[논문]개불의 체벽으로부터 i-type 라이소자임의 정제

오혜영; 박남규

doi:10.5352/jls.2018.28.3.300

개불의 체벽으로부터 i-type 라이소자임의 정제
Isolation of an Invertebrate-type Lysozyme from the Body Wall of Spoon Worm, Urechis unicinctus 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.3 = no.215, 2018년, pp.300 - 306

오혜영 (부경대학교 수산과학대학 생물공학과) , 박남규 (부경대학교 수산과학대학 생물공학과)

초록
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라이소자임은 선천성 면역 물질로 개불을 포함하는 여러 무척추동물의 병원균에 대한 방어에 주요하게 작용한다. 본 논문은 개불(Urechis unicinctus)의 체벽 조직 추출물로부터 무척추형 라이소자임의 정제와 그 특성에 관한 분석을 기술하고 있다. 체벽 추출물은 우선적으로 Sep-Pak C18 cartridge를 사용하여 부분적으로 분리되었으며, 분리된 분획 중 60% 메탄올에 용출된 분획이 Bacillus subtilis KCTC 1021에서 강한 항균활성을 나타내었다. 그 후 여러 단계의 역상과 이온교환 고속액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하여 항균성 물질이 정제되었으며, 분자량은 약 14 kDa이었다. 이 단백질의 일차서열은 LC-MS/MS를 통해 분석되었으며, 얻은 부분적 아미노산 서열을 NCBI BLAST를 통하여 분석해 본 결과, 이 항균성 물질은 다른 동물들로부터 동정된 무척추동물형 라이소자임(invertebrate-type lysozyme)의 서열과 유사도를 가지고 있어, 체벽으로부터 정제된 개불 라이소자임(Urechis unicinctus invertebrate-type lysozyme from body wall, Uu-iLysb)으로 명명하였다. 개불 라이소자임의 활성을 확인하기 위하여 항균활성 및 라이소자임 효소 활성실험을 진행한 결과, 개불 라이소자임이 항균활성과 라이소자임 효소활성 모두 강하게 가지고 있는 것을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Lysozymes are innate immune factors that play a critical role in the defense against pathogens in various invertebrate animals including spoon worms. In this study, an invertebrate-type lysozyme was isolated from the body wall of spoon worm, Urechis unicinctus. The acidified body wall extract was partially separated using a Sep-Pak C18 cartridge. Among the fractions, the materials that were eluted with 60% methanol/0.1% trifluoroacetic acid showed the most potent antimicrobial activity against Bacillus subtilis KCTC 1021. A series of high performance liquid chromatography (HPLC) steps were then utilized to isolate a single antimicrobial absorbance peak. The molecular weight of the antimicrobial peak was approximated using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), which was approximately 13 to 14 kDa. The partial primary structure of this antimicrobial protein that was analyzed, using LC-MS/MS, was CTGGRPPTCEDYAK (1611.69 Da). Homology search of these fourteen residues, using the National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool (NCBI BLAST), revealed that the isolated protein was similar to the invertebrate-type lysozymes described in other animals. Then, the antimicrobial and lysozyme enzymatic (muramidase) activities of this protein were assessed. The isolated protein possessed antimicrobial activity and potent muramidase activity, which were comparable to those of hen egg white lysozyme. Therefore, the isolated protein was designated as Urechis unicinctus invertebrate-type lysozyme from the body wall, Uu-iLysb.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

개불에서는 신경성 펩타이드인 urechistachykinins와 hemoglobin (UuHb-F-I)의 항균활성이 보고된 바 있으나, 이 종에서 균에 대한 방어체계와 면역에 관여하는 구성물질에 대한 충분한 연구는 진행되지 않았다[16, 23]. 따라서, 본 연구를 통하여 개불 체벽으로부터 항균성 단백질을 정제하고자 하였다.

제안 방법

3mm 크기의 clear zone을 관찰하였다. 가장 활성이 강했던 RM60을 사용하여 여러 단계의 HPLC 정제과정을 거쳐 하나의 항균성 물질을 정제하였다(Fig. 2). 먼저 RM60을 농축한 뒤 SP-5PW를 사용하여 물질을 분리한 결과, 0.
정제된 단백질의 라이소자임 효소 활성을 라이소자임 활성키트(Sigma-Aldrich, USA)의 Micrococcus lydeikticus를 분해하는 능력을 분석하는 것으로 측정하였다. 먼저 M.

대상 데이터

실험에 사용한 개불(Urechis unicinctus, 50마리)은 부산시 수영구 남천 해변시장에서 구입하여 13℃ 멸균 해수 환경에서 3일간 순치하였고, 이후 체벽을 채집하여 액체질소로 즉시 동결시킨 후 실험 사용까지 -75℃에 보관하였다.

이론/모형

정제 과정 중 추출물과 각 분획, 그리고 정제된 물질의 항균 활성은 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)법을 사용하여 측정하였다[22]. 정제 과정 중에는 B.
정제한 물질의 분자량을 알아보기 위해 SDS-PAGE를 하였다(Fig. 4B). 15% polyacrylamide gel에서 정제한 물질은 15kDa 크기의 표준물질보다 조금 더 아랫부분으로 이동하였으므로, 물질은 13-14 kDa 정도의 분자량을 가지는 것으로 예측되었다.

성능/효과

개불 라이소자임(Uu-iLysb)의 활성을 확인하기 위하여 항균활성 및 라이소자임 효소 활성실험을 진행한 결과, UuiLysb는 활성확인에 사용된 4균주 모두에서 활성이 관찰되었다(Fig. 6A). 가장 강한 활성은 B.
본 연구에서 개불의 체벽으로부터 정제된 Uu-iLysb는 아미노산 서열의 유사성과 라이소자임 활성을 가지고 있었다는 점에서 무척추동물형 라이소자임인 것으로 생각되며, 개불의 체벽에서 선천적 면역체계에 관여하여 중요한 역할을 하고 있을 것이라 여겨진다. 본 논문의 결과를 토대로 정확한 서열을 얻기 위하여 추후 cDNA 클로닝을 진행할 예정이며, 재조합 단백질을 생산하여 Uu-iLysb의 키틴분해활성과 이소펩타이드 분해활성을 확인할 계획이다.
5). 이러한 유사성에 따라 본 연구에서 개불 체벽으로부터 정제된 항균성 단백질을 개불 라이소자임(Urechis unicinctus invertebrate-type lysozyme from body wall, Uu-iLysb)로 명명하였다.

후속연구

본 연구에서 개불의 체벽으로부터 정제된 Uu-iLysb는 아미노산 서열의 유사성과 라이소자임 활성을 가지고 있었다는 점에서 무척추동물형 라이소자임인 것으로 생각되며, 개불의 체벽에서 선천적 면역체계에 관여하여 중요한 역할을 하고 있을 것이라 여겨진다. 본 논문의 결과를 토대로 정확한 서열을 얻기 위하여 추후 cDNA 클로닝을 진행할 예정이며, 재조합 단백질을 생산하여 Uu-iLysb의 키틴분해활성과 이소펩타이드 분해활성을 확인할 계획이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	라이소자임은 무엇에 대한 방어에 주요하게 작용하는가?	라이소자임은 선천성 면역 물질로 개불을 포함하는 여러 무척추동물의 병원균에 대한 방어에 주요하게 작용한다. 본 논문은 개불(Urechis unicinctus)의 체벽 조직 추출물로부터 무척추형 라이소자임의 정제와 그 특성에 관한 분석을 기술하고 있다.
	Urechis unicinctus는 분류계통 상 어떤 동물문에 속하는가?	개불(Urechis unicinctus)은 해양 무척추동물로서 중국, 러시아, 일본, 그리고 한국의 해변에 서식하고 있다. 개불은 의충동물문에 속하여 있으며, 조간대와 조하대의 부드러운 해양 토층에 서식하는 여과섭식자이다[3, 5]. 이러한 여과섭식자들은 해양토층과 해수 등의 주변 환경을 삼켜 여과하는 과정을 통하여 영양분을 섭취하는데, 개불의 경우 해양 토층에 U자 형태 굴의 벽에 점액 성분의 그물망을 부착해 둔 뒤 이 망에 걸려드는 영양분을 섭취한다[3, 5, 19].
	해양 무척추동물의 경우 어떤 척추동물에 비해 어떤 방어시스템을 가지고 있는가?	해양생물체는 바다의 극단적 환경적 변화와 진화론적 다양성에 기인하여 여러 생리활성 물질의 훌륭한 원천으로 여겨진다[10, 11, 15]. 특히 해양 무척추동물의 경우, 척추동물의 복잡한 면역체계에 비하여 간단한 방어시스템을 가지고 있다. 무척추동물은 제대로 된 적응면역체계를 가지고 있지 않으며, 혈구와 같은 면역세포의 매개에 의한 세포성 면역 또는 혈장의 체액성 면역과 같은 선천적 면역 반응에 의존하고 있다[2,14].

참고문헌 (27)

Bachali, S., Jager, M., Hassanin, A., Schoentgen, F., Jolles, P., Fiala-Medioni, A. and Deutsch, J. S. 2002. Phylogenetic Analysis of Invertebrate Lysozymes and the Evolution of Lysozyme Function. J. Mol. Evol. 54, 652-664.

상세보기
Beutler, B. 2004. Innate immunity: an overview. Mol. Immunol. 40, 845-59.

상세보기
Brusca, R. C. and Brusca, G. J. 2003. Invertebrates, Sinauer Associates.
Callewaert, L. and Michiels, C. W. 2010. Lysozymes in the animal kingdom. J. Biosci. 35, 127-160.

상세보기
Christopher, J. O. and David, J. 2002. Burrow irrigation behavior of Urechis caupo, a filter-feeding marine invertebrate, in its natural habitat. Mar. Ecol. Prog. Ser. 245, 149-155.

상세보기
Cong, L., Yang, X., Wang, X., Tada, M., Lu, M., Liu, H. and Zhu, B. 2009. Characterization of an i-type lysozyme gene from the sea cucumber Stichopus japonicus, and enzymatic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein. J. Biosci. Bioeng. 107, 583-588.

상세보기
Fradkov, A., Berezhnoy, S., Barsova, E., Zavalova, L., Lukyanov, S., Baskova, I. and Sverdlov, E. D. 1996. Enzyme from the medicinal leech (Hirudo medicinalis) that specifically splits endo- $\varepsilon$ (- $\gamma$ -Glu)-Lys isopeptide bonds: cDNA cloning and protein primary structure. FEBS Lett. 390, 145-148.

상세보기
Ito, Y., Yoshikawa, A., Hotani, T., Fukuda, S., Sugimura, K. and Imoto, T. 1999. Amino acid sequences of lysozymes newly purified from invertebrates imply wide distribution of a novel class in the lysozyme family. Eur. J. Biochem. 259, 456-461.

상세보기
Itoh, N. and Takahashi, K. G. 2007. cDNA cloning and in situ hybridization of a novel lysozyme in the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 148, 160-166.

상세보기
Jain, R., Sonawane, S. and Mandrekar, N. 2008. Marine organisms: Potential source for drug discovery.
Jha, R. K. and Zi-rong, XZ. 2004. Biomedical compounds from marine organisms. Mar. Drugs 2, 123-146.

상세보기
Joskova, R., Silerova, M., Prochazkova, P. and Bilej, M. 2009. Identification and cloning of an invertebrate-type lysozyme from Eisenia andrei. Dev. Comp. Immunol. 33, 932-938.

상세보기
McHenery, J. G., Birkbeck, T. H. and Allen, J. A. 1979. The occurrence of lysozyme in marine bivalves. Comp. Biochem. Physiol. B, Comp. Biochem. 63, 25-28.

상세보기
Montaser, R. and Luesch, H. 2011. Marine natural products: a new wave of drugs? Future Med. Chem. 3, 1475-1489.

상세보기
Munro, M. H. G., Blunt, J. W., Dumdei, E. J., Hickford, S. J. H., Lill, R. E., Li, S., Battershill, C. N. and Duckworth, A. R. 1999. The discovery and development of marine compounds with pharmaceutical potential. J. Biotechnol. 70, 15-25.

상세보기
Niu, R. and Chen, X. 2016. Full-Length cDNA, Prokaryotic Expression, and Antimicrobial Activity of UuHb-F-I from Urechis unicinctus. Biomed. Res. Int. 2016, doi:10.1155/2016/ 5683026.

상세보기
Paskewitz, S. M., Li, B. and Kajla, M. K. 2008. Cloning and molecular characterization of two invertebrate-type lysozymes from Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 17, 217-225.

상세보기
Putnam, N. H., Butts, T., Ferrier, D. E. K., Furlong, R. F., Hellsten, U., Kawashima, T., Robinson-Rechavi, M., Shoguchi, E., Terry, A., Yu, J. K., Benito-Gutierrez, E., Dubchak, I., Garcia-Fernandez, J., Gibson-Brown, J. J., Grigoriev, I. V., Horton, A. C., de Jong, P. J., Jurka, J., Kapitonov, V. V., Kohara, Y., Kuroki, Y., Lindquist, E., Lucas, S., Osoegawa, K., Pennacchio, L. A., Salamov, A. A., Satou, Y., Sauka- Spengler, T., Schmutz, J., Shin, I, T., Toyoda, A., Bronner- Fraser, M., Fujiyama, A., Holland, L. Z., Holland, P. W. H., Satoh, N. and Rokhsar, D. S. 2008. The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype. Nature 453, 1064-1071.

상세보기
Ruppert, E. E., Fox, R. S. and Barnes, R. D., 2004. Invertebrate Zoology: A Functional Evolutionary Approach, Thomson-Brooks/Cole.
Saurabh, S. and Sahoo, P. 2008. Lysozyme: an important defence molecule of fish innate immune system. Aquacult. Res. 39, 223-239.

상세보기
Schulenburg, H. and Boehnisch, C. 2008. Diversification and adaptive sequence evolution of Caenorhabditis lysozymes (Nematoda: Rhabditidae). BMC Evol. Biol. 8, 114.

상세보기
Seo, J. K., Crawford, J. M., Stone, K. L. and Noga, E. J. 2005. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster, Crassostrea virginica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998-2004.

상세보기
Sung, W. S., Park, S. H. and Lee, D. G. 2008. Antimicrobial effect and membraneactive mechanism of Urechistachykinins, neuropeptides derived from Urechis unicinctus. FEBS Lett. 582, 2463-2466.

상세보기
Takeshita, K., Hashimoto, Y., Ueda, T. and Imoto, T. 2003. A small chimerically bifunctional monomeric protein: Tapes japonica lysozyme. Cell. Mol. Life Sci. 60, 1944-1951.

상세보기
Xue, Q. G., Itoh, N., Schey, K. L., Li, Y. L., Cooper, R. K. and La Peyre, J. F. 2007. A new lysozyme from the eastern oyster (Crassostrea virginica) indicates adaptive evolution of i-type lysozymes. Cell. Mol. Life Sci. 64, 82-95.

상세보기
Zavalova, L., Baskova, I., Lukyanov, S., Sass, A., Snezhkov, E., Akopov, S., Artamonova, I., Archipova, V., Nesmeyanov, V. and Kozlov, D. 2000. Destabilase from the medicinal leech is a representative of a novel family of lysozymes. Biochim. Biophys. Acta. Protein Struct. Mol. Enzymol. 1478, 69-77.

상세보기
Zhang, H. W., Sun, C., Sun, S. S., Zhao, X. F. and Wang, J. X. 2010. Functional analysis of two invertebrate-type lysozymes from red swamp crayfish, Procambarus clarkii. Fish Shellfish Immunol. 29, 1066-1072.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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