혈관내피세포에서 TNF-α로 유도되는 혈관염증에 대한 쏙(Upogebia major) 효소가수분해물의 억제 효과 Inhibition Effect of Enzymatic Hydrolysate from Japanese Mud Shrimp Upogebia major on TNF-α-induced Vascular Inflammation in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)원문보기
Arteriosclerosis is the major cause of coronary artery and cerebrovascular disease, which are leading causes of death. Pro-inflammatory cytokines induce injury to vascular endothelial cells by increasing cell adhesion molecules, leading to vascular inflammation, a major risk factor for the developme...
Arteriosclerosis is the major cause of coronary artery and cerebrovascular disease, which are leading causes of death. Pro-inflammatory cytokines induce injury to vascular endothelial cells by increasing cell adhesion molecules, leading to vascular inflammation, a major risk factor for the development of arteriosclerosis. In the current study, we investigated the inhibitory effect of enzymatic hydrolysate from Japanese mud shrimp Upogebia major on the inflammation of tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$)-stimulated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We first evaluated the antioxidant and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activities of eight U. major enzymatic hydrolysates: alcalase, papain, ${\alpha}$-chymotrypsin (${\alpha}-Chy$), trypsin, pepsin, neutrase, protamex and flavourzyme. Of these, ${\alpha}-Chy$ exhibited potent antioxidant and ACE inhibitory activities. The ${\alpha}-Chy$ hydrolysate was fractionated by two ultrafiltration membranes of 3 and 10 kDa. The ${\alpha}-Chy$ hydrolysate of U. major and its molecular weight cut-off fractions resulted in a significant reduction in NO production and a decrease in cell adhesion molecules [vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and endothelial-selectin (E-selectin)] and pro-inflammatory cytokines [interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)] in $TNF-{\alpha}$-stimulated HUVECs. These results suggest that enzymatic hydrolysate from U. major can be used in the control and prevention of vascular inflammation and arteriosclerosis.
Arteriosclerosis is the major cause of coronary artery and cerebrovascular disease, which are leading causes of death. Pro-inflammatory cytokines induce injury to vascular endothelial cells by increasing cell adhesion molecules, leading to vascular inflammation, a major risk factor for the development of arteriosclerosis. In the current study, we investigated the inhibitory effect of enzymatic hydrolysate from Japanese mud shrimp Upogebia major on the inflammation of tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$)-stimulated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We first evaluated the antioxidant and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activities of eight U. major enzymatic hydrolysates: alcalase, papain, ${\alpha}$-chymotrypsin (${\alpha}-Chy$), trypsin, pepsin, neutrase, protamex and flavourzyme. Of these, ${\alpha}-Chy$ exhibited potent antioxidant and ACE inhibitory activities. The ${\alpha}-Chy$ hydrolysate was fractionated by two ultrafiltration membranes of 3 and 10 kDa. The ${\alpha}-Chy$ hydrolysate of U. major and its molecular weight cut-off fractions resulted in a significant reduction in NO production and a decrease in cell adhesion molecules [vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and endothelial-selectin (E-selectin)] and pro-inflammatory cytokines [interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)] in $TNF-{\alpha}$-stimulated HUVECs. These results suggest that enzymatic hydrolysate from U. major can be used in the control and prevention of vascular inflammation and arteriosclerosis.
TNF-α로 염증 반응을 유도한 HUVEC 세포에서 쏙의 α-Chy 가수분해물과 분획물들의 염증 매개 물질인 NO 생성 억제 효과를 측정하였다(Fig. 2).
동결건조한 쏙을 8개의 효소로 가수분해하고, 각각의 효소 가수분해물의 가수분해도를 측정하였다(Table 1). 쏙의 가수 분해도는α-Chy 가수분해물(67.
본 연구에서는 혈관 염증에 관여하는 사이토카인의 발현에 대한 쏙 가수분해물의 억제능을 평가하고자 HUVEC에 TNF-α을 처리하여 염증성 사이토카인의 발현을 유도한 뒤, 쏙 α-Chy 가 수분해물과 분획물들을 처리하여 사이토카인의 발현 억제 효과를 평가하였다(Fig. 4).
상층액을 모아 ELISA kit (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 VCAM-1, ICAM1, E-selectin의 발현량을 ELISA reader (US/MQX 200; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
시료의 세포독성을 확인하기 위해 HUVEC 세포에서 WST-1 을 이용하여 cell viability를 측정하였다. 96 well plate에 HUVEC 세포를 5×10³ cells/well이 되도록 분주한 후, 시료를 농도별로 처리하여 40 시간 동안 배양한 후, 각 well당 WST-1 용액을 10 μL씩 처리하여 2시간 동안 반응시킨 다음, ELISA reader (US/MQX 200; Bio-Tek Instruments Inc.
쏙 동결건조물 각 10 g씩에 8개 효소(Alc, Pa, α-Chy, Try, Pep, Neu, Pro, Fla)를 처리하였으며, 효소량은 쏙의 단백질 함량 대비 1%를 처리하였다.
쏙의 8개의 효소가수분해물을 10 mL 증류수에 녹인 후, 3 kDa과 10 kDa의 ultrafiltration membranes (Amicon Ultrafilter devices; Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 920 g에서 20분간 반복적으로 원심분리하여 분자량별로 각각 분획하였다(10 kDa).
쏙의 효소가수분해물의 가수분해도는Adler-Nissen (1979)법을 변형하여 측정하였으며, 그 값은 o-phthaldialdehyde (OPA)가 결합된 free amino groups 값으로 환산하여 나타내었다 (Adler-Nissen, 1986).
human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)과 Endothelial Growth Medium-2 (EGMTM-2 Medium)은 Lonza (Walkersville, MD, USA)에서 구입하였으며, penicillin-streptomycin solution은 Cellgro (Herndon, VA, USA), trypsin ethylenediaminetetraacetic acid (Trypsin-EDTA)는 Gibco (Grand Island, NY, USA), Cell Proliferation Reagent water-soluble tetrazolium salt (WST-1)은 Roche (Mannheim, Germany) 그리고 ELISA kit는 R&D systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 사용하였다.
쏙(U. major)은 2016년 3월에 충남보령 갯벌에서 5 kg을 채집하였으며, 세척 후 통째로 동결건조하여 분쇄한 후 -20℃에 서 보관하여 사용하였다. Alcalase® 2.
데이터처리
3Mean within the same row with different superscripts are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며, 통계처리는 SAS 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하였으며, Duncan의 multiple-comparison test와 Student t-test로 P<0.05에서 결과간의 유의성을 검정하였다.
성능/효과
8개의 효 소가수분해물 중α-Chy 가수분해물의 가수분해도가 가장 높은 것으로 나타났다.
DPPH 라디칼 소거활성에서는 8개의 효소가수분해물 중 α-Chy 가수분해물이 IC50 값이 2.87±0.18 mg/mL로 가장 높은 활성을 보였으며, Reducing power에서도 α-Chy 가수분해물이 EC50 값이 1.77±0.13 mg/mL로 가장 강한 활성을 나타내었다.
HUVEC 세포에서 TNF-α 처리로 발현된 E-selectin은 쏙 α-Chy 가수분해물에 의해 0.125-1 mg/mL의 모든 농도에서 유의적으로 감소되었다.
HUVEC 세포에서 염증 반응으로 과량 발현된 ICAM-1은 쏙 α-Chy 가수분해물을 처리함에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 0.25 mg/mL 이상의 농도를 처리한 군에서 유의적으로 감소하였다.
TNF-α 처리에 의해 유도된 VCAM-1은 쏙 α-Chy 가수분해물을 처리함에 따라 농도의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 특히, 0.25 mg/mL 이상의 농도를 처리한 군에서는 유의적인 감소를 나타내었다.
TNF-α에 의해 HUVEC에서 과량 생성된 IL-6는 쏙 α-Chy 가 수분해물을 처리함에 따라 유의적인 IL-6 억제 효과는 나타났으나 농도의존적인 감소는 나타나지 않았다.
또한, 쏙 α-Chy 가수분해물의 3개의 분획물, 10kDa 분획물들은 모든 농도(0.125-1 mg/ mL)에서 VCAM-1의 발현을 유의적으로 감소시켰으며, 특히 >10 kDa 분획물을 처리한 군에서 가장 강력한 억제 효과가 나타났다.
TNF-α에 의해 HUVEC에서 과량 생성된 IL-6는 쏙 α-Chy 가 수분해물을 처리함에 따라 유의적인 IL-6 억제 효과는 나타났으나 농도의존적인 감소는 나타나지 않았다. 분획물에서는 3개의 분획물이 0.125-1 mg/mL의 농도에서 모두 IL-6의 발현량을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
분획물에서도 3개의 분획물 모두 0.125-1 mg/mL 의 농도에서 농도의존적으로 유의적인 억제 효과를 나타내었고, 특히 분획물들 중에서 >10 kDa 분획물이 MCP-1의 발현을 가장 강력하게 억제하는 것으로 나타났다.
쏙 α-Chy 가수분해물과 분획물은 HUVEC 세포에서 TNF-α 의 처리로 과량 생성된 NO를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
쏙 α-Chy 가수분해물과 분획물을 농도 별(0.125-1 mg/mL)로 처리한 결과, 쏙 α-Chy 가수분해물은 0.125-0.5 mg/mL의 농도에서는 80% 이상의 생존율을 나타내었으며, 분획물에서는 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.
이들 결과로부터 쏙의 α-Chy 가수분해물과 분획물들은 세포 부착인자들의 발현을 유의적으로 억제하여 혈관 염증 유발을 억제하는 것으로 확인하였으며, 분획물들 중에서 >10 kDa 분획물 처리군이 가장 강력한 억제 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
이들 결과로부터 쏙의 α-Chy 가수분해물과 분획물은 HUVEC 에서 TNF-α의 처리에 의해생성된 NO와 세포부착인자들의 생성을 유의적으로 억제하고, 염증성 사이토카인들 또한 유의적으로 발현을 억제함으로써 α-Chy 가수분해물과 분획물의 혈관 염증 억제 효과를 확인하였다.
후속연구
향후, 본 연구 결과를 토대로 가장 강력한 혈관성 염증 억제 효과를 나타낸 쏙의 α-Chy 가수분해물의 >10 kDa 분획물로 부터 활성 소재를 분리·정제하고, 구조 동정하여 활성 소재를 구명하고, 활성 소재의 효능 검증 및 기전 연구를 추가로 진행 할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
죽상동맥경화증에 따른 합병증은?
혈관 내피세포에서 일어나는 대표적인 염증성 질환인 죽상동맥경화증은 혈관이나 혈관벽 내 염증 생성으로 염증성 사이토카인의 자극에 의해 혈류 중 단핵 세포 또는 거식세포가 혈관내피세포에 부착하게 되면서 시작된다(Packard and Libby, 2008). 혈관의 내막에 콜레스테롤이 침착되고, 내피세포가 증식하면 죽종이 형성되는데 이는 혈관의 내강을 좁히고 혈전을 형성하며, 협심증, 심근경색, 심내막염, 부정맥 등의 심장질환을 비롯하여 뇌경색, 뇌출혈과 같은 뇌혈 관질환, 그 외에도 신부전, 허혈성 사지질환과 같은 각종 합병증을 유발하기도 한다(Lee et al., 2012b; Cho et al.
쏙(Upogebia major)이란?
쏙(Upogebia major)은 우리나라 서해안, 제주를 포함하는 남해안, 일본 오키나와를 제외한 일본 전 해역, 중국의 황해 북부와 러시아 극동지역의 블라디보스토크와 사할린 지역에 분포 하며, 갯벌이나 조간대의 모래가 섞인 진흙질 바닥에 구멍을 파고 군락을 이루며 사는 쏙과의 갑각류이다. 쏙은 갑각류 특유의 맛을 내며, 우리나라, 일본, 중국을 비롯하여 베트남, 타이완 등 전세계 많은 지역에서 식용으로 이용하고 있다(Hong, 2013).
키틴, 키토산, carotenoids 색 소의 효능은?
새우와 게와 같은 갑각류에는 키틴, 키토산, carotenoids 색 소 등의 유용 물질을 다량 함유하고 있으며, 이들 물질은 항균, 항바이러스, 항산화, 항염증 등 다양한 생리활성이 보고되어 있다(Pan et al., 2000; Rosa and Barracco, 2010; Sindhu and Sherief, 2011; Oh and Jung, 2015).
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