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문제 정의
- 두시 하태독법이 시행된 비만 생쥐에서 Th2 분화조절을 통한 알러지성 비염 유발 감소 효과를 확인하기 위한 본 연구는 태령 3주의 약물 처리된 NC/Nga생쥐의 아래코선반 호흡상피를 면역조직학적 변화를 통해 관찰한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구는 Th2 skewed condition 상태에서 발병한 소아의 알러지성 비염에 대한 발병 조절 효과가 있는 하태독법이 비만이라는 염증성 조직손상을 가중시키는 요인이 포함된 상태에서 발병 조절 효과가 있는지를 조사하기 위해서 실시되었다. 하태독법을 자발적 Th2skewed condition이 일어나는 NC/Nga 생쥐에 실시한 후 알러지성 비염을 유발시킨 후 관찰하였다.
- 면역조직화학법으로 Th2 분화 조절에 따른 과다 염증조절을 조사하였고, 조직화학적으로 점막손상 차이를 비교하였다. 본 연구는 하태독법이 비만 소아의 증가에 따른 알러지성 비염 발병의 증가를 조절할 수 있는 근거로서 의미가 있다고 생각되며, 이에 그 결과를 보고하고자 한다.
- 에서 IL-4, STAT6,CD40, FcɛRI, substance P, MMP-9, NF-kB p65, p-IkB,iNOS 양성반응이 모두 유의하게 적은 것을 확인하였다. 이러한 선행 연구결과를 통하여 두시 하태독법이 알러지성 비염 유발을 감소시키는 효과가 있다는 것은 확인하였으나, 비만으로 인하여 염증 유발이 가중되는 상태에서도 효과를 기대할 수 있는지 알아보고자 본 연구를 시작하였다.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색 하였다.
- 대조군 (Ctrl), 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (ARE), 두시 하태독법 시행 후 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (FGT)으로 나누었으며, 각 군에 10마리씩 배정하였다. ARE과 FGT에는 실험기간동안 high fat diet (fat, 60%; carbohydrate,20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자율 섭식시켰다. FGT는 태령 3주에 두시추출물 10 ㎎/㎏을 1회 경구 투여하는 하태독법을 실시하였다.
- ARE과 FGT에는 실험기간동안 high fat diet (fat, 60%; carbohydrate,20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자율 섭식시켰다. FGT는 태령 3주에 두시추출물 10 ㎎/㎏을 1회 경구 투여하는 하태독법을 실시하였다.
- Th2 분화조절과 이에 따른 비만세포 활성조절과 항염증효과를 조사하기 위해 면역조직화학을 실시하였다. 코 조직절편을 proteolysis 하기 위해 proteinase K(20 ㎍/㎖)에 5분 동안 처리한 후 10% normal mouse serum에서 2시간 동안에서 blocking 시켰다.
- 각 군을 13주령에 sodium pentobarbital 용액으로 마취하여 처치한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린 용액 (NBF: neutral buffered formalin)으로 심장관류고정을 실시하였다. 머리 분리 후 비강 주변 구조물을 제거한 다음 10% NBF에 실온에서 24시간 동안 고정하였다.
- 면역조직화학 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard error) 하였다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 코점막 10부위를 x400 배율에서 촬영한 다음 10,000,000 pixels를 영상분석 하였다.
- 그리고 1차 항체인 goat anti-IL-4 (1:200, Santa Cruz Biotec,USA), goat anti-STAT6 (1:50, Santa Cruz Biotec), goat anti-CD40 (1:50, Santa Cruz Biotec), goat anti-Fc ε receptor (1:50, Santa Cruz Biotec), goat anti-substance P(1:100, Santa Cruz Biotec), goat anti-MMP-9 (1:100,Santa Cruz Biotec), goat anti-NF-kB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec), goat anti-p-IκB (1:500, Santa Cruz Biotec),goat anti-iNOS (1:250, Santa Cruz Biotec), goat anti-COX-2 (1:100, Santa Cruz Biotec)에 4 ℃ humidified chamber에서 120시간 동안 반응시켰다.
- 실험동물은 태령 3주령의 NC/Nga 수컷 생쥐 (13~15 g, Orient, Korea)를 사용하였다. 대조군 (Ctrl), 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (ARE), 두시 하태독법 시행 후 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (FGT)으로 나누었으며, 각 군에 10마리씩 배정하였다. ARE과 FGT에는 실험기간동안 high fat diet (fat, 60%; carbohydrate,20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자율 섭식시켰다.
- 그 여액을 rotary evaporator에서 100㎖으로 농축한 후 동결 건조하여 추출물 32 g (수득률 32%)을 얻었다. 두시추출물의 HPLC을 통해 isoflavone(genistin, genistein, daidzine, daidzein)을 확인하였다.
- 비만은 실험기간 (10주) 동안 고지방식이의 섭식을 통해 유도하였다. 면역조직화학법으로 Th2 분화 조절에 따른 과다 염증조절을 조사하였고, 조직화학적으로 점막손상 차이를 비교하였다. 본 연구는 하태독법이 비만 소아의 증가에 따른 알러지성 비염 발병의 증가를 조절할 수 있는 근거로서 의미가 있다고 생각되며, 이에 그 결과를 보고하고자 한다.
- 하태독법을 자발적 Th2skewed condition이 일어나는 NC/Nga 생쥐에 실시한 후 알러지성 비염을 유발시킨 후 관찰하였다. 비만은 실험기간 (10주) 동안 고지방식이의 섭식을 통해 유도하였다. 면역조직화학법으로 Th2 분화 조절에 따른 과다 염증조절을 조사하였고, 조직화학적으로 점막손상 차이를 비교하였다.
- 알러지성 비염에 따른 코 점막상피의 손상을 조사하기 위해 조직화학을 실시하였다. 중성점액질 (neutral mucin)을 분비하는 점액분비세포의 분포 변화를 periodic acid Schiff (PAS) stain 실시 후 관찰하였다.
- 머리 분리 후 비강 주변 구조물을 제거한 다음 10% NBF에 실온에서 24시간 동안 고정하였다. 이후 탈회액 (decalcification solution, BBC, UK)에12시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
- 알러지성 비염에 따른 코 점막상피의 손상을 조사하기 위해 조직화학을 실시하였다. 중성점액질 (neutral mucin)을 분비하는 점액분비세포의 분포 변화를 periodic acid Schiff (PAS) stain 실시 후 관찰하였다. 우선 periodic acid에서 5분간 반응시킨 후 Schiff reagent에서 15분 동안 처리한 다음 sulfurous rinse에서 각 2분씩 3회 세척한 후 hematoxylin에서 1분 동안 대조염색 하였다.
- 1% OVA용액을 복강주사하여 감작시켰다. 최종 감작 후 7일이 경과된 10주령에 5일 동안 OVA 100 ㎍ : 인산완충용액 (PBS: phosphate buffered saline) 20 ㎕을 생쥐 비강에 점적하여 알러지성 비염을 1차 유발하였다. 1차 유발 후 7일이 경과된12주령에 동일한 방법으로 2차 유발하였다 (Fig.
- 본 연구는 Th2 skewed condition 상태에서 발병한 소아의 알러지성 비염에 대한 발병 조절 효과가 있는 하태독법이 비만이라는 염증성 조직손상을 가중시키는 요인이 포함된 상태에서 발병 조절 효과가 있는지를 조사하기 위해서 실시되었다. 하태독법을 자발적 Th2skewed condition이 일어나는 NC/Nga 생쥐에 실시한 후 알러지성 비염을 유발시킨 후 관찰하였다. 비만은 실험기간 (10주) 동안 고지방식이의 섭식을 통해 유도하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 태령 3주령의 NC/Nga 수컷 생쥐 (13~15 g, Orient, Korea)를 사용하였다. 대조군 (Ctrl), 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (ARE), 두시 하태독법 시행 후 알러지성 비염 유발 비만생쥐군 (FGT)으로 나누었으며, 각 군에 10마리씩 배정하였다.
- 알러지성 비염 유발을 위해 ovalbumin (OVA: chicken egg albumine, grade V, Sigma)을 항원으로 사용하였다. OVA 25 ㎍ : 수산화알루미늄겔 (Al(OH)3 gel) 1 ㎎: 인산완충용액 (PBS: phosphate buffered saline) 300 ㎕을 7주령, 8주령, 9주령에 0.
데이터처리
- 면역조직화학 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard error) 하였다.
- 영상분석 결과의 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSSInc., USA)를 통해 이루어졌으며, one-way ANOVA 시행을 통해 유의성 (P<0.05)을 검증하고 Duncan’s multiple range test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 임신 중 잘못된 식생활 습관으로 인해면역체계의 불균형이 더 나빠지고, 이로 인해 태독 (胎毒)이 발병한다. 이러한 태독에 따른 질환 발병을 예방하기 위해 전통적으로 하태독법 (下胎毒法)을 사용하였다. 하태독법은 출생 직후 한약재를 달인 약물에 부드러운 천을 적셔 신생아의 입 안 더러운 것을 닦아주고 소량 먹이는 방법이다17).
성능/효과
- 1. IL-4, STAT6, CD40 양성반응은 두시 하태독법 시 행군에서 유의하게 감소하였다.
- 2. FcɛRI, substance P, MMP-9 양성반응은 두시 하태독법 시행군에서 유의하게 감소하였다.
- 3. NF-kB p65, p-IkB, iNOS, COX-2 양성반응은 두시 하태독법 시행군에서 유의하게 감소하였다.
- 4. 두시 하태독법 시행군에서 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 손상된 호흡상피와 술잔세포 내 점액분비가 적었다.
- 핵 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보인 STAT6은 ARE에 비해 FGT에서 88% 유의성 있는 감소가 나타났다. CD40 양성반응은 세포막 주변 세포질에서 약한 양성반응을 보였으며, ARE에 비해 FGT에서 85% 유의성 있는 감소가 나타났다 (Fig. 2).
- FcɛRI 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 97% 유의성 있는 반응 감소가 나타났다. substance P 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 68% 유의성 있는 감소가 나타났다.
- IL-4는 세포질에서 강한 양성반응을 보였으며, ARE에 비해 FGT에서 79% 유의성 있는 감소가 나타났다. 핵 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보인 STAT6은 ARE에 비해 FGT에서 88% 유의성 있는 감소가 나타났다.
- substance P 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 68% 유의성 있는 감소가 나타났다. MMP-9 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 71% 유의성 있는 감소가 나타났다 (Fig. 3).
- PAS 염색 결과, 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 호흡상피의 손상이 증가하였는데 분비소낭이 없는 술잔세포의 다수 출현과 부종에 따른 점막고유층의 비대가 관찰되었다. FGT는 ARE에 비해 손상이 적은 것으로 관찰되었다 (Fig.
- Th2 분화 조절을 확인하기 위하여 IL-4, STAT6,CD40의 양성반응을 조사한 결과, IL-4는 FGT에서 유의성 있는 감소를 보였으며, STAT6 역시 FGT에서 유의성 있는 감소가 나타났다. CD40 양성반응도 ARE에 비해 FGT에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- MMP-9은 cytokine에 의해 합성되거나 분비되는데34), 점막고유층의 유리섬유를 파괴하여 염증관련 세포의 이동을 쉽게 만들어준다35,36). 따라서 FcɛRI, substance P, MMP-9 양성반응이 유의성 있게 감소하였다는 것을 보면, 두시 하태독법이 비만세포에서 탈과립을 억제하고 비만 상태의 알러지성 비염에서 비만세포 활성 알러지 반응을 조절할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 substance P의 발현이 억제되었다는 것은 알러지성 비염에서 나타나는 소양증을 완화시켜 긁기 행동에 따른 2차적 점막 손상 가능성의 감소를 의미한다.
- 또한 비만세포의 활성 조절에 관여하는 FcɛRI는FGT에서 유의성 있는 감소를 보였으며, 소양증에 관여하는 substance P 역시 유의성 있는 감소가 나타났다. 코 점막 내 부종을 유도하는 MMP-9 양성반응도 FGT에서 유의성 있는 감소가 나타났다.
- 본 연구에서는 두시 하태독법을 시행한 비만 생쥐에서 발병하는 알러지성 비염 완화 효과를 알아보기 위해 PAS 염색 결과, 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 호흡상피의 손상이 증가하지만 FGT는 ARE에 비해 손상이 적은 것으로 관찰되었다. 이는 두시 하태독법이 실제로 비만 상태의 알러지성 비염으로 인한 8 Effects of Douchi Hataedock Treatment on Induction of Allergic Rhinitis in Obese Induced NC/Nga Mice 호흡상피 손상 유발을 억제하는 효과가 있음을 보여주는 결과이다.
- p-IkB 양성반응도 ARE에 비해 FGT에서 66% 유의성 있는 감소를 보였다. 염증효소 iNOS 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 49% 유의성 있는 감소가 나타났다. 염증효소 COX-2 양성반응도 ARE에 비해 FGT에서 81% 유의성 있게 감소하였다 (Fig.
-
3. 항염증효과
염증효소전사인자인 NF-kB p65 양성반응은 ARE에 비해 FGT에서 56% 유의성 있는 반응 감소가 나타났다. p-IkB 양성반응도 ARE에 비해 FGT에서 66% 유의성 있는 감소를 보였다.
- 염증효소전사인자인 NF-kB p65 양성반응은 FGT에서 유의성 있는 감소를 보였으며, p-IkB 양성반응도 유의성 있는 감소를 보였다. 염증효소 iNOS 양성반응 역시 FGT에서 유의성 있는 감소가 나타났다.
- 본 연구에서는 두시 하태독법을 시행한 비만 생쥐에서 발병하는 알러지성 비염 완화 효과를 알아보기 위해 PAS 염색 결과, 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 호흡상피의 손상이 증가하지만 FGT는 ARE에 비해 손상이 적은 것으로 관찰되었다. 이는 두시 하태독법이 실제로 비만 상태의 알러지성 비염으로 인한 8 Effects of Douchi Hataedock Treatment on Induction of Allergic Rhinitis in Obese Induced NC/Nga Mice 호흡상피 손상 유발을 억제하는 효과가 있음을 보여주는 결과이다.
- 이상의 연구결과로 볼 때, 두시 하태독법은 비만 상태에서도 염증 유발 물질 분비를 감소시키고 알러지질환의 염증 반응을 감소시키는 것으로 생각된다. 따라서 출생 시 두시 하태독법의 시행은 비만 소아에서 알러지성 비염의 발병을 충분히 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- 하태독법의 알러지성 비염 완화 효과에 관한 연구22)에서 태령 3주에 하태독법을 시행한 NC/Nga 생쥐에 알러지성 비염을 유발한 후 관찰한 결과, 코 점막 손상이 완화되었으며, 하태독법을 실시한 군에서 interleukin (IL)-4, signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6), cluster of differentiation 40 (CD40),high-affinity IgE receptor (FceRI), substance P, matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), NF-κB, p-IkB, inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 양성반응이 현저히 낮았다.
- IL-4는 세포질에서 강한 양성반응을 보였으며, ARE에 비해 FGT에서 79% 유의성 있는 감소가 나타났다. 핵 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보인 STAT6은 ARE에 비해 FGT에서 88% 유의성 있는 감소가 나타났다. CD40 양성반응은 세포막 주변 세포질에서 약한 양성반응을 보였으며, ARE에 비해 FGT에서 85% 유의성 있는 감소가 나타났다 (Fig.
후속연구
- 이상의 연구결과로 볼 때, 두시 하태독법은 비만 상태에서도 염증 유발 물질 분비를 감소시키고 알러지질환의 염증 반응을 감소시키는 것으로 생각된다. 따라서 출생 시 두시 하태독법의 시행은 비만 소아에서 알러지성 비염의 발병을 충분히 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다. 향후 추가연구를 통해 하태독법 실시 후 비강 점막 내의 구체적인 Th2 condition 기전 규명이 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 출생 시 두시 하태독법의 시행은 비만 소아에서 알러지성 비염의 발병을 충분히 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다. 향후 추가연구를 통해 하태독법 실시 후 비강 점막 내의 구체적인 Th2 condition 기전 규명이 필요할 것으로 생각된다.
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