berberine 을 처리한 군은 TNF-α와 MMP-9의 발현이 동일하게 감소하는 것으로 나타났다.
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