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문제 정의
- 이에 본 연구는 국내에 자생하는 은행잎의 Ginkgetin 과 isoginkgetin을 화장품 소재로 이용 가능성 여부를 연구하기 위해 은행잎에서 Ginkgetin과 isoginkgetin을 분리 정제하여 그 화학 구조 및 물리화학적 특성을 규명하고자 한다.
제안 방법
- 0 kg을 ethanol (20 L)로 상온에서 3회 반복 추출한 후 여과․농축하였다. Ethanol 추출물을 증류수 2 L에 현탁 시킨 후 각 2 L 의 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol로 순차적 3회 반복 용매 분획을 실시하여 최종적으로 n-hexane 분획물 (35 g), ethyl acetate 분획물(28 g), n-butanol분획물(45 g)의 함유를 확인하였다.
- 0 kg을 상온에서 3회 반복 추출하여 얻은 ethanol 추출물에 대해 용매 분획을 실시하여 n-hexan 분획물(35 g), ethyl acetate 분획물(28 g)을 확보하였다. Ethyl acetate 분획물(28 g)에 대하여 6개의 1차 분획물을 확보하였고, 이 중 3번째 분획물에서 bilobetin과 amentoflavone을 분리하였으며, 5번째 분획물에서 또다시 4개의 2차 분획물을 확보하였다. 이 4개의 2차 분획물 중 Fr.
- Ethyl acetate 분획물(28 g)에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(70-230 mesh, ∅12×25 cm, CHCl2/MeOH =100:1→0:1)를 실시하여 6개의 1차 분획물로 나누었다 (Fr.1-Fr.6).
- Fr.3-1 에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(∅1.5×50cm, MeOH/H2O=70:30)를 실시하여 bilobetim을 분리하였고 Fr.3-3 에 대해서도 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(∅1.5×50 cm, MeOH/H2O=70:30)를 실시하여 최종적으로 amentoflavone을 분리하였다.
- Fr.5-3에 대하여 C-18 컬럼 크로마토그래피(40-63 μ m, ∅2×50 cm, Methanol/H2O=20:80→60:40)를 실시하여 1개의 3차 분획을 진행하였다 (Fr.5-3).
- Ginkgetin과 isoginkgetin의 분자량을 확인하고자 Electron-Impact mass spectrophotometer (EI-MS) 스펙트럼을 이용해 측정하였다. 그 결과, Ginkgetin은 EI-MS 스펙트럼 통해 관찰된 [M + H]+의 567에서의 peak 와 [M – H]-의 565에서의 peak로부터 566의 분자 량을 갖는 화합물임을 확인하였다.
- Ginkgetin과 isoginkgetin의 특징적인 분자 구조적 골격을 확인하기 위하여 UV spectrum을 이용해 최대 흡수 피크를 측정하였다.
- 그 결과 최종적으로 2 mole의 flavone 유도체가 B ring의 C-3′와 D ring의 C-8″가 직접 결합된 2 종의 순수한 biflavonoid계 화합물을 확보하였다.
- 기기 분석을 통해 얻은 데이타들을 아래와 같이 종합하여 문헌에 보고된 ginkgetin과 isoginkgetin을 비교했을 때, 그 정보가 정확히 일치하였으므로 최종적으로 두 화합물을 ginkgetin과 isoginkgetin으로 동정하였다.
- 또한 5번째 분 획물인 Fr.5(2.5 g)에 대하여 C-18 충진제를 사용한 역상 컬럼 크로마토그래피(40-63 μm, ∅4×50 cm, Methanol/ H2O=20:80→80:20)를 실시하여 4개의 2차 분획을 진행하 였다(Fr.5-1-Fr.5-4).
- 물질의 구조를 정확히 규명하고 분자량을 확인하고자 Electron-Impact mass spectrophotometer (EI-MS) 스펙트럼을 이용해 측정하였다.
- 본 연구에서는 추출 정제된 은행잎의 ginkgetin과 isoginkgetin의 순도 분석을 위해 Agilent 1200 series와, 분석용 컬럼 Luna C18 column (phenomenex, 250×4.6 mm, 5 µm)을 사용하여 HPLC 분석을 시행하였다.
- 은행잎 추출물의 다양한 약리학적 효능을 나타내는 Biflavonoid의 단일 물질인 ginkgetin과 isoginkgetin을 분리하여 두 화합물의 화학 구조 및 물리화학적 특성을 연구한 결과는 다음과 같다.
- 은행잎에서 분리한 ginkgetin Fig. 7과 isoginkgetin (Fig. 8)의 정확한 구조를 동정하기 위해 1H-NMR과 13C-NMR 및 DEPT 스펙트럼 측정을 통해 분자 내 수소 -탄소의 골격구조를 분석하였다. 두 개의 화합물 모두 1H-NMR 스펙트럼에서 관찰되는 6∼8 ppm 사이의 다수의 aromatic proton 피크들로부터 flavonoid 화합물의 특징적인 aromatic proton의 존재를 확인하였다.
- 음건한 은행잎 (Ginkgo biloba L.) 1.0 kg을 ethanol (20 L)로 상온에서 3회 반복 추출한 후 여과․농축하였다. Ethanol 추출물을 증류수 2 L에 현탁 시킨 후 각 2 L 의 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol로 순차적 3회 반복 용매 분획을 실시하여 최종적으로 n-hexane 분획물 (35 g), ethyl acetate 분획물(28 g), n-butanol분획물(45 g)의 함유를 확인하였다.
- 음건한 은행잎 1.0 kg을 상온에서 3회 반복 추출하여 얻은 ethanol 추출물에 대해 용매 분획을 실시하여 n-hexan 분획물(35 g), ethyl acetate 분획물(28 g)을 확보하였다. Ethyl acetate 분획물(28 g)에 대하여 6개의 1차 분획물을 확보하였고, 이 중 3번째 분획물에서 bilobetin과 amentoflavone을 분리하였으며, 5번째 분획물에서 또다시 4개의 2차 분획물을 확보하였다.
- Ethyl acetate 분획물(28 g)에 대하여 6개의 1차 분획물을 확보하였고, 이 중 3번째 분획물에서 bilobetin과 amentoflavone을 분리하였으며, 5번째 분획물에서 또다시 4개의 2차 분획물을 확보하였다. 이 4개의 2차 분획물 중 Fr.5-3 에서는 sciadopitysin을 분리하였고, Fr.5-1에서는 2개의 3차 분획물을 확보하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 최종적으로 2 mole의 flavone 유도체가 B ring의 C-3′와 D ring의 C-8″가 직접 결합된 2 종의 순수한 biflavonoid계 화합물을 확보하였다.
- 그 결과 최종적으로 2 mole의 flavone 유도체가 B ring의 C-3′와 D ring의 C-8″가 직접 결합된 2 종의 순수한 biflavonoid계 화합물을 확보하였다. 이 두 화합물들의 이 화학적 성질 및 spectral data를 종합하고 이 data를 문헌치와 비교하여 ginkgetin (18 mg)과 isoginkgetin (23 mg)으로 결정하여 확보하였다. Fig.
- 이 중 3번째 분획물인 Fr.3에 대하여 C-18 충진제를 사용한 역상 컬럼 크로마토그래피(40-63 μm, ∅4×50 cm, Methanol/H2O=20:80→80:20)를 실시하여 3 개의 2차 분획을 진행하였다 (Fr.3-1-Fr.3-3).
- 이 중 Fr.5-1 (800 mg)에 대하여 C-18 컬럼 크로마토그래피(40-63 μm, ∅2×50 cm, Methanol/H2O=40:60→80:20)를 실시하여 2개의 3차 분획을 진행하였다 (Fr.5-1-1-Fr.5-1-2).
- 6 mm, 5 µm)을 사용하여 HPLC 분석을 시행하였다. 이동상의 gradient 조건을 포함한 분석 조건은 아래의 Table 1과 같으며 HPLC 분석으로 두 시료의 순도를 측정하였다. 그 결과 각각 동일한 분석 조건에서 측정하여 ginkgetin은 순도 99.
-
1.6 Nuclear Magnetic Resonance을 통한 구조 동정
정확한 구조를 동정하기 위해 1H-NMR과 13C-NMR 및 DEPT 스펙트럼 측정을 통해 분자 내 수소-탄소의 골격구조를 분석하였다
. - 추출 정제된 은행잎의 ginkgetin과 isoginkgetin의 순도 분석을 위해 Agilent 1200 series와, 분석용 컬럼 Luna C18 column (phenomenex, 250×4.6 mm, 5 µm)을 사용하여 HPLC 분석을 시행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 은행잎은 2013년 대전광역시 유성구에서 10월 말부터 11월 초 까지 채집하여 음건 후 분쇄하여 사용하였다.
성능/효과
- 1. 두 화합물의 분자량은 566이며, 분자식은 C32H22O10로 동일하고 270 nm와 330 nm 부근에서 UV 최대 흡수 파장을 갖는다. 또한 두 화합물 내에 특징적인 관능기 (functional group)로 수산기(OH)와 공유 카르보닐기 (conjugated carbonyl)가 존재하며, flavonoid의 aromatic ring에 결합한 특징적인 proton을 갖고 있으며 2개의 메톡시(methoxy) 치환기들을 포함하여 총 32개의 탄소가 존재한다.
- Flavonoid 화합물의 기본 탄소 수가 15개이며, flavonoid 두 단위가 결합한 biflavonoid의 기본 탄소의 수는 30개이다. 13C-NMR 스펙트럼에서 두 화합물 모두 각 32의 탄소가 확인되었으므로, ginkgetin과 isoginkgetin이 biflavonoid 골격을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 2개의 추가적인 탄소는 biflavonoid에 결합한 치환기들로서, 2개의 methoxy 기가 biflavonoid에 추가로 결합되어 있음을 확인하였다.
- 2. HPLC를 통한 순도 측정 결과 각각 동일한 분석 조건에서 측정하여 ginkgetin은 순도 99.4%, isoginkgetin 은 순도 100%로 나타나 두 화합물 모두 99% 이상의 고 순도로 확인되었다.
- 13C-NMR 스펙트럼에서 두 화합물 모두 각 32의 탄소가 확인되었으므로, ginkgetin과 isoginkgetin이 biflavonoid 골격을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 2개의 추가적인 탄소는 biflavonoid에 결합한 치환기들로서, 2개의 methoxy 기가 biflavonoid에 추가로 결합되어 있음을 확인하였다. DEPT 스펙트럼을 통해 13C-NMR에서 관찰된 32개의 탄소들의 1차 (CH3), 2차 (CH2), 3차 (CH), 4차 (C) 탄소의 정확한 구성비를 확인할 수 있었다.
- 13C-NMR 스펙트럼에서 두 화합물 모두 각 32의 탄소가 확인되었으므로, ginkgetin과 isoginkgetin이 biflavonoid 골격을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 2개의 추가적인 탄소는 biflavonoid에 결합한 치환기들로서, 2개의 methoxy 기가 biflavonoid에 추가로 결합되어 있음을 확인하였다. DEPT 스펙트럼을 통해 13C-NMR에서 관찰된 32개의 탄소들의 1차 (CH3), 2차 (CH2), 3차 (CH), 4차 (C) 탄소의 정확한 구성비를 확인할 수 있었다.
- 3. MS spectrum을 통한 분자량 측정에서 Ginkgetin은 EI-MS 스펙트럼 통해 관찰된 [M + H]+의 567에서의 peak 와 [M – H]-의 565에서의 peak로부터 566의 분자량을 갖는 화합물임을 확인하였다.
- 4. UV spectrum을 통한 흡수 극대 파장 측정 시 270 nm 와 330 nm 부근에서 특징적인 UV 최대 흡수 파장을 갖는다. Ginkgetin과 isoginkgetin 모두 UV 스펙트럼 측정 시 270 nm와 330 nm 부근에서 최대 흡수파장을 나타내므로, 두 화합물 모두 flavonoid 화합물의 골격을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- 5. Nuclear Magnetic Resonance을 통한 구조 동정을 시행한 결과 두 개의 화합물 모두 1H-NMR 스펙트럼에서 관찰되는 6∼8 ppm 사이의 다수의 aromatic proton 피크들로부터 flavonoid 화합물의 특징적인 aromatic proton의 존재를 확인하였다.
- 2개의 추가적인 탄소는 biflavonoid에 결합한 치환기들로서, 2개의 methoxy 기가 biflavonoid에 추가로 결합되어 있음을 확인하였다. DEPT 스펙트럼을 통해 13C-NMR에서 관찰된 32개의 탄소들의 1차 (CH3), 2차 (CH2), 3차 (CH), 4차 (C) 탄소의 정확한 구성비를 확인할 수 있었다.
- Flavonoid 화합물은 UV spectrum으로 측정 시, 270 nm와 330 nm 부근에서 특징적인 UV 최대 흡수 파장을 갖는다. Ginkgetin과 isoginkgetin 모두 UV 스펙트럼 측 정 시 270 nm와 330 nm 부근에서 최대 흡수파장을 나타내므로, 두 화합물 모두 flavonoid 화합물의 골격을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- Flavonoid 화합물은 UV spectrum으로 측정 시, 270 nm와 330 nm 부근에서 특징적인 UV 최대 흡수 파장을 갖는다. Ginkgetin과 isoginkgetin 모두 UV 스펙트럼 측 정 시 270 nm와 330 nm 부근에서 최대 흡수파장을 나타내므로, 두 화합물 모두 flavonoid 화합물의 골격을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, Ginkgetin은 EI-MS 스펙트럼 통해 관찰된 [M + H]+의 567에서의 peak 와 [M – H]-의 565에서의 peak로부터 566의 분자 량을 갖는 화합물임을 확인하였다. Isoginkgetin 역시 EI-MS 스펙트럼 통해 [M + H]+와 [M - H]-에서 ginkgetin과 동일한 mass peak가 관측됨으로써 ginkgetin과 isoginkgetin이 같은 분자량을 갖는 이성질체임을 확인하였다. Fig.
- 이동상의 gradient 조건을 포함한 분석 조건은 아래의 Table 1과 같으며 HPLC 분석으로 두 시료의 순도를 측정하였다. 그 결과 각각 동일한 분석 조건에서 측정하여 ginkgetin은 순도 99.4%, isoginkgetin은 순도 100%로 나타나 두 화합물 모두 99% 이상의 고순도로 확인되어 본 연구의 생리활성 측정에 사용하였다. Fig.
- 그 결과, Ginkgetin은 EI-MS 스펙트럼 통해 관찰된 [M + H]+의 567에서의 peak 와 [M – H]-의 565에서의 peak로부터 566의 분자 량을 갖는 화합물임을 확인하였다.
- 두 개의 화합물 모두 1H-NMR 스펙트럼에서 관찰되는 6∼8 ppm 사이의 다수의 aromatic proton 피크들로부터 flavonoid 화합물의 특징적인 aromatic proton의 존재를 확인하였다.
- 이상의 데이타를 보고된 문헌과 비교했을 때, 두 화합 물은 문헌에 보고된 ginkgetin (Table 2)과 isoginkgetin (Table 3)의 정보와 정확히 일치함을 확인하였다.
- 이상의 데이타를 보고된 문헌과 비교했을 때, 두 화합물은 문헌에 보고된 ginkgetin 과 isoginkgetin 의 정보와 정확히 일치함을 확인하였다.
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