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문제 정의
- 최근 비타민나무에 대한 관심이 증가되며 많은 피부효능 연구가 진행되고 있으나 주로 열매와 잎 추출물에 한정되어 있어, 비타민나무를 이용한 다양한 제품 활용에 제약이 있었다. 따라서 본 연구에서는 비타민나무 열매와 잎을 이용한 새로운 소재를 개발하고, 항산화, 항염증 및 주름개선 효능을 평가하여 화장품 원료로서의 활용가능성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 비타민나무 (Hippophae rhamnoides L.)를 이용한 화장품 신소재를 개발하기 위해 열매와 잎을 이용한 4종의 sample을 제조하여 항산화 활성, NO 생성억제, elastase저해 활성을 측정하였다. 비타민나무열매와 잎을 이용한 4 종 sample의 총 phenol성 화합물과 총 flavonoid 함량은 MIX가 가장 높은 것으로 나타났다.
제안 방법
- 7 세포는 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea)에서 구입 하였으며, 세포배양에 사용한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicilin/streptomycin solution (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 HyClone사 (Logan, UT, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 10% FBS와 1% 항생제 (PS, 100 U/㎖)가 첨가 된 DMEM 배지를 사용하여 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
- 80% ethanol로 희석한 시료 0.1 ㎖ 에 10% aluminium nitrate (Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd., Osaka, Japan) 0.02 ㎖, 1 M potassium acetate (Junsei Chemical Co., Ltd.,Tokyo, Japan) 0.02 ㎖ 와 80% ethanol 0.86 ㎖을 가하여 실온에서 40 분 반응시켰다. 반응이 끝난 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정 하였으며, 총 flavonoid 함량은 표준물질인 quercetin (Sigma-Aldrich Co.
- DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- MTT 를 이용하여 비타민나무 4 종 sample의 세포 생존율에 대한 효과를 측정하였다. RAW264.
- 각 시료 0.1 ㎖ 를 0.05 ㎖ 의 Folin-Ciocalteu (SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA) 시약과 혼합하고, 5 분 반응 후에 20%의 탄산나트륨 0.3 ㎖를 첨가하였다. 이 반응혼합물을 15 분 동안 안정화시킨 후 증류수 1 ㎖를 첨가하여 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 시료를 일정농도가 되도록 조제하고, 100 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (0.25 U/㎖) 용액을 첨가하여, 100 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 기질 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide을 가하고, 37℃에서 20 분간 반응시킨 후, 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 415 ㎚에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- 건조된 비타민나무 잎은 70% EtOH로 추출하여, 감압 농축하였고 열매는 착즙하여, 여과한 후 동결건조 하였다. 28.
- 다양한 농도의 시료 0.1 ㎖ 를 0.15 mM의 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 ㎖ 와 혼합하여 상온, 암조건에서 30 분간 반응시킨 후, UV/VIS spectrophotometer (V530, Jasco Inc.,Tokyo, Japan)를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 radical 소거능의 기울기를 구하여 50%가 되는 시점의 시료의 농도를 IC50 (㎍/㎖)로 나타내었고, 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co.
- 다양한 농도의 시료 0.1 ㎖에 0.2 M의 sodium phosphate buffer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 ㎖(pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide (Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, MO, USA) 0.1 ㎖를 혼합하여 50℃에서 20 분 동안 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) 0.1 ㎖를 첨가하여 동량의 증류수와 0.1% ferric chloride (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.05 ㎖를 첨가하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료에 대한 세포독성은 96 well plate에 RAW264.7 세포를 1 × 105 cells/well로 분주하여 24 시간 동안 배양한 후, LPS와 시료가 첨가된 배지에서 24 시간 배양하고, phosphatebuffered saline (PBS)에 녹인 MTT (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 0.5 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 4 시간 더 배양시킨 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 처리하여 ELISA (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA,USA)를 이용하여 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다(Mosmann, 1983).
- , Hwaseong, Korea]를 이용하여 균질화 시키고, micro filter (1 ㎛)를 통과시켜 여과하였다. 이후 분액여두를 이용하여 여과액을 수용성 (FW)과 지용성 (FF)분획으로 나누고, 동결건조 (Ilshin Biobase Co., Ltd., Seoul, Korea.)를 실시하여 각각 3.86과 5.73%의 수율로 분말 (juice powder)을 획득하였다.
- 총 flavonoid 함량은 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- 총 phenol성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다 (Singleton and Rossi, 1965).
- 환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 변형하여 실험하였다.
대상 데이터
- 건조된 비타민나무 잎은 70% EtOH로 추출하여, 감압 농축하였고 열매는 착즙하여, 여과한 후 동결건조 하였다. 28.19% 수율의 건조된 잎 분말과 9.59% 수율의 열매 착즙 분말을 6:4의 비율로 혼합한 혼합물 (MIX)을 실험에 사용하였다.
- Nitrite oxide (NO)생성은 griess reagent system을 이용하여 측정하였고, griess reagent에 사용되는 모든 시약은 SigmaAldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.
- RAW264.7 세포는 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea)에서 구입 하였으며, 세포배양에 사용한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicilin/streptomycin solution (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 HyClone사 (Logan, UT, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- ,Tokyo, Japan)를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 radical 소거능의 기울기를 구하여 50%가 되는 시점의 시료의 농도를 IC50 (㎍/㎖)로 나타내었고, 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO,USA)를 사용하였다.
- 또한 잎과 열매 혼합처리 시 높은 활성을 나타낸 연구(Han et al., 2009)를 참고하여 진행한 선행연구결과, 높은 DPPH 소거활성을 나타낸 비타민나무 잎과 열매 혼합분말을 실험에 사용하였다 (data not shown).
- 비타민나무 (Hippophae rhamnoides L.)의 열매와 잎은 강원비타민나무영농조합 (Chuncheon, Korea) 농장에서 7 월에 수확한 것을 제공받아 사용하였고, 착즙기 (galaxy premium juicer GJ-120, NUC Co., Ltd., Daegu, Korea)로 비타민나무열매를 착즙한 후 inline-mixer [IM002 (YSY), K&S Co., Ltd., Hwaseong, Korea]를 이용하여 균질화 시키고, micro filter (1 ㎛)를 통과시켜 여과하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 최소 3 반복 수행하여 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 각 실험군의 통계처리는 Minitab (version17.2;Minitab Inc., State College, PA, USA)을 사용하여 One-wayANOVA를 실시하였으며, 유의적 차이가 있는 항목에 대해서는 Tukey’s Honest Significant Difference (HSD)를 이용하여 통계학적 유의성을 분석하였다 (p < 0.05).
이론/모형
- Elastase 저해활성은 Cannell 등 (1988)의 방법에 따라 측정하였으며, 실험에 사용되는 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.
성능/효과
- 비타민나무열매와 잎을 이용한 4 종 sample의 총 phenol성 화합물과 총 flavonoid 함량은 MIX가 가장 높은 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능도 MIX가 가장 높은 활성을 나타냈으며, 환원력측정 결과 모든 sample이 농도 의존적으로 증가하였고, MIX가 가장 높은 환원력을 보였다. 이러한 결과는 높은 총 phenol성 화합물 및 flavonoid의 함량에서 기인한 것으로 예상할 수 있다.
- Elastase 저해활성을 측정한 결과 모든 sample이 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 FW의 경우 가장 높은 elastase 억제활성을 나타내, 주름 개선 기능성 소재로 이용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 비타민나무 기능성 소재를 대상으로 항산화, 항염, 주름개선 효과의 관련기전의 연구를 진행한다면, 기능성 화장품 소재로서의 활용 가치가 높아질 것으로 생각된다.
- 이러한 결과는 높은 총 phenol성 화합물 및 flavonoid의 함량에서 기인한 것으로 예상할 수 있다. 또한 LPS로 유도된 RAW264.7 cell에서 MIX와 FF가 500 ㎍/㎖의 농도에서 NO의 생성을 억제하고, 세포독성도 나타나지 않았다. 이상의 결과로 볼 때, 비타민나무 잎과 열매 혼합물인 MIX는 항산화 및 염증 조절하는 천연소재로 가능성이 있음을 시사한다.
- 비타민나무 4 종 sample의 elastase 저해 활성을 측정한 결과 모든 sample이 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖ 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500 ㎍/㎖의 농도에서 FW가 43.
- )를 이용한 화장품 신소재를 개발하기 위해 열매와 잎을 이용한 4종의 sample을 제조하여 항산화 활성, NO 생성억제, elastase저해 활성을 측정하였다. 비타민나무열매와 잎을 이용한 4 종 sample의 총 phenol성 화합물과 총 flavonoid 함량은 MIX가 가장 높은 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능도 MIX가 가장 높은 활성을 나타냈으며, 환원력측정 결과 모든 sample이 농도 의존적으로 증가하였고, MIX가 가장 높은 환원력을 보였다.
- 7 cell에서 MIX와 FF가 500 ㎍/㎖의 농도에서 NO의 생성을 억제하고, 세포독성도 나타나지 않았다. 이상의 결과로 볼 때, 비타민나무 잎과 열매 혼합물인 MIX는 항산화 및 염증 조절하는 천연소재로 가능성이 있음을 시사한다.
- 93%로 낮은 NO 생성율을 보였으나 이는 세포 독성에서 기인된 결과로 설명할 수 있다. 이상의 결과를 통해 LPS로 유도된 RAW264.7 cell에서 FF와 MIX가 NO 생성을 효과적으로 억제함으로써, 염증을 조절할 수 있는 천연소재로 이용이 가능함을 확인할 수 있었다.
- 1). 전체적으로 항산화제인 ascorbic acid에 비해 낮은 환원력을 보였으나, 비타민나무 4종 sample 중 잎과 열매의 혼합물인 MIX의 경우 가장 높은 환원력을 나타냈고, FF는 흡광도 값을 얻을 수 없었다.
- 총 flavonoid 함량도 총 phenol성 화합물과 같이 MIX (25.18 ㎎·QE/g)가 가장 높은 함량을 나타냈고, FW (5.86 ㎎·QE/g) > BS (1.91 ㎎·QE/g) > FF (0.29 ㎎·QE/g)의 순이었다.
- 추출온도는 60℃, 압력은 350 bar 조건에서 3 시간동안 추출하였다. 추출물을 40℃에서 감압농축하고, 동결 건조하여 5.26%의 수율로 초임계 추출물 (BS)을 얻을 수 있었다.
- 비타민나무 4 종 sample의 elastase 저해 활성을 측정한 결과 모든 sample이 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖ 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500 ㎍/㎖의 농도에서 FW가 43.69%의 억제율을 보이며 가장 높은 활성을 나타냈으며, FF가 22.31%로 가장 낮은 elastase 저해활성을 나타냈다.
- 3에서와 같이 500 ㎍/㎖의 농도로 sample을 처리하였을 경우, 모든 sample에서 NO 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 FF와 MIX의 경우 세포독성은 나타나지 않았으나, 각각 25.26, 27.75%의 낮은 NO 생성율을 나타내며,RAW264.7 cell 내에서 NO 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 BS의 경우 28.
후속연구
- BS의 경우 NO 생성을 억제하였으나 세포생존율이 감소하는 결과를 보임으로써, 향후 연구를 진행할 때 세포독성을 나타내지 않으며 NO 생성 억제효과를 보이는 적정농도의 선정이 요구된다.
- Elastase 저해활성을 측정한 결과 모든 sample이 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 FW의 경우 가장 높은 elastase 억제활성을 나타내, 주름 개선 기능성 소재로 이용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 비타민나무 기능성 소재를 대상으로 항산화, 항염, 주름개선 효과의 관련기전의 연구를 진행한다면, 기능성 화장품 소재로서의 활용 가치가 높아질 것으로 생각된다.
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