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문제 정의
- 꿀벌 질병에 대한 유병률을 파악하는 것은 중요하다. 이는 양봉농가의 생산성과 직결되고, 식물 생태계를 유지하는데 중요하기 때문인데, 양봉에 대한 관심은 높은 반면, 봉군에 대한 전반적인 건강상태 모니터링이 부족한 실정이어서 본 연구를 실시하였다.
- 양봉산업의 특성상 개화기에 따라 이동하는 경우가 많아, 채밀기에 여러 지역을 이동한 농가들로부터 꿀벌 질병의 관내 유입이 우려된다. 현재 광주에 양봉농가를 대상으로 꿀벌질병에 대한 연구가 부족하여, 관내 양봉농가의 꿀벌질병 원인체 보유현황을 조사하여 꿀벌 질병을 효과적으로 방제하기 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
- 꿀벌 질병 원인체 14종 질병에 대하여 각각의 병원체 특이 primer 16개(낭충봉아부패병에 대한 primer 3 종류 및 나머지 13종 질병에 대한 primer 각 1종류)를 다음과 같이 제작하였다(Table 2).
- 꿀벌질병 병원체 특이 프라이머를 이용한 유전자 증폭은 Maxime Premix PCR과 Maxime Premix RT-PCR 2X Taq PCR Smart mix 1 (Solgent, Korea)로 2X Taq PCR Smart mix 25 μL, 프라이머(10 pmol/μL) 각 2 μL씩, Template DNA 혹은 RNA를 5 μL를 혼합하고 DW를 16 μL 첨가하여 총량이 50 μL가 되도록 하였다.
- 두 번째 킷트로는 서양형 낭충봉아부패병바이러스, 한국형 낭충봉아부 패병바이러스, 날개불구병바이러스, 여왕벌흑색병바이러스를 검사하였고, 세 번째 킷트는 유럽형 부저병, 노제마병, 백묵병, 석고병을 검사하였다. 네 번째 킷트로는 미국형 부저병, 꿀벌기생파리 및 기문응애를 검사하였다. 검사방법 및 결과판정은 제조사의 지시에 따랐다.
- 첫 번째 킷트로 급성꿀벌마비증바이러스, 만성꿀벌마비증바이러스, 케시미어병바이러스, 이스라엘급성 꿀벌마비증바이러스를 검사하였다. 두 번째 킷트로는 서양형 낭충봉아부패병바이러스, 한국형 낭충봉아부 패병바이러스, 날개불구병바이러스, 여왕벌흑색병바이러스를 검사하였고, 세 번째 킷트는 유럽형 부저병, 노제마병, 백묵병, 석고병을 검사하였다. 네 번째 킷트로는 미국형 부저병, 꿀벌기생파리 및 기문응애를 검사하였다.
- 다양한 장소를 이동하지만 이들 농가들을 대상으로 한 꿀벌 질병 연구는 현재까지 연구된 바가 없었다. 따라서 본 연구는 광주광역시 내 양봉농가에 대한 2016년 11월부터 2017년 8월까지 광주광역시 내 33농가를 대상으로 각 계절별로 적어도 1회 이상 성충 및 소비 시료를 총 89건 채취하여 PCR, RT-PCR 및 real time PCR 검사를 실시하였다. PCR, RT-PCR 결과 추이를 분석한 결과 광주광역시에서 가장 유병률이 높은 질병은 석고병(76.
- 바이러스 질병에 대한 RT-PCR 조건은 cDNA 합성 50°C, 30 min, predenaturation 95°C, 15 min으로 1 cycle 진행 후 denaturation 94°C, 30 s, annealing 52∼ 57°C, 30 s, extention 72°C, 60 s, 40 cycle, final extention 72°C, 10 min, 1 cycle 조건으로 실험하였으며, 다른 7가지 질병에 대한 PCR 조건은 predenaturation 94°C, 5 min, 1 cycle, denaturation 94°C, 30 s, annealing 45∼55°C, 30 s, extention 72°C, 60 s, 40 cycle, final extention 72°C, 10 min, 1 cycle의 조건으로 실험하였다.
- 증폭된 산물을 확인하기 위하여 PCR 증폭액 8 μL를 SYBRⓡ Green nucleic acid gel stain 10,000x (sigma aldrich, USA)를 첨가한 1.5% agarose gel에서 100V, 30분간 전기영동을 한 후 Image Quant LAS 4000 (Fugifilm, Japan)을 사용하여 특이 유전자 증폭 산물을 확인하였다.
- 채취한 시료는 약 0.2 g으로 멸균 PBS를 사용하여 균질화 유제를 만들고, 그 상층액 150 μL에서 Viral Gene-spinTM viral DNA/RNA Extraction kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 RNA 및 DNA를 분리하였다.
- 채취한 시료를 대상으로 real time PCR 검사를 진행하였다. 사용한 Kit는 농림축산검역본부에서 배정된 14종 꿀벌질병 검출 Kit 4종류이며 명칭은 다음과 같다.
- 첫 번째 킷트로 급성꿀벌마비증바이러스, 만성꿀벌마비증바이러스, 케시미어병바이러스, 이스라엘급성 꿀벌마비증바이러스를 검사하였다. 두 번째 킷트로는 서양형 낭충봉아부패병바이러스, 한국형 낭충봉아부 패병바이러스, 날개불구병바이러스, 여왕벌흑색병바이러스를 검사하였고, 세 번째 킷트는 유럽형 부저병, 노제마병, 백묵병, 석고병을 검사하였다.
대상 데이터
- 2016년 11월부터 2017년 8월까지 광주광역시 양봉 농가 33호를 대상으로 계절별로 적어도 1회 이상 시료를 채취하였다. 총 84회 방문하여 89건의 꿀벌 성충 20여마리 및 소비 일부를 채취하였으며 채취시기 및 채취건수는 Table 1과 같다.
- 2017년 당시 광주광역시 꿀벌 사육 농가는 236농가로 추정되며, 본 연구는 지역별로 고르게 농가를 선정하여, 약 13.9%에 해당하는 33호에 대해 꿀벌 질병 검사를 수행하였다.
- 채취한 시료를 대상으로 real time PCR 검사를 진행하였다. 사용한 Kit는 농림축산검역본부에서 배정된 14종 꿀벌질병 검출 Kit 4종류이며 명칭은 다음과 같다. 첫 번째 킷트는 ABPV/KBV/IAPV/CBPV Real time (LiliF, Korea)이며, 두 번째는 SBV/KSBV/DWV/ BQCV Real-time RT-PCR Detection Kit (LiliF, Korea)이다.
- 5% agarose gel에서 100V, 30분간 전기영동을 한 후 Image Quant LAS 4000 (Fugifilm, Japan)을 사용하여 특이 유전자 증폭 산물을 확인하였다. 증폭된 DNA 산물의 크기 비교는 100 bp DNA ladder (iNtRON, Korea)를 사용하였다.
- 2016년 11월부터 2017년 8월까지 광주광역시 양봉 농가 33호를 대상으로 계절별로 적어도 1회 이상 시료를 채취하였다. 총 84회 방문하여 89건의 꿀벌 성충 20여마리 및 소비 일부를 채취하였으며 채취시기 및 채취건수는 Table 1과 같다. 채취한 시료는 50 ml cornical tube에 수집 후 4°C 상태로 운반하였다.
이론/모형
- 네 번째 킷트로는 미국형 부저병, 꿀벌기생파리 및 기문응애를 검사하였다. 검사방법 및 결과판정은 제조사의 지시에 따랐다.
성능/효과
- RT-PCR 검사결과 18.0%였으나, real time PCR 검사 결과 0%로 확인되는데, 기존의 conventional RT-PCR 의 KBV primer가 KBV와 IAPV가 동시에 진단되었음을 고려하였을 때, real-time PCR로 검사시 KBV는 0%였던 반면 IAPV는 3.4%로 조사되었다.
- 2017년 2월에 채취한 26건 검사결과 노제마병 23.1%, 석고병 19.2%, 날개불구병 15.4%, 미국형 부저병 및 서양형 낭충봉아부패병 각 3.8%로 나타났으며 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다.
- 2017년 2월에 채취한 26건을 기준으로, 미국부저병 11.5%, 기문응애 3.8%, 노제마병 23.1%, 석고병 73.1%, 중국형 낭충봉아부패병 3.8%, 날개불구병 42.3%, 케시미어병 11.5%, 이스라엘급성꿀벌마비증 15.4%로 조사되었고 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다.
- 2017년 5월에 채취한 22건 검사결과 여왕벌흑색병 68.2%, 석고병 59.1%, 노제마병 40.9%, 백묵병, 날개불구병 및 서양형 낭충봉아부패병이 각 18.2%, 미국형 부저병, 만성꿀벌마비증, 이스라엘급성꿀벌마비증이 각 4.5%이며 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다.
- 2017년 5월에 채취한 22건을 검사한 결과 미국부저병 13.6%, 유럽 부저병 4.5%, 기문응애 4.5%, 노제마병 36.4%, 백묵병 18.2%, 석고병 100.0%, 서양형 낭충봉아부패병 18.2%, 중국형 낭충봉아부패병 4.5%, 날개불구병 13.6%, 여왕벌흑색병 59.1%, 케시미어병 22.7%, 이스라엘급성꿀벌마비증 13.6%이며 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다.
- 2017년 8월에 채취한 21건을 검사한 결과 미국부저병 33.3%, 기문응애 4.8%, 노제마병 33.3%, 석고병 71.4%, 날개불구병 81.0%, 케시미어병 9.5%, 이스라엘급성꿀벌마비증이 4.8%로 조사되었으며 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다(Table 3).
- 3%)이며 2017년 5월은 다른 계절과는 질병 검출 양상이 차이를 보였다. 5월에 검사한 모든 시료에서 석고병 원인체가 검출되었고, 또한 타 계절에서 적게 검출되었던 여왕벌흑색병 원인체가 석고병 다음으로 59.1% 검출되었다. 다른 계절에 많이 검출된 날개불구병 원인체는 5월에만 13.
- 89건의 시료를 PCR 및 RT-PCR로 검사한 결과 석고병 원인체가 68건(76.4%) 확인되었으며, 날개불구병 46건(51.7%), 노제마병 24건(27.0%), 케시미어병 및 이스라엘 급성 꿀벌마비증 각각 16건(18.0%), 여왕벌흑색병 15건(16.9%), 미국형 부저병 14건(15.7%), 기문응애 7건(7.9%), 백묵병 6건(6.7%), 서양형 낭충봉아부패병 4건(4.5%), 중국형 낭충봉아부패병 2건(2.2%), 꿀벌기생파리 및 유럽형부저병 각 1건(1.1%)이고 급성꿀벌마비증, 만성꿀벌마비증 및 한국형 낭충봉아부패병 원인체는 검출되지 않았다(Table 3).
- 89건의 시료를 real time PCR 방법으로 검사한 결과 석고병 37건(41.6%), 날개불구병 26건(29.2%), 노제마병 23건(25.8%), 여왕벌흑색병 18건(20.2%), 백묵병 8건(9.0%), 미국부저병 및 서양벌 낭충봉아부패병 각 5건(5.6%), 이스라엘급성꿀벌마비증 3건(3.4%), 만성꿀벌마비증 1건(1.1%)이고나머지 질병은 검출되지 않았다(Table 4).
- BQCV의 경우 2009년 전국적으로 13.4%, 2013년에 경북 동부지역의 감염률은 BQCV 12.5% (Yoo와 Yoon, 2009; Ouh 등, 2013), 2014년 대전(Kim 등, 2016) 0%, 광주광역시 RT-PCR 결과 16.9%, real time PCR 20.2%, kappa index가 0.6 이상으로 상호 검사간 결과를 신뢰할 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다.
- 따라서 본 연구는 광주광역시 내 양봉농가에 대한 2016년 11월부터 2017년 8월까지 광주광역시 내 33농가를 대상으로 각 계절별로 적어도 1회 이상 성충 및 소비 시료를 총 89건 채취하여 PCR, RT-PCR 및 real time PCR 검사를 실시하였다. PCR, RT-PCR 결과 추이를 분석한 결과 광주광역시에서 가장 유병률이 높은 질병은 석고병(76.4%)으로 조사되었으며, 그 뒤로 날개불구병(51.7%), 노제마병(27.0%) 순이었다. 또한 조사한 33농가 중 28농가(84.
- 8%에서 2종류 이상의 꿀벌질병 원인체가 검출되어 많은 차이를 보였다. real time PCR 결과는 78.8% 로 확인되었다.
- 0%) 순이었다. 또한 조사한 33농가 중 28농가(84.8%)에서 2종류 이상의 질병원인체가 복합적으로 검출되었다. 또한, 계절과 질병 원인체간 상관관계를 조사한 결과 계절에 관계없이 거의 모든 시기에서 날개불구병 및 석고병 원인체가 높은 비율로 검출되었으며, 2017년 5월에는 날개불구병이 상대적으로 낮게 검출되고, 여왕벌흑색병 원인체가 높은 비율로 검출되었다는 점이 특징적이다.
- 8%)에서 2종류 이상의 질병원인체가 복합적으로 검출되었다. 또한, 계절과 질병 원인체간 상관관계를 조사한 결과 계절에 관계없이 거의 모든 시기에서 날개불구병 및 석고병 원인체가 높은 비율로 검출되었으며, 2017년 5월에는 날개불구병이 상대적으로 낮게 검출되고, 여왕벌흑색병 원인체가 높은 비율로 검출되었다는 점이 특징적이다. 정확한 질병진단을 통해 무분별한 약물 남용을 막고, 각 질병에 대한 유병률을 수시로 모니터링하여 효과적인 꿀벌 질병에 대한 방역대책을 수립하는 데 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 마지막으로 2017년 8월에 채취한 21건을 검사한 결과 석고병 71.4%, 날개불구병 42.9%, 노제마병 28.6%, 미국형 부저병 14.3%, 여왕벌흑색병 및 이스라엘급성꿀벌마비증이 각 9.5%로 조사되었으며 나머지 질병에 대한 원인체는 검출되지 않았다(Table 4).
- 원인체가 복합적으로 검출된 농가는 질병이 전혀 검출되지 않은 농가는 5호(15.2%)였으며, 1종류 검출 농가는 2호(6.1%), 2종류 검출농가 6호(18.2%), 3종류 검출농가 5호(15.2%), 4종류 검출농가 8호(24.2%), 5종류 검출농가 5호(15.2%), 6종류 검출농가 1호(3.0%), 7종류 검출농가 1호(3.0%)로 조사되었다(Fig. 2).
- 원인체의 복합검출 정도를 비교해보면 대전의 경우 15.9%에서 2종류 이상의 원인체가 검출된 반면 광주는 PCR 및 RT-PCR 검사 결과 대상농가 중 84.8%에서 2종류 이상의 꿀벌질병 원인체가 검출되어 많은 차이를 보였다. real time PCR 결과는 78.
- 이번 광주는 PCR 결과 76.4%, real time PCR 결과 41.6%이며 조사된 질병중 가장 유병률이 높은 것으로 조사되었다.
- 2% (Yoo와 Yoon, 2009;Ouh 등, 2013), 2014년 대전(Kim 등, 2016)의 경우 원인체가 검출되지 않았다. 이에 반해 광주의 경우 이번 연구에서 RT-PCR 검사 결과 51.7%, real time PCR 검사결과 29.2%의 비율로 원인체가 검출되었다. 타지역과 비교시 유병률이 높은 것을 알 수 있었는데 추가적인 역학조사를 통하여 광주 지역의 DWV에 대해 높은 유병률을 보이는 것에 대한 연구가 필요할 것이다.
- 조사된 33농가를 대상으로 꿀벌 질병 원인체의 복합검출 정도를 살펴보면 질병이 전혀 검출되지 않은 농가는 1호(3.0%)였으며, 1종류 검출농가 4호(12.1%), 2종류 검출농가 3호(9.1%), 3종류 검출농가 5호(15.2%), 4종류 검출농가 4호(12.1%), 5종류 검출농가 5호(15.2%), 6종류 검출농가 5호(15.2%), 7종류 검출 농가 6호(18.2%)로 대부분의 농가에서 사육하는 꿀벌은 2종류 이상의 질병이 복합적으로 검출되었다(Fig. 1).
- 중국형 낭충봉아부패병의 경우 real time PCR 킷트 내에 별도의 상용화된 primer가 제조되지 않아서 결과비교 대상에 포함되지 않았다. 총 15개의 primer에 석고병을 제외한 다른 13종의 질병에서는 82.0% 이상의 정확도를 보였으나 석고병의 경우 두 검사방법에 대한 정확도가 58.4%로 상대적으로 낮았다. Kappa index를 비교한 결과 서양형 낭충봉아부패병, 여왕벌흑색병, 노제마병에서 0.
후속연구
- 또한, 계절과 질병 원인체간 상관관계를 조사한 결과 계절에 관계없이 거의 모든 시기에서 날개불구병 및 석고병 원인체가 높은 비율로 검출되었으며, 2017년 5월에는 날개불구병이 상대적으로 낮게 검출되고, 여왕벌흑색병 원인체가 높은 비율로 검출되었다는 점이 특징적이다. 정확한 질병진단을 통해 무분별한 약물 남용을 막고, 각 질병에 대한 유병률을 수시로 모니터링하여 효과적인 꿀벌 질병에 대한 방역대책을 수립하는 데 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 2%의 비율로 원인체가 검출되었다. 타지역과 비교시 유병률이 높은 것을 알 수 있었는데 추가적인 역학조사를 통하여 광주 지역의 DWV에 대해 높은 유병률을 보이는 것에 대한 연구가 필요할 것이다.
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