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문제 정의
- 그러나 GABA의 경우, 구체적인 재배지역별, 숙기별, 재배 시기에 따른 GABA 함량변화에 대한 연구가 부족하다. 따라서 본 연구에서는 GABA 분석법 검증 과정을 통해 분석결과의 신뢰도를 확보하고, 국내산 여주의 재배 지역별, 시기별, 숙기별에 따른 여주의 GABA 함량을 비교 분석하여 식생활에서 영양정보로 활용될 뿐만 아니라, 여주의 기능성 성분을 활용한 식품개발의 기초자료로 이용하고자 수행되었다.
- 본 연구에서는 여주의 GABA 분석법을 검증하고, 국내산 여주의 재배지역, 수확시기 및 숙기에 따른 GABA 함량 변화를 분석하였다. GABA 분석법을 검증하기 위해 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 확인하였고, 그 결과 직선성의 상관계수 값은 0.
제안 방법
- GABA에 대한 분석법의 유효성은 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 통해 검증하였다. 특이성은 불순물, 분해물, 배합성분 등 여러 가지 다른 성분들이 혼합되어 있는 추출물 중 목표성분만을 선택적으로 정성 및 정량 분석할 수 있는지를 확인하기 위한 것으로, GABA 표준용액과 여주추출물 중 GABA의 머무름 시간을 비교하여 평가하였다(KFDA 2004).
- 0 mg/mL의 농도로 준비하여 사용하였다. 각각의 GABA 표준용액 1 mL를 추출 전 시료에 첨가하고, GABA 추출 과정에 따라 추출한 뒤 유도체화 및 HPLC 분석을 통하여 얻은 각각의 농도의 비를 이용하여 아래의 공식에 의해서 회수율을 계산하였다.
- 87 μg/mL로 나타났다(Table 1). 균일한 시료로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 각각 측정치 간의 근접성을 확인하였다. 일내시험은 하룻 동안 6회의 추출 및 분석을 반복 측정한 결과이며, 일간시험은 6일 동안 하루에 3회의 추출 및 분석을 반복하여 얻은 결과의 RSD 측정하여 Table 1에 나타내었다.
- 20 μL의 반응시약을 넣고 vortex 한 후 55℃의 water bath에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후 실온으로 냉각하고, HPLC(Waters 2690 system)를 이용하여 분석하였다. Column으로 Mightysil RP-18 GP column(4.
- 50%로 95% 이상의 높은 회수율과 2% 이하의 상대표준편차를 보였다. 여주의 GABA 최적추출조건으로 추출용매는 물, 추출횟수는 2회, 추출방법은 균질추출로 선정하였다. 재배지역별로 GABA를 분석한 결과, 0.
- 6×250 mm, 5 μm, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하였고, 이동상은 A는 AccQ-Tag Eluent A concentrate 200 mL를 HPLC water 2 L에 희석하였고, 이동상 B는 AccQ-Tag Eluent B를 이용하였다. 용매조성은 기울기 용리로 초기 A:B를 90:10으로 유지시켰으며, 30분까지 70:30(0.6 mL/min), 31분까지 0:100(0.8 mL/min), 38분까지 0:100(0.8 mL/min), 39분까지 90:10(0.6 mL/min), 50분까지 90:10(0.6 mL/min)으로 분석하였다. 시료 주입량은 10 μL, 검출기는 fluorescence detector(474, Waters)를 사용하여 Ex.
- 3×σ/s(σ: 반응의 표준편차, s: 표준검량선의 기울기), 정량한계는 10×σ/s 식을 이용하여 계산하였다. 정밀성은 일내시험(intraday test)과 일간시험(inter-day test)으로 나누어 실험하였다. 일내시험은 하룻 동안 6회의 추출 및 분석을 반복 측정한 결과이며, 일간시험은 6일 동안 하루에 3회의 추출 및 분석을 반복하여 얻은 결과의 상대표준편차(Relative Standard Deviation: RSD)를 측정하여 평가하였다.
- 56%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 확인하였다. 정확성은 일정량(1.0, 2.0 및 3.0 mg)의표준물질을 시료에 첨가한 후 추출 및 분석과정에서 회수되는 양을 확인하여 회수율이 90~110% 범위, RSD가 5% 이하를 만족하는지를 평가하였다(KFDA 2004). GABA의 회수율은 98.
- 일내시험은 하룻 동안 6회의 추출 및 분석을 반복 측정한 결과이며, 일간시험은 6일 동안 하루에 3회의 추출 및 분석을 반복하여 얻은 결과의 상대표준편차(Relative Standard Deviation: RSD)를 측정하여 평가하였다. 정확성은 회수율(re- covery) 시험을 통하여 확인하였고, GABA 표준용액은 1.0, 2.0 및 3.0 mg/mL의 농도로 준비하여 사용하였다. 각각의 GABA 표준용액 1 mL를 추출 전 시료에 첨가하고, GABA 추출 과정에 따라 추출한 뒤 유도체화 및 HPLC 분석을 통하여 얻은 각각의 농도의 비를 이용하여 아래의 공식에 의해서 회수율을 계산하였다.
- 직선성은 GABA 표준용액을 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 μg/mL의 농도로 제조한 후 유도체화 시켜 HPLC로 7회(1회/1일) 반복 분석하여 표준용액의 피크 면적과 농도를 변수로 작성한 검량선의 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
- GABA에 대한 분석법은 의약품 등 분석법의 밸리데이션(validation)에 대한 가이드라인(KFDA 2004)을 근거로 특이성(specificity), 직선성(linearity), 검출한계(Limit of Detection:LOD), 정량한계(Limit of Quantitation: LOQ), 정밀성(precision) 및 정확성(accuracy) 평가를 통해 검증하였다. 특이성은 GABA 표준용액과 여주추출물을 유도체화 시킨 후 HPLC로 분석하여 크로마토그램상의 머무름 시간(retention time)을 비교하여 확인하였다. 직선성은 GABA 표준용액을 1.
- GABA에 대한 분석법의 유효성은 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 통해 검증하였다. 특이성은 불순물, 분해물, 배합성분 등 여러 가지 다른 성분들이 혼합되어 있는 추출물 중 목표성분만을 선택적으로 정성 및 정량 분석할 수 있는지를 확인하기 위한 것으로, GABA 표준용액과 여주추출물 중 GABA의 머무름 시간을 비교하여 평가하였다(KFDA 2004). 표준용액과 여주추출물에서 GABA의 머무름 시간은 각각 29.
대상 데이터
- 250nm, Em. 395 nm로 분석하였다.
- 여주는 공급받은 즉시 세절한 후 동결건조 및 분쇄하여 －70℃에서 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. GABA는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, AccQ FluorTM reagent kit(WAT052880), AccQTag Eluent A(WAT052890) 및 AccQ-Tag Eluent B(WAT097953)는 Waters(Milford, MA, USA)에서 구입하였고, 그 밖의 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.
- 본 연구에서는 재배지역별, 수확시기별 및 숙기별 여주의 γ-aminobutyric acid(GABA) 함량을 분석하기 위해 재배지역별 여주는 경기, 강원, 충북, 충남, 전북, 전남 및 경남의 생산지 16곳에서 2015년 8월에 수확한 여주를 공급받아 시료로 사용하였다.
- 본 연구에서는 재배지역별, 수확시기별 및 숙기별 여주의 γ-aminobutyric acid(GABA) 함량을 분석하기 위해 재배지역별 여주는 경기, 강원, 충북, 충남, 전북, 전남 및 경남의 생산지 16곳에서 2015년 8월에 수확한 여주를 공급받아 시료로 사용하였다. 수확시기별 여주는 생산량이 많아 예비실험결과, GABA 함량이 평균 수준을 보인 경북 함양의 생산지에서 5~9월에 수확한 여주를 시료로 사용하였으며, 숙기별 여주는 같은 생산지에서 수정 후 5~35일차에 수확한 여주를 제공받아 시료로 사용하였다. 여주는 공급받은 즉시 세절한 후 동결건조 및 분쇄하여 －70℃에서 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- GABA에 대한 분석법은 의약품 등 분석법의 밸리데이션(validation)에 대한 가이드라인(KFDA 2004)을 근거로 특이성(specificity), 직선성(linearity), 검출한계(Limit of Detection:LOD), 정량한계(Limit of Quantitation: LOQ), 정밀성(precision) 및 정확성(accuracy) 평가를 통해 검증하였다. 특이성은 GABA 표준용액과 여주추출물을 유도체화 시킨 후 HPLC로 분석하여 크로마토그램상의 머무름 시간(retention time)을 비교하여 확인하였다.
- 또한 분석물의 GABA에 대한 검출 및 정량이 가능한 최저 농도를 확인하기 위한 검출한계는 3.3×σ/s(σ: 반응의 표준편차, s: 표준검량선의 기울기), 정량한계는 10×σ/s 식을 이용하여 계산하였다.
- 정밀성은 일내시험(intraday test)과 일간시험(inter-day test)으로 나누어 실험하였다. 일내시험은 하룻 동안 6회의 추출 및 분석을 반복 측정한 결과이며, 일간시험은 6일 동안 하루에 3회의 추출 및 분석을 반복하여 얻은 결과의 상대표준편차(Relative Standard Deviation: RSD)를 측정하여 평가하였다. 정확성은 회수율(re- covery) 시험을 통하여 확인하였고, GABA 표준용액은 1.
- 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고, 처리 간의 유의적인 차이 유무를 One-way ANOVA로 분석한 후 유의수준 5%에서 Duncan’s multiple range test로 측정군 간의 차이를 분석하였다(p=0.05).
이론/모형
- 분석을 위한 유도체화는 Water사의 AccQ FluorTM reagent kit를 이용한 Tomita 등(2014)의 방법으로 진행하였다. 즉, 6-aminoquinolyl-n-hydroxysuccinimidyl carbamate(Vial 2A)에 acetonitrile(Vial 2B) 1 mL를 가하여 잘 용해시켜 반응시약을 준비하였다.
성능/효과
- 5월에 수확한 여주의 GABA 함량이 1.56 mg/g으로 가장 높았으며, 정식 및 수확시기가 늦어질수록 GABA 함량은 감소하여 9월에 수확한 여주의 GABA 함량은 0.86 mg/g으로 나타났다(p<0.05).
- GABA 분석법을 검증하기 위해 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 확인하였고, 그 결과 직선성의 상관계수 값은 0.9999, 검출한계는 0.29 μg/mL, 정량한계는 0.87 μg/mL, 정밀성의 상대표준편차는 일내시험에서는 3.53%, 일간시험에서는 2.56%이었고, 정확성은 98.77~100.50%로 95% 이상의 높은 회수율과 2% 이하의 상대표준편차를 보였다.
- 일내시험은 하룻 동안 6회의 추출 및 분석을 반복 측정한 결과이며, 일간시험은 6일 동안 하루에 3회의 추출 및 분석을 반복하여 얻은 결과의 RSD 측정하여 Table 1에 나타내었다. GABA 표준물질에 대한 일내와 일간 분석 모두 RSD가 각각 3.53%와 2.56%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 확인하였다. 정확성은 일정량(1.
- 0 mg)의표준물질을 시료에 첨가한 후 추출 및 분석과정에서 회수되는 양을 확인하여 회수율이 90~110% 범위, RSD가 5% 이하를 만족하는지를 평가하였다(KFDA 2004). GABA의 회수율은 98.77~100.50% 범위였으며, RSD는 0.70~1.65%로 나타났다(Table 1). 발아 유색미의 GABA 함량을 정량하기 위하여 AQC로 유도체화 시킨 GABA의 분석법을 HPLC-FLD 시스템으로 확립한 Ahn 등(2010)의 연구에서 직선성의 상관계수 0.
- 05). 또한 경남 함양의 생산지에서 수정 후 5~35일차에 수확한 여주의 GABA 함량은 Fig. 5와 같이 수정 후 5일에 1.69 mg/g에서 숙기가 증가함에 따라 감소하여 30일과 35일에는 각각 0.36 mg/g과 0.38 mg/g으로 나타났다. 식물체 내에서 GABA 함량은 외부 스트레스 요인에 의해 변화하며, 이를 증명하기 위한 연구가 많이 진행되었다.
- 또한 반응의 표준편차와 표준검량선의 기울기로 나타낸 검출한계와 정량한계는 각각 0.29 μg/mL와 0.87 μg/mL로 나타났다(Table 1).
- 86 mg/g까지 점차 감소하는 경향을 보였다. 또한 숙기별 GABA의 함량은 성장 초기의 1.69 mg/g에서 숙기 35일차의 0.36~0.38 mg/g까지 감소하였다. 이처럼 여주의 GABA 함량은 지역별 생육환경에 따라 재배 시기별, 숙기별에 따라 함량 차이가 나타났으며, 기능성 식품원료의 개발과 추후 연구의 기초자료로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 39 mg/g으로 나타났다. 수확시기별 여주의 GABA의 함량은 수확 초기 5월의 1.56mg/g에서 9월의 0.86 mg/g까지 점차 감소하는 경향을 보였다. 또한 숙기별 GABA의 함량은 성장 초기의 1.
- 재배지역별로 GABA를 분석한 결과, 0.51~1.88 mg/g으로 함량 차이가 높았으며, 평균 함량은 0.93±0.39 mg/g으로 나타났다.
- 지역별 GABA 함량은 0.51~1.88 mg/g 범위로 함량 차이가 많이 나타났으며, 평균값은 0.93±0.39 mg/g이었다.
- 추출물 중 일정 농도 범위에 있는 GABA 함량에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는지를 평가하기 위하여 농도별(1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 μg/mL) GABA 표준용액의 직선성을 평가한 결과, 상관계수(correlation coefficient, R2)가0.9999로 높은 직선성을 보였다(Fig. 2).
- 충북 청주산 여주가 1.88 mg/g으로 가장 높은 GABA 함량을 보였으며, 고성, 해남, 강진 및 함양산 여주가 1.00 mg/g 이상의 함량을 보였다(p<0.05).
후속연구
- 이처럼 GABA는 기계적인 자극, 온도, 산소결핍, 수분, 발아 등의 요인에 의해 생성 및 분해가 조절되는데, 일반적으로 GAD에 의해 L-glutamate로부터 합성되며, GABA transaminase에 의해 succinic semialdehyde를 거쳐 최종적으로 succinic semialdehyde dehydrogenase에 의해 succinate로 분해되는 과정을 거치는 것으로 보고되었다(Shimajiri 등 2013). 그러나 식물체 특히 여주의 경우, 생육과정에서 GABA의 합성 및 분해에 관여하는 효소들에 대한 활성 평가 및 그 대사체들에 대한 변화 연구가 미흡하기 때문에 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.
- 38 mg/g까지 감소하였다. 이처럼 여주의 GABA 함량은 지역별 생육환경에 따라 재배 시기별, 숙기별에 따라 함량 차이가 나타났으며, 기능성 식품원료의 개발과 추후 연구의 기초자료로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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