Dual infections of Tomato mosaic virus (ToMV) and Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), or Tomato mosaic virus (ToMV) and Tomato chlorosis virus (ToCV), detected in tomato fields located in Chungcheongnam-do in 2017원문보기
Demand for tomatoes has been increasing every year as people desire more healthy food. In Korea, tomatoes are mainly grown in the Chungnam, Chunnam and Kyungnam provinces. Recently, reports of whitefly-transmitted viral diseases have increased due to newly emerging whitefly pressures caused by clima...
Demand for tomatoes has been increasing every year as people desire more healthy food. In Korea, tomatoes are mainly grown in the Chungnam, Chunnam and Kyungnam provinces. Recently, reports of whitefly-transmitted viral diseases have increased due to newly emerging whitefly pressures caused by climate change in Korea. Specifically, in 2017, the main tomato growing areas, Buyeo and Nonsan in Chungnam, showed damage typical of viral infection; therefore, we investigated viral diseases in these areas. We collected samples with virus-like symptoms and found that not only whitefly transmitted Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and Tomato chlorosis virus (ToCV) were detected but also Tomato mosaic virus (ToMV, for which no specific vector is known) and Tomato spotted wilt virus (TSWV, transmitted by thrips). The ToMV-infected samples were mostly co-infected with either TYLCV or ToCV. Mixed infections of different combinations of TYLCV, ToCV and ToMV were detected with the mixed infection of two whitefly-transmitted viruses (TYLCV and ToCV) causing the most severe symptoms. According to the CP sequence of each virus, the 100% identities were shown to be Mexico/ABG73017.1 (TYLCV), Greece/CDG34553.1 (ToCV), China/AKN79752 (TSWV), and Australia/NP078449.1 (ToMV). Based on the sequence data, we presumed that these tomato infecting viruses were transmitted through insects and seeds introduced from neighboring countries.
Demand for tomatoes has been increasing every year as people desire more healthy food. In Korea, tomatoes are mainly grown in the Chungnam, Chunnam and Kyungnam provinces. Recently, reports of whitefly-transmitted viral diseases have increased due to newly emerging whitefly pressures caused by climate change in Korea. Specifically, in 2017, the main tomato growing areas, Buyeo and Nonsan in Chungnam, showed damage typical of viral infection; therefore, we investigated viral diseases in these areas. We collected samples with virus-like symptoms and found that not only whitefly transmitted Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and Tomato chlorosis virus (ToCV) were detected but also Tomato mosaic virus (ToMV, for which no specific vector is known) and Tomato spotted wilt virus (TSWV, transmitted by thrips). The ToMV-infected samples were mostly co-infected with either TYLCV or ToCV. Mixed infections of different combinations of TYLCV, ToCV and ToMV were detected with the mixed infection of two whitefly-transmitted viruses (TYLCV and ToCV) causing the most severe symptoms. According to the CP sequence of each virus, the 100% identities were shown to be Mexico/ABG73017.1 (TYLCV), Greece/CDG34553.1 (ToCV), China/AKN79752 (TSWV), and Australia/NP078449.1 (ToMV). Based on the sequence data, we presumed that these tomato infecting viruses were transmitted through insects and seeds introduced from neighboring countries.
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제안 방법
12.9 µL를 섞고 94℃ 5분 반응 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분으로 30cycle, 그리고 추가로 72℃ 5분 반응조건으로 진행하였다.
증폭된 PCR product를 정제한 후(The Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega Inc, Korea), Topo vector (All in one PCR Cloning Kit,BIOFACT Inc, Korea)에 cloning하였다. Cloning확인은 Vector의 MCS (multiple cloning site)에 있는 Enzyme site를 참고하여 알맞은 restriction enzyme을 사용하여 digestion된 product의 size를 전기영동상에서 확인 후, Sequence 분석(Macrogen Inc, Korea)을 실시하여 진행하였다. 그 후, Sequence 분석 결과를 바탕으로 각 바이러스의 근연 관계를 살펴보았다.
Cloning확인은 Vector의 MCS (multiple cloning site)에 있는 Enzyme site를 참고하여 알맞은 restriction enzyme을 사용하여 digestion된 product의 size를 전기영동상에서 확인 후, Sequence 분석(Macrogen Inc, Korea)을 실시하여 진행하였다. 그 후, Sequence 분석 결과를 바탕으로 각 바이러스의 근연 관계를 살펴보았다.
추출된 RNA를 template로 각각 2000 ng/µL의 농도로 정량적으로 cDNA를 합성하였다(ReverTra Ace-α-®,TOYOBO Inc). 그리고 미국 국립생물정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)의 유전자 염기서열을 참고하여 각 바이러스의 외피 단백질 염기서열을 바탕으로 바이러스 진단용 PCR primer를 제작하였다(Table 1). Reverse transcription PCR (RT-PCR)은 GENET BIO Inc의 Prime Taq DNA polymerase 사용하여 진행하였다.
위의 자료를 통해 알 수 있듯이 기후변화와 함께 토마토에 발생하는 바이러스 병에 의한 피해가 심각해지고 있기 때문에, 토마토에 발생하는 바이러스를 파악하고자 토마토가 가장 많이 생산되는 충남 부여와 논산에서 바이러스에 감염된 샘플을 채집하여 진단하였다. 또한, 진단된 샘플로부터 바이러스의 외피 단백질의 염기서열을 조사하여 비교하였다.
NS에서는 TSWV가 진단 되었고, N에서는TYLCV와 ToCV의 복합 감염을 확인 할 수 있었다(Table 2). 본 연구에서 조사한 TYLCV, ToCV, TSWV, ToMV와 기존에 보고되었던 국내, 국외의 분리 주 간의 유전적 상관관계를 조사하기 위하여 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등록된 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 각각의 계통수 분석을 실시하였다. 연구한 결과를 통해 TYLCV 아미노산 서열을 분석한 결과 BK1-1의 샘플은 멕시코에서 보고된 TYLCV (ABG73017.
위의 자료를 통해 알 수 있듯이 기후변화와 함께 토마토에 발생하는 바이러스 병에 의한 피해가 심각해지고 있기 때문에, 토마토에 발생하는 바이러스를 파악하고자 토마토가 가장 많이 생산되는 충남 부여와 논산에서 바이러스에 감염된 샘플을 채집하여 진단하였다. 또한, 진단된 샘플로부터 바이러스의 외피 단백질의 염기서열을 조사하여 비교하였다.
증폭된 PCR product를 정제한 후(The Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega Inc, Korea), Topo vector (All in one PCR Cloning Kit,BIOFACT Inc, Korea)에 cloning하였다.
진단 결과를 바탕으로 각 바이러스 외피 단백질의 염기서열을 분석하기 위하여 샘플과 맞는 각 바이러스 외피 단백질 primer를 이용하여 PCR를 수행하였다(Blend Taq®, TOYOBO Inc, Japan).
충청남도 부여군과 논산시에서 토마토 바이러스에 감염이 의심되는 토마토 잎을 채집하였다. 토마토의 바이러스 병징에는 황화(yellowing), 모자이크(mosaic), 위축(dwarf), 반점(spot) 등이 있으며, 이러한 바이러스 병징이 나타나는 토마토 잎을 선별하여 채집하였다(Fig.
충청남도 부여군과 논산시에서 토마토 바이러스에 감염이 의심되는 토마토 잎을 채집하였다. 토마토의 바이러스 병징에는 황화(yellowing), 모자이크(mosaic), 위축(dwarf), 반점(spot) 등이 있으며, 이러한 바이러스 병징이 나타나는 토마토 잎을 선별하여 채집하였다(Fig. 1). 채집된 시료의 total RNA는 Trizol Reagent (Life Technologies,Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 700 µL Trizol과 250 µL의 chloroform을 사용하여 추출하고, -70℃에 보관하였다.
이론/모형
그리고 미국 국립생물정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)의 유전자 염기서열을 참고하여 각 바이러스의 외피 단백질 염기서열을 바탕으로 바이러스 진단용 PCR primer를 제작하였다(Table 1). Reverse transcription PCR (RT-PCR)은 GENET BIO Inc의 Prime Taq DNA polymerase 사용하여 진행하였다. 10 X buffer 2 µL, dNTP 1 µL, Forward Primer 1 µL (10 pmol), Reverse Primer 1 µL (10 pmol), Prime Taqpolymerase 0.
성능/효과
9 µL를 섞고 94℃ 5분 반응 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분으로 30cycle, 그리고 추가로 72℃ 5분 반응조건으로 진행하였다. RT-PCR 결과는 1.2% Agarose Gel에 PCR product를 전기영동하여 확인하였다.
1와 100% 동일하였다(Table 3). ToCV의 아미노산을 분석한 결과에서는 그리스에서 보고된 분리주와 99% 일치 하였으며 TSWV는 중국분리주 AKN79752.1과 100% 동일하였다(Table 3) 또한 ToMV는 호주 분리주인 NP_078449.1과 100% 일치하였다(Table 3).
제작된 프라이머(Table 1)를 이용하여 바이러스 진단 결과 동시 감염이 검출이 높았다. 바이러스 진단 결과, BK1에서 TYLCV와 ToMV의 복합 감염이 나타났고, BS와 BK2에서는 ToCV와 ToMV의 복합 감염이 나타났다. NS에서는 TSWV가 진단 되었고, N에서는TYLCV와 ToCV의 복합 감염을 확인 할 수 있었다(Table 2).
본 연구에서 조사한 TYLCV, ToCV, TSWV, ToMV와 기존에 보고되었던 국내, 국외의 분리 주 간의 유전적 상관관계를 조사하기 위하여 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등록된 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 각각의 계통수 분석을 실시하였다. 연구한 결과를 통해 TYLCV 아미노산 서열을 분석한 결과 BK1-1의 샘플은 멕시코에서 보고된 TYLCV (ABG73017.1) 와 아미노산 서열이 100% 일치 하였으며 N-4는 기보고된 국내 분리주 ADT65383.1와 100% 동일하였다(Table 3). ToCV의 아미노산을 분석한 결과에서는 그리스에서 보고된 분리주와 99% 일치 하였으며 TSWV는 중국분리주 AKN79752.
TSWV에 감염된 식물은 초기에 스턴팅 증상이 나타나고 심할 경우 식물이 죽게 된다. 제작된 프라이머(Table 1)를 이용하여 바이러스 진단 결과 동시 감염이 검출이 높았다. 바이러스 진단 결과, BK1에서 TYLCV와 ToMV의 복합 감염이 나타났고, BS와 BK2에서는 ToCV와 ToMV의 복합 감염이 나타났다.
토마토 재배지역의 바이러스 발병 조사를 통하여 본 연구팀은 대부분의 시료 샘플에서 복합 감염이 발생 진행되고 있음을 확인하였다. 담배가루이에 의한 TYLCV와 ToCV 단독 및 복합 감염을 예측할 수 있으나 종자 전염인 ToMV와의 복합 감염은 종자에 의한 1차 감염 후 가루이에 의한 2차 감염으로 예측할 수 있다.
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