풋마름병 균에 대해 강한 저해활성을 갖는 활성물질 Compound S와 conversion product인 compound S'이 Bacillus subtilis JW-1 배양액에서 일련의 크로마토그래피 방법으로 분리 정제되었고, $^1H$NMR, $^{13}C$ NMR, $^1H-^1H$ COSY와 HMBC 등의 spectra 분석에 의해 구조가 alanyl-L-${\beta}$-(2,3-epoxycyclohexyl-4-one)alanine와 alanyl-L-${\beta}$-(2,3-dihydroxycyclohexyl-4-one) alanine로 각각 동정되었다. Compound S는 $G^+$, $G^-$ bacteria, yeast와 Candida albicans 등에 대해 광범위한 antimicrobial activity를 나타내며, conversion product의 활성 상실을 통해 intact oxirane ring이 Compound S의 활성에 필수적임이 밝혀졌다.
풋마름병 균에 대해 강한 저해활성을 갖는 활성물질 Compound S와 conversion product인 compound S'이 Bacillus subtilis JW-1 배양액에서 일련의 크로마토그래피 방법으로 분리 정제되었고, $^1H$ NMR, $^{13}C$ NMR, $^1H-^1H$ COSY와 HMBC 등의 spectra 분석에 의해 구조가 alanyl-L-${\beta}$-(2,3-epoxycyclohexyl-4-one)alanine와 alanyl-L-${\beta}$-(2,3-dihydroxycyclohexyl-4-one) alanine로 각각 동정되었다. Compound S는 $G^+$, $G^-$ bacteria, yeast와 Candida albicans 등에 대해 광범위한 antimicrobial activity를 나타내며, conversion product의 활성 상실을 통해 intact oxirane ring이 Compound S의 활성에 필수적임이 밝혀졌다.
The inhibitory compound (Compound S) against Ralstonia solanacearum and its conversion product (Compound S') were isolated from the culture filtrate of Bacillus subtilis JW-1 using a series of chromatography procedures. The structures were elucidated as alanyl-L-${\beta}$-(2,3-epoxycycloh...
The inhibitory compound (Compound S) against Ralstonia solanacearum and its conversion product (Compound S') were isolated from the culture filtrate of Bacillus subtilis JW-1 using a series of chromatography procedures. The structures were elucidated as alanyl-L-${\beta}$-(2,3-epoxycyclohexyl-4-one)alanine and alanyl-L-${\beta}$-(2,3-dihydroxycyclohexyl-4-one)alanine, respectively on the basis of nuclear magnetic resonance spectral data, including $^1H$, $^{13}C$, $^1H-^1H$ correlation spectroscopy and heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy. The compound S exhibited a broad antimicrobial activity against $G^+$, $G^-$ bacteria, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. The activity loss of the conversion product revealed that the epoxy function was essential for activity of Compound S.
The inhibitory compound (Compound S) against Ralstonia solanacearum and its conversion product (Compound S') were isolated from the culture filtrate of Bacillus subtilis JW-1 using a series of chromatography procedures. The structures were elucidated as alanyl-L-${\beta}$-(2,3-epoxycyclohexyl-4-one)alanine and alanyl-L-${\beta}$-(2,3-dihydroxycyclohexyl-4-one)alanine, respectively on the basis of nuclear magnetic resonance spectral data, including $^1H$, $^{13}C$, $^1H-^1H$ correlation spectroscopy and heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy. The compound S exhibited a broad antimicrobial activity against $G^+$, $G^-$ bacteria, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. The activity loss of the conversion product revealed that the epoxy function was essential for activity of Compound S.
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문제 정의
solanacearum에 대해 강한 in vitro antibiosis를 보이는 생리활성물질 Compound S와 conversion product로 추정되는 Compound S’의 존재가 확인되었다. 본 연구에서는 JW-1 균주가 생산하는 강한 antibiosis 활성을 나타내는 저해 활성물질을 분리, 특성 조사를 실시하고, 활성물질 생산을 위한 배양조건을 확립하고자 한다.
제안 방법
Compound S의 구조는 ESI-MS, 1H NMR, 13C NMR, 2DCOSY 등의 data를 근거로 결정하였다. Electrospray ionization(ESI) mass spectrometer (Hewlett-Packard) positive mode로 분석한 결과 (M+H)+peak는 m/z 271.
JW-1 균주의 활성물질 생산을 위한 최적 배지를 선발하기 위해 Nutrient 배지, CDox 배지(sucrose 30 g, NaNO3 3 g, MgSO4・7 H2O 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4・7 H2O 0.01 g, K2HPO4 1 g/L, pH 7.2)와 GA 배지[K2HPO4 7 g, KH2PO4 2 g, MgSO4・7 H2O 0.1 g, (NH4)2SO4 1 g, yeast extract 0.05 g, Fe2(SO4)3 0.15mg, MnSO4・H2O 5 mg, CuSO4・5 H2O 0.16 mg, sucrose 13g/L, pH 7.0]에 각각 접종하여 200 rpm, 37°C에서 배양하며, 매 2시간마다 pH 변화, 배지 종류와 배양 시간에 따른 균체 밀도와 활성을 측정하였다.
배양액을 6,000 rpm에서 15분간 원심분리 한 후 상등액을 Amberlite XAD 16 column (3.5× 45 cm)에 흡착시키고 증류수로 세척한 후 methanol로 용출시켜 감압 농축한 후 silica gel column chromatography (silicagel 60, Merck, 3.5 × 45 cm)를 ethanol: H2O (10:1) 용매 조건으로 행하여 활성 분획(F7~F9, 1.4 g)을 획득하였다.
본 연구실에서 강력한 풋마름병 biocontrol agent로 선발한 Bacillus subtilis JW-1 배양액에서 풋마름병 발병 억제물질로 novel surfactin isoform에 이어 Compound S를 분리하였다. Compound S는 spectral data와 문헌조사 등을 통해 이미 보고된 바 있는 bacilysin과 동일한 물질임이 밝혀졌으나, bacilysin의 R.
활성분획을 다시 감압 농축한 다음 70% methanol을 이용하여 Sephadex LH-20(Pharmacia) column chromatography를 행한 후 최종 분리과정으로 HPLC (Waters, C18 µbondapak column, 1% HCOOH: MeOH = 87:13 isocratic system, 210 nm UV detection)을 실시하여 compound S (39 mg)와 S’ (15 mg)을 분리하였다.
대상 데이터
solanacearum에 대한 antibiotic activity를 paper disc diffusion method로 측정하였다. 본 실험에서 사용된 R. solanacearum은 농업과학기술원에서 분양 받은 균주와 풋마름병에 감염된 고추와 토마토에서 분리한 균주를 사용하였다. Tryptic soy agar (Sigma-Aldrich) plate에 100µl의 R.
이론/모형
0]에 각각 접종하여 200 rpm, 37°C에서 배양하며, 매 2시간마다 pH 변화, 배지 종류와 배양 시간에 따른 균체 밀도와 활성을 측정하였다. 균체 성장은 620 nm에서의 흡광도로 측정하고, 활성물질 생산은 R. solanacearum에 대한 antibiotic activity를 paper disc diffusion method로 측정하였다. 본 실험에서 사용된 R.
성능/효과
13C NMR spectrum에서 12개 carbon signal이 확인되었으며, DEPT에 의해 carbon의 multiplicity를 확인할 수 있었다(1 × methyl, 3 × methylene, 5 × methine).
13C NMR spectrum은 compound S의 spectrum과 유사하며 단지 epoxide carbon C2’와 C3’ peak가 δ 74.3과 70.4 ppm으로 각각 downfield로 shift되어 oxirane ring이 dihydroxy group으로 가수분해되었음을 알 수 있었다.
Compound S는 spectral data와 문헌조사 등을 통해 이미 보고된 바 있는 bacilysin과 동일한 물질임이 밝혀졌으나, bacilysin의 R. solanacearum에 대한 저해활성은 아직 보고된 바 없었으며, 또한 본 연구에서 conversion product인 Compound S’의 분리를 통해 oxirane ring 구조가 bacilysin 활성에 필수적임을 확인할 수 있었다.
CompoundS는 R. solanacearum뿐만 아니라 G+, G-bacteria, yeast, Candida albicans에 대해서도 강한 antimicrobial 활성(Table 2)을 나타내었으나 conversion product인 Compound S’는 antibiosis 활성이 거의 없어 intact oxirane ring 구조가 Compound S 활성에 필수적임이 확인되었다.
JW-1 배양액에서 풋마름병균 저해활성물질을 분리하는 과정에서 surfactin isoform 이외에 R. solanacearum에 대해 강한 in vitro antibiosis를 보이는 생리활성물질 Compound S와 conversion product로 추정되는 Compound S’의 존재가 확인되었다.
이로서 JW-1 균주의 활성물질 생산에 탄소원으로는 sucrose, 질소원으로는 ammonium salt가 효과적임을 알 수 있었다. 균체 성장이 빠르고 높은 활성물질 생산을 보인 GA 배지에서 JW-1 균주의 배양 특성을 조사한 결과 균체의 성장과 활성물질의 생산이 같이 동시에 이루어지는 것으로 나타났다. 배양액의 pH 변화는 처음 성장시기는 7.
순수하게 분리된 Compound S’ 역시 ninhydrin spray에 positive하였으며, 산 가수분해 후 실시한 TLC plate 상에 두 개의 ninhydrin positive spot, alanine과 동정되지 않는 아미노산으로 분리되어 dipeptide compound이며, epoxide function에 특이적인 NBP spray reagent에 대해서는 발색반응을 보이지 않아 epoxide function은 포함하지 않음을 시사하였다.
Nutrient 배지에서는 균체 성장은 잘 이루어졌으나 활성물질 생산이 전혀 이루어지지 않았고, CDox배지의 경우 활성물질 생산이 미미한 반면에 GA 배지에서는 빠른 균체 성장과 높은 활성물질 생산이 이루어졌다(자료 미제시). 이로서 JW-1 균주의 활성물질 생산에 탄소원으로는 sucrose, 질소원으로는 ammonium salt가 효과적임을 알 수 있었다. 균체 성장이 빠르고 높은 활성물질 생산을 보인 GA 배지에서 JW-1 균주의 배양 특성을 조사한 결과 균체의 성장과 활성물질의 생산이 같이 동시에 이루어지는 것으로 나타났다.
이상의 spectral 결과와 문헌상의 data를 비교하여 Compound S는 alanyl-L-β-(2,3-epoxycyclohexyl4-one)alanine (Fig. 2)으로 bacilysin과 동일한 물질로 동정되었다(Walker and Abraham, 1970).
이상의 결과를 종합하여 Compound S’구조는 alanyl-L-β-(2,3-dihydroxy cyclohexyl-4-one)alanine으로 동정되었다.
풋마름병 균에 대해 강한 저해활성을 갖는 활성물질 Compound S와 conversion product인 compound S’이 Bacillus subtilis JW-1 배양액에서 일련의 크로마토그래피 방법으로 분리 정제 되었고, 1H NMR, 13C NMR, 1H-1 H COSY와 HMBC 등의 spectra 분석에 의해 구조가 alanyl-L-β-(2,3-epoxycyclohexyl4-one)alanine와 alanyl-L-β-(2,3-dihydroxycyclohexyl-4-one) alanine로 각각 동정되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Bacillus subtilis JW-1 균주가 해로운 녹조 현상을 해결하는 biocontrol agent로의 개발 가능성이 아주 큰 균주로 생각하는 근거가 무엇인가?
또한 최근에 bacilysin의 Nostoc sp., Anabaena sp.와 Microcystis aeruginosa 등에 대해 강한 anticyanobacterial activity가 보고되었다(Wu et al., 2014).
Ralstonia solanacearum은 작물에 어떠한 병을 유발하는가?
환경 오염과 먹거리 안전성에 대한 관심이 높아지면서 지난 70년간 무공해 농약을 개발하기 위한 목적으로 국내외에서 천연물 기원의 생리활성물질 탐색이 활발히 진행되어 왔다. 그러나 작물의 뿌리 상처를 통해 식물체에 침투하여 주요 경제 작물에 풋마름병(bacterial wilt)을 유발시킴으로써(Tans-Kersten et al., 2001) 막대한 경제적 손실을 초래하는 토양성 식물 병원균인 Ralstonia solanacearum에 대한 생물학적 방제는 아직 초보적인 단계이다(Fujiwara et al.
JW-1 균주의 활성 물질 생산을 위한 최적 배지를 선발하기 위해 사용한 배지는 무엇인가?
JW-1 균주의 활성물질 생산을 위한 최적 배지를 선발하기 위해 Nutrient 배지, CDox 배지(sucrose 30 g, NaNO3 3 g, MgSO4・7 H2O 0.5 g, KCl 0.5 g, FeSO4・7 H2O 0.01 g, K2HPO4 1 g/L, pH 7.2)와 GA 배지[K2HPO4 7 g, KH2PO4 2 g, MgSO4・7 H2O 0.1 g, (NH4)2SO4 1 g, yeast extract 0.05 g, Fe2(SO4)3 0.15mg, MnSO4・H2O 5 mg, CuSO4・5 H2O 0.16 mg, sucrose 13g/L, pH 7.0]에 각각 접종하여 200 rpm, 37°C에서 배양하며, 매 2시간마다 pH 변화, 배지 종류와 배양 시간에 따른 균체 밀도와 활성을 측정하였다. 균체 성장은 620 nm에서의 흡광도로 측정하고, 활성물질 생산은 R.
참고문헌 (7)
Fujiwara, A., Fujisawa, M., Hamasaki, R., Kawasaki, T., Fujie, M., and Yamada, T. 2011. Biocontrol of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4155-4162.
Hammock, L., Hammock, B., and Casida, J. 1974. Detection and analysis of epoxides with 4-(p-nitrobenzyl)-pyridine. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 12, 759-764.
Kwon, J.W. and Kim, S.D. 2014. Characterization of an antibiotic produced by Bacillus subtilis JW-1, that suppresses Ralstonia solanacearum. J. Microbiol. Biotechnol. 24, 13-18.
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