두릅 아세트산 에틸 분획물의 산화방지 효과 및 알코올에 대한 간세포 보호효과 Antioxidant capacity and hepatoprotective effect of ethyl acetate fraction from shoot of Aralia elata on alcohol-induced cytotoxicity원문보기
본 연구에서는 두릅(shoot of Aralia elata)의 분획물이 가지는 산화방지 효과와 간세포 보호효과를 확인하고 이에 영향을 주는 생리활성물질을 분석하고자 하였다. 두릅의 각 분획물을 이용하여 총 페놀 함량, 산화방지 능력(ABTS와 DPPH 라디칼 제거 활성)의 측정을 통해 아세트산 에틸 분획물이 다른 분획물 대비 가장 높은 산화방지 능력을 가진 것을 확인하였다. 두릅의 아세트산 에틸 분획물을 이용하여 지방질과산화물의 생성 억제 능력을 확인한 결과 역시 우수한 억제 활성효과를 나타내었다. 그리고 두릅 아세트산 에틸 분획물은 간세포(H4IIE와 HepG2)에서 에탄올과 과산화수소에 의한 강한 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었으며, 생존율 또한 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 HepG2 세포에서 알코올에 의한 지방질 축적을 유도하였을 때 두릅의 아세트산 에틸 분획물이 지방질 축적의 억제 효과도 가지는 것으로 나타났다. 이러한 두릅 아세트산 에틸 분획물의 생리활성물질을 확인하기 위해 HPLC를 분석한 결과 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산이 주요 생리활성물질임을 확인하였다. 본 연구의 결과를 바탕으로 고려할 때, 두릅의 아세트산 에틸 분획물은 우수한 산화방지 능력과 간세포 보호 능력을 나타냄에 따라 간 질환을 예방할 수 있는 천연물 유래 건강기능식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 두릅(shoot of Aralia elata)의 분획물이 가지는 산화방지 효과와 간세포 보호효과를 확인하고 이에 영향을 주는 생리활성물질을 분석하고자 하였다. 두릅의 각 분획물을 이용하여 총 페놀 함량, 산화방지 능력(ABTS와 DPPH 라디칼 제거 활성)의 측정을 통해 아세트산 에틸 분획물이 다른 분획물 대비 가장 높은 산화방지 능력을 가진 것을 확인하였다. 두릅의 아세트산 에틸 분획물을 이용하여 지방질과산화물의 생성 억제 능력을 확인한 결과 역시 우수한 억제 활성효과를 나타내었다. 그리고 두릅 아세트산 에틸 분획물은 간세포(H4IIE와 HepG2)에서 에탄올과 과산화수소에 의한 강한 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었으며, 생존율 또한 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 HepG2 세포에서 알코올에 의한 지방질 축적을 유도하였을 때 두릅의 아세트산 에틸 분획물이 지방질 축적의 억제 효과도 가지는 것으로 나타났다. 이러한 두릅 아세트산 에틸 분획물의 생리활성물질을 확인하기 위해 HPLC를 분석한 결과 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산이 주요 생리활성물질임을 확인하였다. 본 연구의 결과를 바탕으로 고려할 때, 두릅의 아세트산 에틸 분획물은 우수한 산화방지 능력과 간세포 보호 능력을 나타냄에 따라 간 질환을 예방할 수 있는 천연물 유래 건강기능식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
To evaluate physiological effect of Aralia elata, in vitro antioxidant activity and hepatic protective effects were investigated. Ethyl acetate fraction from Aralia elata (EFAE) had higher total phenolic content than other fractions (n-hexane, chloroform, and distilled water layers). EFAE also showe...
To evaluate physiological effect of Aralia elata, in vitro antioxidant activity and hepatic protective effects were investigated. Ethyl acetate fraction from Aralia elata (EFAE) had higher total phenolic content than other fractions (n-hexane, chloroform, and distilled water layers). EFAE also showed significantly greater radical scavenging activity against 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), than other fractions. Moreover, EFAE showed dose-dependent inhibitory effect of malondialdehyde (MDA). Hepatoprotective effects of EFAE against ethanol- and $H_2O_2$-induced oxidative stress and cytotoxicity in H4IIE and HepG2 hepatic cells were examined using 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) and 3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The results showed that EFAE reduced cellular oxidative stress, and increased hepatic cell viability. In addition, EFAE inhibited ethanol-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Finally, physiological substances of EFAE were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC), and the major bioactive compounds identified were 3,5-dicaffeoylquinic acid and chlorogenic acid.
To evaluate physiological effect of Aralia elata, in vitro antioxidant activity and hepatic protective effects were investigated. Ethyl acetate fraction from Aralia elata (EFAE) had higher total phenolic content than other fractions (n-hexane, chloroform, and distilled water layers). EFAE also showed significantly greater radical scavenging activity against 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), than other fractions. Moreover, EFAE showed dose-dependent inhibitory effect of malondialdehyde (MDA). Hepatoprotective effects of EFAE against ethanol- and $H_2O_2$-induced oxidative stress and cytotoxicity in H4IIE and HepG2 hepatic cells were examined using 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) and 3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The results showed that EFAE reduced cellular oxidative stress, and increased hepatic cell viability. In addition, EFAE inhibited ethanol-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Finally, physiological substances of EFAE were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC), and the major bioactive compounds identified were 3,5-dicaffeoylquinic acid and chlorogenic acid.
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문제 정의
그 결과 각 분획물에서 노말 헥세인 층은 13.42± 0.52 mg GAE/g, 클로로폼 층은 16.33±1.18 mg GAE/g, 아세트산에틸 층은 258.92±0.52 mg GAE/g, 증류수 층은 69.58±0.38 mg GAE/g으로 각각 나타나 시료 중에서 아세트산 에틸 분획물이 가장 많은 폴리페놀 성분을 함유한 것으로 나타났으며, 이후에 각분획물이 가지는 산화방지 능력을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
이외에도 항염증(Lee와 Jeong, 2009), 피부 광노화 억제(Yang과 Kwak, 2016)에 대한 효과가 보고되어 있지만, 두릅이 가지는 간세포 보호효과에 관한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 두릅이 가지는 산화방지 효과에서 기인되는 알코올에 대한 간세포 보호효과와 이로 인한 지방 축적의 억제 효과를 세포 수준에서 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 두릅(shoot of Aralia elata)의 분획물이 가지는 산화방지 효과와 간세포 보호효과를 확인하고 이에 영향을 주는 생리활성물질을 분석하고자 하였다. 두릅의 각 분획물을 이용하여 총 페놀 함량, 산화방지 능력(ABTS와 DPPH 라디칼 제거 활성)의 측정을 통해 아세트산 에틸 분획물이 다른 분획물 대비 가장 높은 산화방지 능력을 가진 것을 확인하였다.
제안 방법
만큼 분주하여 24시간 동안 배양 하여 부착시킨 뒤 소태아혈청이 들어있지 않은 저 포도당(1 g/L) DMEM 배지로 교체하여 24시간 배양하였다. 24시간이 지난 후 150 mM 에탄올이 첨가된 저 포도당 DMEM 배지를 첨가해 주었고 두릅 아세트산 에틸 분획물도 농도별로 처리하였다. 이후 5일 동안 에탄올과 시료가 포함되어 있는 신선한 배지로 매일 교체해 주었다.
MTT 시약을 처리한 후 37℃에서 배양하여 미토콘드리아에 의해 결정(formazan)을 형성하게 하였고, 3시간 뒤, 배지와 시약을 제거한 후 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 100 µL 처리하여 마이크로플레이트 판독기(model 680, Bio-Rad, Tokyo, Japan)를 이용하여 570 nm (reference wavelength: 690 nm)에서 흡광도를 측정하였다.
간세포에서 에탄올과 과산화수소에 대한 두릅 아세트산 에틸분획물의 보호효과를 확인하기 위해서 MTT 환원 측정법을 이용하여 세포 생존율을 확인하였다(Fig. 5). 에탄올을 처리한 경우 대조군(100%) 대비 H4IIE 세포는 72.
이 혼합액은 760 nm에서 흡광도(Libra S32PC, Biochrom Ltd, Cambridge, UK)를 측정하였다. 갈산 또한 같은 과정을 이용하여 표준 보정 곡선을 작성하였고, 이를 이용하여 시료에 포함된 페놀성 화합물의 함량을 1 g에 대한 mg 갈산 당량(gallic acid equivalents, GAE)로 나타내었다.
두릅에 의한 지방 축적 억제효과를 확인하기 위해 24-well plate 에 HepG2 세포를 well당 1×105만큼 분주하여 24시간 동안 배양 하여 부착시킨 뒤 소태아혈청이 들어있지 않은 저 포도당(1 g/L) DMEM 배지로 교체하여 24시간 배양하였다.
두릅의 아세트산 에틸 분획물의 생리활성 물질을 분석하기 위해서 HPLC (Ultra mate 3000 series, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며 컬럼은 C18컬럼(250×4.6 mm, 5.0µm, Shim-pack GIS-ODS, Shimadzu, Tokyo, Japan)을 사용하였다.
또한 과산화수소에 대한 억제효과를 확인하기 위해 시료를 처리한 후 24시간 뒤에 H4IIE 세포에는 200 µM, HepG2 세포에는 400 µM의 과산화수소를 처리하여 3시간 동안 추가 배양했다.
1 mL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 방치 후 30% 트라이클로로아세트산 0.1 mL와 1% 싸이오바바투르산 0.3 mL를 첨가하고 95℃에서 20분간 가열한 후, 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 카테킨(catechin)을 이용하여 시료의 지방질 과산화물 생성 억제효과를 비교하였다.
5% 농도로 녹인 오일 레드 오 시약을 증류수와 6:4 비율로 섞어 희석한 후 각 well에 처리해 준 뒤 30분간 방치하였다. 방치가 끝난 뒤 증류수를 이용하여 염색약을 완전히 제거하여 주었고, 지방에 염색되어 있는 오일 레드 오를 아이소프로판올을 이용하여 녹여낸 뒤 흡광도를 500 nm에서 측정하여 지방 축적 정도를 확인하였다.
배양 후 두릅 아세트산 에틸 분획물을 농도별로 처리하였으며 양성 대조군으로 아스코브산(200 µM)을 사용하였고, 대조군 (control)과 음성 대조군에는 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 사용하였다.
9 mL를 가한 후 실온의 암실에서 30분간 반응시켜 주었고, 이는 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Dudonné 등, 2009). 시료의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거 활성은 양성 대조군인 아스코브산(ascorbic acid, vitamin C)의 제거 활성과 비교하였다.
3 mL를 첨가하고 95℃에서 20분간 가열한 후, 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 카테킨(catechin)을 이용하여 시료의 지방질 과산화물 생성 억제효과를 비교하였다.
폴리페놀 화합물은 식물의 이차대사산물로써 식물계에 널리 분포하고 있으며 여러 화합물과 쉽게 결합하는 하이드록실기(-OH)에 의해 산화방지, 항암과 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Urquiaga와 Leighton, 2000). 이러한 폴리페놀의 하이드록실기에 의해 폴린-시오칼토 시약이 환원되어 몰리브데넘 청색으로 발색하는 것을 이용하여 각 분획물에 들어있는 폴리페놀 함량을 확인하였다(Fig. 1). 그 결과 각 분획물에서 노말 헥세인 층은 13.
쥐의 뇌 조직을 이용한 지방질 과산화물의 생성 억제 효과의 측정을 위해 Chang 등(2001)의 방법을 변형하여 사용하였다. 일정한 환경이 유지되는 곳에서 키워진 ICR 마우스의 뇌를 적출하였으며(certificate: GNU-170605-M0023), 뇌 조직 무게의 10배에 해당하는 20 mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.4) 을 첨가하고 균질화시켰다. 균질화된 용액은 6,000×g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 시행하였고, 상층액을 취해 실험에 이용하였다.
쥐의 뇌 조직을 이용한 지방질 과산화물의 생성 억제 효과의 측정을 위해 Chang 등(2001)의 방법을 변형하여 사용하였다. 일정한 환경이 유지되는 곳에서 키워진 ICR 마우스의 뇌를 적출하였으며(certificate: GNU-170605-M0023), 뇌 조직 무게의 10배에 해당하는 20 mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.
또한 과산화수소에 대한 억제효과를 확인하기 위해 시료를 처리한 후 24시간 뒤에 H4IIE 세포에는 200 µM, HepG2 세포에는 400 µM의 과산화수소를 처리하여 3시간 동안 추가 배양했다. 추가 배양이 끝난 후에 50 M DCF-DA 를 첨가하여 50분 동안 반응시킨 뒤, 형광을 측정하였다. 형광의 강도 측정은 형광 마이크로플레이트 판독기(Infinite 200, Tecan Co.
두릅 추출물은 냉동 건조된 두릅(20 g)에 80% 에탄올 1 L를 넣고 40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하였다. 추출물은 No. 2 여과지(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하여 진공농축기(N-N series, EYELA Co. Tokyo, Japan)로 농축하였으며 농축물을 이용하여 분획을 진행하였다. 농축된 추출물을 증류수로 300 mL와 같은 양의 노말 헥세인, 클로로폼과 아세트산 에틸 용매를 이용하여 순차적으로 분획한 후 냉동 건조하여 −20℃에서 보관하며 실험에 이용하였다.
추가 배양이 끝난 후에 50 M DCF-DA 를 첨가하여 50분 동안 반응시킨 뒤, 형광을 측정하였다. 형광의 강도 측정은 형광 마이크로플레이트 판독기(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 485 nm (excitation)와 535 nm (emission)에서 측정하였다. 형광 강도를 이용하여 산화적 스트레스의 생성 정도를 대조군 대비 %로 나타내었다.
대상 데이터
간세포의 배양은 10% FBS, 50 units/mL 페니실린과 100 µg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다.
본 연구에 사용된 폴린-시오칼토 페놀시약(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent), 갈산(gallic acid), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 싸이오바비투르산(thiobarbituric acid), 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid), 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), 과산화 수소(H2O2), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 연구에 사용한 두릅은 2016년 4월 경남 창녕에서 재배된 것을 구매하여 사용하였으며 수세한 뒤 냉동건조기(Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 냉동 건조한 뒤, 건조물은 분쇄하여 −20℃에서 보관하면서 사용하였다.
에탄올과 과산화수소에 의해 발생되는 산화적 스트레스를 측정하기 위해서 2',7'-다이클로로플루오레세인 다이아세테이트(DCFDA)를 이용하였다(Ha 등, 2015).
물질 분석에 사용된 표준물질은 클로로겐산(chlorogenic acid)과 3,5다이카페오일퀸산(3,5-dicaffeoylquinic acid)으로 Sigma Aldrich Chemical Co. 제품을 이용하였으며, 그 이외의 용매와 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
쥐(rat)유래 간세포인 H4IIE 세포는 ATCC (CRL-1548, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서, 인간유래 간세포인 HepG2 세포는 한국세포주은행(KCLB-88065, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 간세포의 배양은 10% FBS, 50 units/mL 페니실린과 100 µg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다.
데이터처리
실험의 결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 실험결과의 통계적 유의성은 SAS version 9.2(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용한 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)과 던컨 시험으로 유의성 검정을 시행하였다(p<0.05).
이론/모형
이후 5일 동안 에탄올과 시료가 포함되어 있는 신선한 배지로 매일 교체해 주었다. 5일 이후 지방 축적 정도를 확인하기 위해 오일 레드 오(Oil red O) 염색 방법을 이용하였다.
알코올에 의한 HepG2 세포의 지방축적과 두릅 아세트산 에틸분획물의 억제 효과를 확인하기 위하여 오일 레드 오 염색법을 이용하여 실험한 결과는 Fig. 6과 같다. 5일동안 에탄올을 처리해 준 결과 대조군(100%)에 비해 126.
에탄올과 과산화수소에 의해 유도된 독성에 대한 간세포의 생존율은 MTT 환원측정법으로 확인하였다(Ha 등, 2015). 96-well plate에 각각의 세포를 1×104만큼 분주한 뒤 24시간 동안 배양하여 부착하였다.
페놀성 화합물의 함량은 폴린-시오칼토의 방법(Singleton과 Rossi, 1965)을 이용하여 분석 하였다. 시료에 3차 증류수 9 mL와 폴린-시오칼토 페놀 시약 1 mL를 차례대로 넣어주고 실온에 5분간 방치하였다.
성능/효과
또한 에탄올의 결과와 마찬가지로 두릅 아세트산 에틸 분획물 처리군에서 농도가 증가함에 따라 산화적 스트레스의 정도를 줄여주었으며, 특히 두릅 아세트산 에틸 분획물 100 µg/mL 농도가 H4IIE 세포에서 20.62% (Fig. 4D), HepG2 세포에서 47.80% (Fig. 4D)로 나타났다.
H4IIE 세포의 경우 100 µg/mL 농도(82.28%)는 과산화수소군에 비해 15.35% 증가한 생존율을 나타내었고(Fig. 5B), HepG2 세포에 서는 낮은 농도(10 µg/mL)의 두릅 아세트산 에틸 분획물 처리하 였을 경우에도 아스코브산 처리군 보다 높은 생존율(118.22%)을 보여(Fig. 5D), 두릅 아세트산 에틸 분획물이 간세포 보호에 효과적인 것으로 나타났다.
2와 같이 나타났다. 각 분획물의 농도가 증가함에 따라 ABTS와 DPPH 라디칼 제거활성이 높아지는 경향이 나타났다. 분획물 중에서 아세트산에틸, 물, 클로로폼, 노말 헥세인 분획물 순으로 라디칼을 제거하는 것으로 나타나 총 페놀 함량 결과와 유사한 경향을 보였다.
과산화수소를 처리한 군의 경우 H4IIE 세포에서 162.78% (Fig. 4B), HepG2 세포에 200 µM 농도의 과산화수소를 처리하였을 때 대조군 대비 산화적 스트레스의 증가량이 크지 않았으며(data not shown), 2배 농도인 400 µM 농도의 과산화수소를 처리하였을 때 140.71% (Fig. 4D)로 나타났다.
그러나 아스코브산(200 µM)을 처리하였을 경우 H4IIE 세포에서는 103.30% (Fig. 5A)으로 대조군보다 다소 높은 생존율을 보였으며, HepG2에서는 91.64% (Fig. 5C) 수준으로 회복되었다.
그리고 두릅 아세트산 에틸 분획물을 처리하였을 경우 농도가 증가함에 따라 세포의 생존율이 증가하여 100 µg/mL를 처리하였을 때 H4IIE 및 HepG2 세포에서 각각 85.74% (Fig. 5A) 및 97.36% (Fig. 5C)로 나타났다.
그리고 두릅 아세트산 에틸 분획물은 간세포(H4IIE와 HepG2)에서 에탄올과 과산화수소에 의한 강한 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었으며, 생존율 또한 증가시키는 것으로 나타났다.
대조군(100.00%) 대비 에탄올을 처리한 군의 경우 H4IIE 세포에서는 138.92% (Fig. 4A)로 나타났으며, HepG2세포에서는 166.07% (Fig. 4C)로 에탄올에 의해 세포내 산화적 스트레스가 증가한 것으로 나타났다.
이러한 결과는 두릅 물 추출물을 식이한 쥐에 산화적 스트레스를 유발하는 스트렙토조토신(streptozotocin)를 처리한 뒤 간 조직의 과산화지방질의 함량을 측정한 Kim 등(2004)의 결과와 유사하였다. 두릅 물 추출물을 식이한 군은 과산화지방질의 함량이 스트렙토조토신만 처리한 군(대조군 대비 1.8배)에 비해 유의적으로 줄어들어 두릅의 섭취가 간세포의 지방질 과산화를 억제하는 것으로 나타났다. 이는 두릅이 가지는 산화방지 활성에 의해 산화적 스트레스가 제거되고 그 결과 다양한 조직에서의 지방질 과산화를 억제하며 세포의 손상을 줄이는데 도움이 될 것으로 판단된다.
두릅 아세트산 에틸 분획물의 농도가 높아짐에 따라 지방질 과산화물의 생성 억제 정도가 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 100 µg/mL 농도의 두릅 아세트산에틸 분획물에서 억제 활성이 64.60%로 나타나 높은 억제 활성을 보였다.
본 연구에서는 두릅(shoot of Aralia elata)의 분획물이 가지는 산화방지 효과와 간세포 보호효과를 확인하고 이에 영향을 주는 생리활성물질을 분석하고자 하였다. 두릅의 각 분획물을 이용하여 총 페놀 함량, 산화방지 능력(ABTS와 DPPH 라디칼 제거 활성)의 측정을 통해 아세트산 에틸 분획물이 다른 분획물 대비 가장 높은 산화방지 능력을 가진 것을 확인하였다. 두릅의 아세트산 에틸 분획물을 이용하여 지방질과산화물의 생성 억제 능력을확인한 결과 역시 우수한 억제 활성효과를 나타내었다.
따라서 두릅 아세트산 에틸 분획물에 들어있는 페놀성 화합물과 같은 다양한 산화방지 물질들이 세포 내의 활성산소종을 직접 제거하거나, 산화방지 효소의 함량과 활성을 직·간접적으로 조절함으로써 활성산소종 제거에 도움을 주는 것으로 판단된다.
Hwang 등(2015)의 연구에 따르면 두릅의 추출물은 지방 축적에 관여하는 지방산 합성 효소(fatty acid synthase, FAS), 아세틸 보조효소에이카복실화효소(acetyl-CoA carboxylase, ACC), SREBP1과 같은 단백질의 발현 정도를 억제하여 지방 축적을 막는다고 하였다. 따라서 두릅이 가지고 있는 생리활성 물질들에의한 산화적 스트레스의 억제뿐만 아니라 산화적 스트레스와 알코올에 의한 과도한 지방축적의 방지를 통해 간세포의 손상을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
또한 두릅의 메탄올 추출물이 염증의 발생을 억제하며 산화질소의 생산을 줄이는 것으로도 보고되어 있다(Lee와 Jeong, 2009). 따라서 이러한 기존 연구들과 함께 본 연구에서의 간세포의 생존율이 DCF-DA 실험 결과와 유사한 경향으로 나타난 것을 고려할 때, 두릅 아세트산 에틸 분획물에 함유되어 있는 생리 활성 물질이 세포내의 산화적 스트레스를 줄이고, 염증 반응 등에 의한 세포 손상을 억제 함으로써 세포의 생존율이 증가한 것으로 판단된다.
그리고 두릅 아세트산 에틸 분획물은 간세포(H4IIE와 HepG2)에서 에탄올과 과산화수소에 의한 강한 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었으며, 생존율 또한 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 HepG2 세포에서 알코올에 의한 지방질 축적을 유도하였을 때 두릅의 아세트산 에틸 분획물이 지방질 축적의 억제 효과도 가지는 것으로 나타났다. 이러한 두릅 아세트산 에틸 분획물의 생리활성물질을 확인하기 위해 HPLC를 분석한 결과 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산이 주요 생리활성물질임을 확인하였다.
4C)로 나타나 높은 산화적 스트레스 억제효과를 나타내었다. 또한 두릅 아세트산 에틸 분획물을 처리해 준 경우 농도가 증가함에 따라 산화적 스트레스 억제 정도가 증가하였다. 특히 50 µg/mL 이상의 농도에서 아스코브산과 유사하거나 더 강력한 억제 활성을 나타내었으며 H4IIE 및 HepG2 세포에서 100 µg/mL농도가 각각 27.
또한 지방질 과산화물 생성의 50%를 억제하는데 필요한 농도 값인 IC50이 12.63 µg/mL로 나타나 양성대조군으로 사용된 카테킨의 IC50이 22.30 µg/mL인 것을 고려하였을 때, 두릅 아세트산에틸 분획물이 효과적으로 지방질 과산화물의 생성을 억제하는 것으로 판단된다.
7과 같다. 분석 결과 325nm 파장에서 머무름 시간 6.92분과 14.69분에 나타난 피크(peak)가 두릅 아세트산 에틸 분획물의 주요 생리활성 물질로 유추되었다. 이는 두릅 아세트산 에틸 분획물과 같은 방법으로 처리한 표준 물질의 머무름 시간과 UV-VIS 스펙트럼의 비교를 통해 각각 클로로겐산(chlorogenic acid, similarity: 992.
각 분획물의 농도가 증가함에 따라 ABTS와 DPPH 라디칼 제거활성이 높아지는 경향이 나타났다. 분획물 중에서 아세트산에틸, 물, 클로로폼, 노말 헥세인 분획물 순으로 라디칼을 제거하는 것으로 나타나 총 페놀 함량 결과와 유사한 경향을 보였다. 특히 아세트산에틸 분획물의 경우 ABTS 라디칼 제거활성에서 양성 대조군으로 사용한 아스코브산(99.
5). 에탄올을 처리한 경우 대조군(100%) 대비 H4IIE 세포는 72.93% (Fig. 5A), HepG2 세포는 69.38% (Fig. 5C)로 나타나 에탄올이 가지고 있는 직접적인 독성과 에탄올에 의해 유도되는 산화적 스트레스 등에 의해 다수의 세포가 사멸하는 것으로 나타났다. 그러나 아스코브산(200 µM)을 처리하였을 경우 H4IIE 세포에서는 103.
또한 Ela 등(2012)은 3,5-다이카페오일퀸산이 간 보호 효과를 가지고 있다고 보고하였다. 위의 결과에 비추어 볼 때, 두릅 아세트산 에틸 분획물이 가지고 있는 산화방지와 지방질과산화 억제 능력과 간세포에서 알코올에 의한 산화적 스트레스 감소와 보호 효과는 두릅 유래의 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산과 같은 다양한 페놀성 화합물 등에 의한 것으로 판단된다.
또한 HepG2 세포에서 알코올에 의한 지방질 축적을 유도하였을 때 두릅의 아세트산 에틸 분획물이 지방질 축적의 억제 효과도 가지는 것으로 나타났다. 이러한 두릅 아세트산 에틸 분획물의 생리활성물질을 확인하기 위해 HPLC를 분석한 결과 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산이 주요 생리활성물질임을 확인하였다. 본연구의 결과를 바탕으로 고려할 때, 두릅의 아세트산 에틸 분획물은 우수한 산화방지 능력과 간세포 보호 능력을 나타냄에 따라 간 질환을 예방할 수 있는 천연물 유래 건강기능식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
인간 유래 HepG2 간 세포 대비쥐(rat) 유래 H4IIE 간 세포가 과산화수소에 의한 산화적 스트레스에 상대적으로 더 취약한 것으로 나타났으며, 이는 이종간 세포 특성에 기인되는 것으로 판단된다. 이에 반해 아스코브산 처리군은 각각 28.42% (Fig. 4B)와 102.53% (Fig. 4D)로 나타나 산화적 스트레스의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 또한 에탄올의 결과와 마찬가지로 두릅 아세트산 에틸 분획물 처리군에서 농도가 증가함에 따라 산화적 스트레스의 정도를 줄여주었으며, 특히 두릅 아세트산 에틸 분획물 100 µg/mL 농도가 H4IIE 세포에서 20.
4D)로 나타났다. 인간 유래 HepG2 간 세포 대비쥐(rat) 유래 H4IIE 간 세포가 과산화수소에 의한 산화적 스트레스에 상대적으로 더 취약한 것으로 나타났으며, 이는 이종간 세포 특성에 기인되는 것으로 판단된다. 이에 반해 아스코브산 처리군은 각각 28.
특히 50 µg/mL 이상의 농도에서 아스코브산과 유사하거나 더 강력한 억제 활성을 나타내었으며 H4IIE 및 HepG2 세포에서 100 µg/mL농도가 각각 27.75% (Fig. 4A)와 81.07% (Fig. 4C)로 나타났다.
특히 아세트산에틸 분획물의 경우 ABTS 라디칼 제거활성에서 양성 대조군으로 사용한 아스코브산(99.86%)과 비교하였을 때 동일한 농도(1,000µg/mL)에서 유사한 수준(98.66%)으로 라디칼을 제거하는 것으로 나타났으며, DPPH 라디칼 제거활성 역시 아세트산 에틸 분획물 1,000 µg/mL 농도에서 90.80%로 높게 나타나 두릅의 아세트산 에틸 분획물이 우수한 산화방지력을 가지고 있는 것을 확인할 수있었다.
한편 과산화수소를 처리한 군의 경우 대조군(100%) 대비 H4IIE 세포는 66.93% (Fig. 5B), HepG2 세포는 85.81% (Fig. 5D) 로 나타나 과산화수소가 간세포의 생존율에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 반면 강력한 산화방지제인 아스코브산을 함께 처리해준 경우 대조군(100%) 대비 H4IIE 세포는 91.
후속연구
이러한 두릅 아세트산 에틸 분획물의 생리활성물질을 확인하기 위해 HPLC를 분석한 결과 클로로겐산과 3,5-다이카페오일퀸산이 주요 생리활성물질임을 확인하였다. 본연구의 결과를 바탕으로 고려할 때, 두릅의 아세트산 에틸 분획물은 우수한 산화방지 능력과 간세포 보호 능력을 나타냄에 따라 간 질환을 예방할 수 있는 천연물 유래 건강기능식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
두릅나무는 어떤 물질이 함유되어 있는가?
두릅나무(Aralia elata)는 두릅나뭇과에 속하는 식물로 주로 순을 섭취하며 아시아 전역에 분포해 있는 식물이다(Lee와 Jeong, 2009). 두릅나무에는 사포닌, 올리에놀산, 트라이터펜, 시스토스테롤, 아스코브산, 베타카로텐 등의 물질이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있으며(Cha 등, 2009; Kim 등, 2005), 당뇨 개선(Shin 등, 2004), 혈당 조절(Yoshikawa 등, 1996)에 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 이외에도 항염증(Lee와 Jeong, 2009), 피부 광노화 억제(Yang과 Kwak, 2016)에 대한 효과가 보고되어 있지만, 두릅이 가지는 간세포 보호효과에 관한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다.
간이란 무엇인가?
간은 체내에서 소화와 배설, 단백질과 지방질의 대사, 영양소의 저장, 해독작용 등 생명유지에 중요한 역할을 하는 필수적인 장기이다(Kim 등, 2012). 그러나 음주, 흡연, 독성물질 등에 의한 지방간, 간염, 간암과 같은 간질환의 발병이 증가하고 있으며 이는 각종 사회적 비용의 발생을 야기하여 중요한 문제로 대두되고 있다(Han 등, 2009).
음주를 통한 알코올의 섭취는 어떤 간 질병의 원인이 되는가?
그러나 음주, 흡연, 독성물질 등에 의한 지방간, 간염, 간암과 같은 간질환의 발병이 증가하고 있으며 이는 각종 사회적 비용의 발생을 야기하여 중요한 문제로 대두되고 있다(Han 등, 2009). 특히 알코올의 섭취는 지방간, 간염, 간경화, 간암과 같은 간질환의 주된 원인으로 알려져 있다(Walsh와 Alexander, 2000). 이러한 알코올을 섭취하게 되면 위와 소장을 통해 혈액 내로 흡수되며 대부분 간에서 아세트알데하이드 (acetaldehyde)를 거쳐 아세테이트(acetate)로 대사된다(Lumeng과 Crabb, 2000).
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