[논문]토마토 탄저병균 Colletotrichum coccodes 신속 검출 분자 마커

김준영; 장시운; 김현주; 김성환

doi:10.4489/kjm.20180021

초록
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PCR 기술을 이용하여 고추와 토마토의 탄저병을 일으키는 Colletotrichum coccodes 균을 빠르고 정확하게 검출하는 방법을 개발하였다. Colletotrichum 13종 22개 균주로 부터 translation elongation factor 1 alpha 유전자를 분석하여 C. coccodes에 특이적인 coccoTef-F/cocco Tef-R primer set를 제작하였다. 제작된 primer를 사용한 결과 일반 PCR 방법으로 10 ng, real-time PCR 방법으로는 10 pg 수준에서 C. coccodes가 특이적으로 검출이 가능하였다. 인공적으로 C. coccodes에 감염시킨 고추와 토마토 종자에서도 일반 PCR 방법과 real-time PCR 방법 모두 C. coccodes검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발한 PCR 방법은 수출입되는 종자에서 신속하고 정확하게 탄저병균 C. coccodes를 특이적으로 검출하는데 활용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Rapid and accurate detection methods for Colletotrichum coccodes, an anthracnose pathogen of pepper and tomato, were developed using PCR. A specific primer set, coccoTef-F/coccoTef-R, which was constructed by analyzing tef-$1{\alpha}$ genes from 13 species and 22 strains of Colletotrichum...

Rapid and accurate detection methods for Colletotrichum coccodes, an anthracnose pathogen of pepper and tomato, were developed using PCR. A specific primer set, coccoTef-F/coccoTef-R, which was constructed by analyzing tef-$1{\alpha}$ genes from 13 species and 22 strains of Colletotrichum, could specifically detect C. coccodes at a level of 10 ng by conventional PCR method and at 10 pg by real-time PCR. The PCR-based methods were also capable of detecting C. coccodes in pepper and tomato seeds artificially infected with the pathogen. The developed PCR methods can be applied for rapid and accurate inspection of C. coccodes in the seeds intended for export or import.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

주요 수입국에서는 탄저병균의 전파 및 발병 가능성이 있는 채소종자들을 규제하고 있다. 이에 따라 본 연구는 수출하고 있는 채소종자에서 C. coccodes가 감염된 종자를 신속하고 정확히 검출할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 수행되었다.

제안 방법

분석한 염기서열은 Clustal Omega 프로그램(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)을 사용하여 염기서열을 나열하고 유사성을 비교 분석한 후, 종 간 차이가 나타나는 염기서열 부분에서 219 bp 크기의 C. coccodes TEF-1α 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 coccoTef-F (5'-CAG TAG CTA ACG TTC ATC TTA GCC G-3')와 coccoTef-R (5'-ATT TTG CGC CCC AAG ATT GG-3')을 디자인하였다.

대상 데이터

C. coccodes 2균주를 포함하여 Colletotrichum속에 속하는 13종 22개 균주와 토마토와 고추에 부생균으로 흔하게 존재하는 Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Trichoderma sp. 등의 균주를 한국농업미생물자원센터(KACC)와 Centraalbureau voor Schimmelcultures- Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Collections (CBS-KNAW)에서 분양 받아 사용하였다(Table 1). 모든 균주는 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 25℃, 10~12일간 배양하였다.

이론/모형

같이 배양한 종자를 꺼내 육안으로 탄저병 종자감염을 확인할 수 있는 감염된 고추와 토마토 종자를 선별하여 실험에 사용하였다. 감염된 종자는 DNeasy Plant mini kit를 사용하여 DNA 추출하였고 앞서 수행하였던 일반 PCR 방법과 real-time PCR 방법을 이용하여 검출능을 검정하였다.

성능/효과

본 연구에서는 TEF-1α 유전자를 타겟으로 coccoTef-F/coccoTef-R primer set를 제작하여 다른 Colletotrichum종에서 비특이적인 검출 결과가 발생할 가능성을 최소화하였고 증폭 산물의 크기도 219 bp로 이전 연구된 크기보다 작아 PCR 반응시간도 단축할 수 있어 검출 시간을 더욱 절약할 수 있다. 따라서 국내외로 채소 및 채소종자를 수출하거나 수입하기 위한 식물검역 작업 시, C.
5). 이러한 결과는 일반 PCR 방법과 real-time PCR 방법 모두 감염된 종자에서 제작한 coccoTef-F/coccoTef-R primer를 사용하여 C. coccodes의 검출이 가능하다는 것을 보여준다.
반면에, 부생균 6개 속 진균의 DNA mixture에서는 증폭되지 않았다(lane 24). 이러한 결과로 본 연구에서 제작한 primer set가 C. coccodes에 대한 높은 특이성을 보임을 알 수 있다.

후속연구

본 연구에서는 TEF-1α 유전자를 타겟으로 coccoTef-F/coccoTef-R primer set를 제작하여 다른 Colletotrichum종에서 비특이적인 검출 결과가 발생할 가능성을 최소화하였고 증폭 산물의 크기도 219 bp로 이전 연구된 크기보다 작아 PCR 반응시간도 단축할 수 있어 검출 시간을 더욱 절약할 수 있다. 따라서 국내외로 채소 및 채소종자를 수출하거나 수입하기 위한 식물검역 작업 시, C. coccodes의 감염 유무를 신속히 파악할 수 있을 것으로 기대된다.

참고문헌 (11)

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