[논문]제주도에 서식하는 식물 잎에서 분리된 6종의 국내 미기록 내생균 보고

박혁; 최영준; 엄안흠

doi:10.4489/kjm.20180045

제주도에 서식하는 식물 잎에서 분리된 6종의 국내 미기록 내생균 보고
Characterization of Six Novel Endophytic Fungi Isolated from Leaves of Plants Inhabiting Jeju Island 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.46 no.4, 2018년, pp.405 - 414

박혁 (한국교원대학교 생물교육과) , 최영준 (군산대학교 생물학과) , 엄안흠 (한국교원대학교 생물교육과)

초록
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제주도에 서식하는 다양한 식물의 잎에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주들은 형태적 특성 및 internal transcribed spacer, large subunit rDNA 영역 및 beta-tubulin rDNA 유전자의 염기서열의 계통 분석을 통해 종을 동정하였다. 그 결과 6종의 국내 미기록 내생균을 확인하였고, 확인된 종은 각각 Diaporthe goulteri, Diaporthe vaccini, Rhizosphaera pini, Valsa friesii, Xylaria primorskensis, Zalerion arboricola 이다. 확인된 6종의 미기록 내생균 균주의 형태적 특성 및 염기서열 계통분석의 결과에 대해 기술하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Endophytic fungi were isolated from the leaves of diverse plants inhabiting Jeju Island, Korea. The fungal isolates were identified through phylogenetic analyses incorporating nucleotide sequences derived from the internal transcribed spacer region, large subunit region of ribosomal DNA, and beta-tubulin gene. Our results identified six endophytic fungi previously unknown in Korea namely, Diaporthe goulteri, Diaporthe vaccini, Rhizosphaera pini, Valsa friesii, Xylaria primorskensis, and Zalerion arboricola were identified. Here, we present their cultural and morphological characteristics and phylogenetic relationship.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Colonies of strain P8 (Diaporthe goulteri) grown for 7 days on PDA (A) and MEA (G), conidia (M). Colonies of strain 17E026 (Diaporthe vaccinii) grown for 7 days on PDA (B) and MEA (H). Colonies of strain 16H073 (Rhizosphaera pini) grown for 7 days on PDA (C) and MEA (I), conidiophore and conidium (N, O). Colonies of strain 16H342 (Valsa friesii) grown for 7 days on PDA (D) and MEA (J). Colonies of strain 17E107 (Xylaria primorskensis) grown for 7 days on PDA (E) and MEA (K), conidia (P). Colonies of strain 16H107 (Zalerion arboricola) grown for 7 days on PDA (F) and MEA (L), conidiophore and conidia (Q, R). PDA, potato dextrose agar; MEA, malt extract agar (scale bar = 10 μm).
그림 Fig. 2. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a combined alignment of internal transcribed spacer, large subunit rDNA, and beta-tubulin rDNA sequences. Nectria dacryocarpa was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Bold letters indicates fungal strains isolated in this study.
그림 Fig. 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a combined alignment of internal transcribed spacer and large subunit rDNA sequences. Phomopsis tuberivora was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Bold letters indicates fungal strains isolated in this study.
그림 Fig. 4. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a combined alignment of internal transcribed spacer and large subunit rDNA sequences. Diaporthe acaciarum was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates. Bold letters indicates fungal strains isolated in this study.
그림 Fig. 5. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a combined alignment of internal transcribed spacer and large subunit rDNA sequences. Botryosphaeria dothidea was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Bold letters indicates fungal strains isolated in this study.
그림 Fig. 6. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a combined alignment of internal transcribed spacer and large subunit rDNA sequences. Glonium stellatum was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Bold letters indicates fungal strains isolated in this study.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 분리하여 동정한 국내 미기록 내생균에 대하여 각종의 형태적 특징과 염기서열 분석을 통한 계통분석 결과를 아래와 같이 제시하였다.
본 연구에서는 식물의 잎에서 분리된 내생균의 다양성 연구를 통해 확인된 6종의 국내 미기록 내 생균의 형태적 특성 및 분자생물학적 계통을 기술하고자 한다.
그 결과 6종의 국내 미기록 내생균을 확인하였고, 확인된 종은 각각 Diaporthe goulteri, Diaporthe vaccini, Rhizosphaera pini, Valsa friesii, Xylaria primorskensis, Zalerion arboricola 이다. 확인된 6종의 미기록 내생균 균주의 형태적 특성 및 염기서열 계통분석의 결과에 대해 기술하였다.

제안 방법

표면살균 처리된 잎을 적당한 크기로 잘라 potato dextrose agar (PDA) 배지에 4조각씩 치상하였다. 25℃의 암소에서 3~7일간 배양하면서 균사가 뻗어 나오면 새로운 PDA 배지에 계대하여 순수 분리하였고, 확보된 균주를 다시 PDA 배지와 malt extract agar (MEA) 배지에 3점 계대하여 7일간 동일한 조건으로 배양한 뒤 형태적 특성을 관찰하였다(Fig. 1). 염기서열 분석을 위하여 DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)의 protocol에 따라 균사에서 genomic DNA를 추출한 뒤 균 특이적인 프라이머인 ITS1F와 ITS4를 이용하여[4] internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭하였고, 프라이머 LR0R과 LR16을 이용하여[5] rDNA의 large subunit (LSU) 영역을, 프라이머 Bt2a와 Bt2b를 이용하여[6] beta-tubulin (TUB) 영역을 증폭하였다.
Annealing 온도는 ITS 영역은 50°C, LSU rDNA 영역은 44°C, TUB 영역은 55°C로 설정하여 수행하였으며, PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 22분간 전기영동을 실시하였고, 각각 target DNA 단편의 크기를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea).
제주도에 서식하는 다양한 식물의 잎에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주들은 형태적 특성 및 internal transcribed spacer , large subunit rDNA 영역 및 beta-tubulin rDNA 유전자의 염기서열의 계통 분석을 통해 종을 동정하였다. 그 결과 6종의 국내 미기록 내생균을 확인하였고, 확인된 종은 각각 Diaporthe goulteri, Diaporthe vaccini, Rhizosphaera pini, Valsa friesii, Xylaria primorskensis, Zalerion arboricola 이다.
5% agarose gel에서 22분간 전기영동을 실시하였고, 각각 target DNA 단편의 크기를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). 분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종들 간의 계통 분석을 통한 유연 관계를 확인하기 위해 MEGA7를 이용하여, ITS와 LSU rDNA 영역의 염기서열을 Concatenated alignment로 제작 후에 neighbor-joining 방법으로 계통수를 작성하였다. 분리된 균주의 생물표본은 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, 연구에 사용된 DNA 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등록하였다.
1). 염기서열 분석을 위하여 DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)의 protocol에 따라 균사에서 genomic DNA를 추출한 뒤 균 특이적인 프라이머인 ITS1F와 ITS4를 이용하여[4] internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭하였고, 프라이머 LR0R과 LR16을 이용하여[5] rDNA의 large subunit (LSU) 영역을, 프라이머 Bt2a와 Bt2b를 이용하여[6] beta-tubulin (TUB) 영역을 증폭하였다. Annealing 온도는 ITS 영역은 50°C, LSU rDNA 영역은 44°C, TUB 영역은 55°C로 설정하여 수행하였으며, PCR 산물은 1.
증류수로 세척된 잎 시료를 3%의 NaClO 용액으로 1분간 표면 살균한 뒤 다시 70% EtOH로 2분간 세척하였다. 표면살균 처리된 잎을 적당한 크기로 잘라 potato dextrose agar (PDA) 배지에 4조각씩 치상하였다. 25℃의 암소에서 3~7일간 배양하면서 균사가 뻗어 나오면 새로운 PDA 배지에 계대하여 순수 분리하였고, 확보된 균주를 다시 PDA 배지와 malt extract agar (MEA) 배지에 3점 계대하여 7일간 동일한 조건으로 배양한 뒤 형태적 특성을 관찰하였다(Fig.

대상 데이터

균 분리에 이용된 식물 재료는 구상나무(Abies koreana Wilson), 꽝꽝나무(Ilex crenata Thunb.), 층층이풀(Clinopodium chinense (Benth.) O. Ktze) 3종으로, 구상나무와 꽝꽝나무는 제주도 한라산의 해발 1600 m 부근(N33°21'44.8", E126°32'24.0"), 층층이풀은 제주도 서귀포의 이승이오름(N33°21'58", E126°36'14")에서 채집되었다.
분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종들 간의 계통 분석을 통한 유연 관계를 확인하기 위해 MEGA7를 이용하여, ITS와 LSU rDNA 영역의 염기서열을 Concatenated alignment로 제작 후에 neighbor-joining 방법으로 계통수를 작성하였다. 분리된 균주의 생물표본은 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, 연구에 사용된 DNA 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등록하였다.

성능/효과

원 기재문 에서는 분생자의 형태에 대해 투명한 타원형(elliptical) 혹은 난형(ovoid)으로 서술했으며[13], 이것은 본 연구에서 확인된 분생자의 특성과 일치한다[12]. ITS 영역과 LSU 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 R. pini AY183365.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 R. pini KY654326.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 3).
Picea속[10], Phaseolus속[11] 등 다양한 식물에서 내생균으로 분리된 기록들이 존재하며, 항암제로 사용되는 물질인 camptothecin을 분비할 수 있는 것으로 보고되어 있다[12]. ITS 영역과 LSU 영역, TUB 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 D. vaccinii KJ739493.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 D. vaccinii AF439630.1과 99%의 일치도를, TUB 염기서열은 D. vaccinii KC843224.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 2).
friesii는 PDA 배지에서 배양될 때 살균성을 가진 물질인 m-cresol 을 생산하는 것으로 보고된 바 있다[16]. ITS 영역과 LSU 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 V. friesii KM100568.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 V. friesii MH872251.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 4).
원 기재문에는 분생자에 대해 기술되지 않았으나, 본 연구에서는 분생자의 형태를 확인할 수 있었다. ITS 영역과 LSU 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 X. primorskensis KT192367.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 X. primorskensis MG012860.1과 98%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 5).
원 기재문에 기록된 분생자의 형태는 분생자경으로부터 분리되지 않고 서로 뭉쳐 있거나 이어져 있는 형태를 취하는 것으로 기술되어 있고[19], 본 연구에서 관찰된 분생자는 원 기재문의 기술과 일치하는 형태로 확인되었다. ITS 영역과 LSU 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 Z. arboricola KU705825.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 Z. arboricola KU705842.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 6).
원 기재문의 alpha-conidia가 투명한 방추형 혹은 원통형인 것으로 기록된 반면[7], 본 연구에서 확인된 분생자는 원 기재문에 기록된 분생자보다 길쭉하며 초승달처럼 휘어지는 형태로 관찰되었다. ITS 영역과 TUB 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 D. goulteri MF356583.1과 99%의 일치도를 보였고, LSU 염기서열은 D. goulteri KJ197290.1과 98%의 일치도를, TUB 염기서열은 D. goulteri KJ197270.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 2).
분리된 균주들은 형태적 특성 및 internal transcribed spacer , large subunit rDNA 영역 및 beta-tubulin rDNA 유전자의 염기서열의 계통 분석을 통해 종을 동정하였다. 그 결과 6종의 국내 미기록 내생균을 확인하였고, 확인된 종은 각각 Diaporthe goulteri, Diaporthe vaccini, Rhizosphaera pini, Valsa friesii, Xylaria primorskensis, Zalerion arboricola 이다. 확인된 6종의 미기록 내생균 균주의 형태적 특성 및 염기서열 계통분석의 결과에 대해 기술하였다.
arboricola는 1972년 Buczacki에 의해 최초로 기록된 종이며, 포자들이 나선형을 이루는 특징이 보고되어 있고 침엽수의 가지에서 분리된 것으로 기록되어 있다[19]. 원 기재문에 기록된 분생자의 형태는 분생자경으로부터 분리되지 않고 서로 뭉쳐 있거나 이어져 있는 형태를 취하는 것으로 기술되어 있고[19], 본 연구에서 관찰된 분생자는 원 기재문의 기술과 일치하는 형태로 확인되었다. ITS 영역과 LSU 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 Z.
원 기재문에서는 alpha-conidia 한가지의 형태가 기록되어 있었으나[7], 본 연구에서는 beta-conidia가 분생자가 확인되었다. 원 기재문의 alpha-conidia가 투명한 방추형 혹은 원통형인 것으로 기록된 반면[7], 본 연구에서 확인된 분생자는 원 기재문에 기록된 분생자보다 길쭉하며 초승달처럼 휘어지는 형태로 관찰되었다. ITS 영역과 TUB 영역의 염기서열 분석 결과 ITS 염기서열은 D.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	균 분리에 이용된 식물 재료는 무엇인가?	균 분리에 이용된 식물 재료는 구상나무(Abies koreana Wilson), 꽝꽝나무(Ilex crenata Thunb.), 층층이풀(Clinopodium chinense (Benth.) O. Ktze) 3종으로, 구상나무와 꽝꽝나무는 제주도 한라산의 해발 1600 m 부근(N33°21'44.8", E126°32'24.
	내생균이란?	내생균(endophytic fungi)은 식물체 내에서 살아가며 병증을 유발하지 않는 균류의 통칭이다[1]. 이러한 공생 관계는 대부분의 초본, 혹은 목본 식물에서 잎과 뿌리 등의 모든 조직 내에서 발견된다[1].
	내생균이 분비하여 식물을 외부의 병원체로부터 보호하는 것으로 알려진 2차 대사산물 중 많이 알려진 물질은?	내생균과 식물 간의 상리 공생 관계는 완전히 밝혀지지는 않았으나, 내생균은 2차 대사산물의 분비를 통해 식물을 외부의 병원체로부터 보호하는 것으로 알려져 있다[2]. 이러한 물질 중 많이 알려져 있는 물질은 주목나무속(Taxus spp.) 식물의 잎에 서식하는 내생균이 분비하는 항암작용 물질인 taxol이 있으며[3], 이와 같이 내생균이 분비하는 물질의 다양한 이용 가치로 인해 식물 내생균에 대한 연구의 필요성이 증가하고 있는 상황이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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