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문제 정의
- 따라서 본 연구진은 발효유 시장의 트렌드를 파악하고, 2015년 식품공전 유산균 수 시험법 개정이 3년 지난 현시점에서 Bifidobacterium을 1천만 마리 이상 함유하고 있다고 표시한 시중 유통 중인 ‘비피더스’ 제품을 대표적인 사례로 모니터링 함으로써 각 제조사의 발효유 내 유산균 정도관리 실태를 파악하고 이에 관한 제도관리의 필요성을 점검하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- TOS-MUP agar에서 형성된 집락이 비피더스균이 맞는지를 확인 하기 위하여 하나의 plate 당 임의로 세 개의 집락을 선택해 대전 솔젠트(Solgent, Daejeon Korea)에 16S rRNA 염기서열 분석을 하였다. TOS-MUP agar에서 형성된 집락의 16S rRNA 분석 결과, 하나의 double peak가 떠 정확한 동정을 할 수 없었던 집락을 제외하고는 모두 비피더스균임이 확인되었고, 그 중 Bifidobacterium animalis subsp.
- 구매 당일 3社 제품에 대하여 각각 총 유산균 수와 비피더스균 수를 측정하였고, 유통기한 종료일에도 총 유산균 수와 비피더스균 수를 한번 더 측정하였다. 3社 제품 모두 유통기한이 종료되면 다시 제품들을 구매하는 방식으로 위의 시행을 총 5회 반복하였다.
- 국내 식품공전의 유산균 시험법(MFDS, 2018a)은 2015년 10월 그 분류와 사용되는 배지의 내용이 개정되었다. 기존 비피더스균 측정에 사용되었던 BL agar가 총 유산균 수 시험에 사용되도록 변경되었고, 비피더스균 측정에는 새로운 TOS-MUP agar가 추가되었다. 제조사들은 이러한 관련 시험법의 개정에 정확히 반영할 필요가 있다.
- 따라서 1996년부터 지금까지 유통 판매되고 있는 ‘비피더스’ 제품 내 비피더스균의 함량 표기가 현재에도 제대로 이루어지고 있는지 확인하기 위해, 비피더스균 함량을 별도로 표시하고, 제품의 이름을 ‘비피더스’로 사용하는 A, B, C 社의 액상형 비피더스 사과(이하 ‘비피더스 사과’라고 함) 제품에 대하여 총 유산균 및 비피더스균 함량 분석을 구매 직후와 유통기한 종료일에 각각 실시하였으며, 16S rRNA gene PCR 동정을 통해 Bifidobacterium 속의 여부를 확인하였다.
- 본 연구진은 3 社의 ‘비피더스’ 제품이 유산간·구균에 대해서 언급하고 있지 않으므로 유산간·구균에 초점을 두지 않고 총 유산균의 함량을 측정했다.
대상 데이터
- 2015년 개정된 현행 식품공전(MFDS, 2018a)에 따르면 비피더스균을 유산간·구균과 구분해서 산정하는 경우는 TOS-MUP agar를 사용하도록 되어있으며 총 유산균 수 또는 유산간·구균의 산정에는 BCP 첨가배지를 사용하도록 규정되어 있다. 따라서 본 연구진은 총 유산균의 집락을 계수하기 위해 Eiken chemical 社의 BCP plate count agar (Tochigi, Japan)를 사용하였으며, 비피더스균의 집락을 계수하기 위하여 MB cell 社의 TOS-MUP agar (Seoul, Korea)를 사용하였다. 총 유산균 및 비피더스균의 산출을 위해 2018년 현재 고시된 식품공전 중 7.
- 본 연구에 사용한 발효유는 현재 시중에서 쉽게 접할 수 있는 A, B, C 社의 ‘비피더스 사과’ 제품이며 유통 기한이 2일 이상 차이가 나지 않도록 각 4개씩 총 12개를 동일한 날, 동일한 장소에서 구매하였다.
- 사용된 primer의 염기서열로는 universal primer인 27F primer (5′-GTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R primer (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)가 이용되었다.
데이터처리
- 구매 당일과 유통기한 당일의 각각의 분석 시료 당 비피더스균 함량 변화 추이를 ‘before-after graph’를 이용해 paired t-test로 분석한 결과 Fig. 2와 같이 나타났다.
- 구매 당일과 유통기한 당일의 각각의 분석 시료 당 총 유산균 함량 변화 추이를 ‘before-after graph’를 이용해 paired t-test로 분석한 결과 Fig. 3과 같이 나타났고, 총 유산균 함량은 유통기한 당일이 되어도 구매 당일의 유산균 함량과 유의미한 차이를 보이지 않았다.
이론/모형
- 총 유산균 및 비피더스균의 산출을 위해 2018년 현재 고시된 식품공전 중 7. 일반시험법 4.9 유산균수 시험방법(MFDS, 2018a)을 이용하였다.
성능/효과
- A, B, C 3 社의 총 유산균 함량 분석 결과(Table 3), 구매 당일에는 C, B, A 社 순으로 유의적인 차이를 보이며 총 유산균이 함유되어 있었으며(p<0.05), 유통기한 당일 제품에서는 총 유산균 함량에 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- A, B, C 社 모두 비피더스균 수를 제품 1 mL 당 10,000,000마리 이상으로 표시하였으나 B 社 제품의 비피더스균 함량은 구매 초기 제품에서 1 mL 당 2,791,000마리, 유통기한 당일 제품에서 1 mL 당 2,122,000마리가 함유되어 있었으며, 표시해 놓은 10,000,000마리에 현저히 못 미치는 수치로 표시기준에 미달했다. B 社의 비피더스균 함량이 자체적으로 표시해 놓은 함량에 미치지 못하는 이유는 B 社의 비피더스균 수 정도관리가 아직 새롭게 개정된 식품공전 시험법을 반영하지 못한 것으로 사료된다.
- TOS-MUP agar에서 형성된 집락이 비피더스균이 맞는지를 확인 하기 위하여 하나의 plate 당 임의로 세 개의 집락을 선택해 대전 솔젠트(Solgent, Daejeon Korea)에 16S rRNA 염기서열 분석을 하였다. TOS-MUP agar에서 형성된 집락의 16S rRNA 분석 결과, 하나의 double peak가 떠 정확한 동정을 할 수 없었던 집락을 제외하고는 모두 비피더스균임이 확인되었고, 그 중 Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain YIT 4121으로 확인되었다(Table 4).
- TOS-MUP agar에서 형성된 집락의 16S rRNA 분석 결과, 하나의 double peak가 떠 정확한 동정을 할 수 없었던 집락을 제외하고는 모두 비피더스균임이 확인되었고, 그 중 Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain YIT 4121으로 확인되었다(Table 4). Bifidobacterium animalis subsp.
- A 社의 구매 당일 제품에서 비피더스균 함량은 1 mL 당 118,200,000마리였고 유통기한 당일 제품 103,700,000마리였다. 가장 비피더스균 함량이 낮은 B 社 제품보다 구매당일 제품에서 약 42배 이상, 유통기한 당일 제품에서 약 48배 이상 비피더스균을 많이 함유하고 있었다.
- 그 결과 A 社 제품의 비피더스균 함량이 구매 초기 제품 및 유통기한 당일 제품에 관계없이 유의적으로 B, C 社의 비피더스균 함량에 비해 많았다(Table 2). A 社의 구매 당일 제품에서 비피더스균 함량은 1 mL 당 118,200,000마리였고 유통기한 당일 제품 103,700,000마리였다.
- 그 결과 A, B, C 社 제품 모두의 비피더스 함량은 감소하는 경향을 보였으나 A와 B 社는 유의미한 차이를 보이지 않았고, C 社에서만 유의미한 감소를 보였다(p<0.05).
- 식품의 기준 및 규격 개정고시 2015-78호 이후로 국내 식품공전의 유산균 시험법의 분류는 총 유산균 수 측정방법과 유산간·구균 및 비피더스균 측정방법으로 재분류 되었고, 기존의 비피더스균 측정에 사용되었던 Briggs liver agar (BL agar)가 총 유산균 수 측정 배지로 변경되었고, 또한 비피더스균 측정에 사용되었던 Bifidobacterium selective agar (BS agar)가 삭제되었으며, transgalacto-oligosaccharides with mupirocin agar (TOS-MUP agar)가 비피더스균 측정에 새로이 추가되었고, 총 유산균 수 측정을 위해서 de Man Rogosa and Sharpe agar (MRS agar)가 추가되었다(MFDS, 2015).
- 하지만 본 연구진의 모니터링 결과, 식품공전 유산균 수 시험법이 개정된 지 3년이 지난 현 시점에서 시중 유통 중인 3 社 ‘비피더스’제품 중 비피더스균 함량이 제품에 명시된 함량에 미치지 못한 경우를 확인하였다.
후속연구
- 하지만 발효유 제조 시 시스테인, 유청 단백질, 산-카세인 가수분해물 또는 트립톤의 첨가를 통하여 비피더스균의 생존능력을 개선시킬 수 있으며 시스테인의 첨가를 통해 Streptococcus thermophilus의 생존능력을 개선시킬 수 있고(Dave과 Shah, 1998), 마늘즙 첨가를 통해 전반적으로 유산균의 생장이 촉진될 수 있는 등(Lee 등, 2009), 발효유 조성에 따라 발효유 내 유산균의 생존 능력을 향상시킬 수 있다. C 社의 비피더스균 함량이 유의적으로 감소함이 관찰됨에 따라 제품 조성에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 본 연구진이 수행한 비피더스균 이외에도 수 많은 유산균들의 학명이 각종 발효유 제품에 표시되어 있으나, 아직까지 해당 유산균 함량만을 산출할 수 있는 시험법은 없는 실정이다. 이 또한 검증할 수 있는 시험법을 식품공전 유산균 시험법에 반영하는 것이 필요하며, 제조사도 자발적으로 발효유 유산균 정도관리에 노력을 하여야 할 것이다.
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