[논문]트립신 처리에 따른 적송잎 추출물의 항산화 활성 및 항균 효과

문기은; 박교현; 이범주; 김배환

doi:10.5668/jehs.2018.44.3.293

트립신 처리에 따른 적송잎 추출물의 항산화 활성 및 항균 효과
Antioxidant and Antimicrobial Activities of Trypsin-treated Pinus densiflora Ethanol Extract 원문보기

韓國環境保健學會誌 = Journal of environmental health sciences, v.44 no.3, 2018년, pp.293 - 300

문기은 (계명대학교 자연과학대학 공중보건학과) , 박교현 (계명대학교 자연과학대학 공중보건학과) , 이범주 ((주)케미랜드) , 김배환 (계명대학교 자연과학대학 공중보건학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: We investigated the antioxidant and antibacterial activities of Pinus densiflora ethanol extracts (PDEE) treated with trypsine as a protease. Methods: Various antioxidant activities were evaluated by measuring total contents of polyphenol and flavonoid, DPPH electron-donating ability and $ABTS^+$ radical scavenging activity of test material. To compare the antibacterial activity, paper disc diffusion assay was performed against two resident bacteria in human skin (Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis). Results: As for the total contents of polyphenol and flavonoid, and the electron-donating ability and ABTS+ radical scavenging activity, both PDEE and trypsin-treated Pinus densiflora ethanol extract (T-PDEE) showed high antioxidant activity in dose-dependent manner. And the T-PDEE showed slightly higher activity than PDEE, which indicated protease treatment seemed to affect in antioxidant activity. In the result of paper disc diffusion assay, antibacterial activity was confirmed in all two types of skin resident bacteria. T-PDEE was more active than PDEE and it seems that treatment of protease may increase the antibacterial activity of PDEE. Conclusion: All of these results, we confirmed that treatment of protease to PDEE can increase the antioxidant and antibacterial activities, and it can be explained thought that this would be applicable as a cosmeceutical material in the future.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. List of bacteria for antibacterial activity test
그림 Fig. 1. Electron-donating ability of PDEE and T-PDEE.
표 Table 2. Yields of PDEE and T-PDEE
표 Table 3. Total polyphenol and flavonoid contents of PDEE and T-PDEE
그림 Fig. 2. ABTS⁺ radical scavenging activity of PDEE and T-PDEE.
그림 Fig. 3. Antimicrobial activities of PDEE and T-PDEE against S. aureus and S. epidermidis.
표 Table 4. Size of clear zone against S. aureus and S. epidermidis by extracts

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 단백질 분해효소인 trypsin이 적송잎 에탄올 추출물(Pinus densiflora ethanol extract, PDEE)의 항산화 및 항균활성 증가에 미치는 영향을 확인하여 다양한 산업분야에서 응용가능성을 제시하고자 하였다.
본 연구는 적송잎 에탄올 추출물(Pinus densiflora ethanol extract, PDEE)과 단백질 분해효소인 trypsin을 처리한 적송잎 에탄올 추출물(Trypsin-treated Pinus densiflora ethanol extract, T-PDEE)의 항산화 및 항균활성을 비교하여 활용가능성을 확인하고자 하였다.
새로운 효능 물질을 탐색하는 것도 좋지만, 이미 효능이 검증 된 물질에 공정을 추가하여 그 효능을 극대화 시킨다면 좀 더 효율적으로 기능성 원료를 개발할 수 있을 것으로 예상되어진다. 이에 본 연구는 단백질 분해효소인 trypsin이 적송잎 에탄올 추출물(Pinus densiflora ethanol extract, PDEE)의 항산화 및 항균활성 증가에 미치는 영향을 확인하여 그 응용가능성을 제시하고자 하였다.

제안 방법

²³⁾ 하지만 현재 알려져 있는 보존제로 응용이 가능한 천연원료는 좁은 항균 스펙트럼과 사용범위의 한계로 인해 사용에 제한이 있다.²⁴⁾ 그러므로 천연보존제로서 적송잎 추출물의 활용 가능성을 확인하고 trypsin처리에 따른 활성도 증대를 비교하기 위해 paper disk diffusion assay를 통해 2가지 피부상재균에 대한 항균 활성을 비교하였다. 그 결과 모든 균에서 항균 활성이 나타났으며, 모든 피부상재균에서 T-PDEE가 PDEE 보다 항균 활성이 더 높게 나타나 항산화능과 마찬가지로 단백질 분해효소인 trypsin의 처리가 항균 활성에 도움을 주는 것으로 보인다.
Dish를 뒤집어 37℃ incubator에서 24시간 배양시켰다. 그 후 paper disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하여 항균 활성을 비교하였다.
실험물질은 1,000 μg/mL에서 5개의 농도로 희석하여 시료 용액 100 μL와 ABTS+ 용액 100 μL를 혼합하여 7분 동안 암실에 반응시키고 spectrophotometer를 이용하여 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
적송잎 에탄올 추출물은 시료 중량대비 10배의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 동안 교반하여 상등액과 침전물을 분리한 후 여과 및 농축을 진행하여 얻었다. 적송잎 에탄올 추출물에 trypsin을 처리하기 위해 trypsin을 적송잎 원물 중량대비 5%의 양으로 실온에서 15분간 처치하였다. 이후 80℃에서 1시간 동안 가열하여 trypsin을 불활성화 하였다.
전자공여능을 평가하는 DPPH assay와 radical 소거능을 평가하는 ABTS+ assay를 통해 실험물질의 항산화능을 평가하였다.
직경 8 mm의 멸균된 paper disc (ADVANTEC, Japan)를 균액이 도말된 한천배지에 올려두고 음성대조군인 증류수와 농도별로 희석된 실험물질을 20 μL씩 흡수시켰다.

대상 데이터

Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. Nutrient agar, nutrient broth, tryptic soy agar 및 tryptic soy broth 등의 배지는 Difco Lab (Sparks, USA)의 제품을 사용하였다. 그 외의 일반 시약들은 특급품을 사용하였다.
본 연구에서 사용된 시료는 강원도 삼척시에서 자생하는 금강송에서 채취한 적송(Pinus densiflora Siebold & Zucc.)잎을 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, diethylene glycol, tannic acid, quercetin, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bisdiammonium salt (ABTS) 등의 시약은 SigmaAldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
실험에 사용된 실험기기는 spectrophotometer(Epoch, Bio Tek, USA), 전자저울(XT220A, Precisa, Swiss), clean bench (DBB-922, Daeil, Korea), incubator (MIR-162, SANYO, Japan)이고 그 외 기기들은 실험실에서 사용하는 일반기기를 이용하였다.
항균 효능 평가에 사용된 피부상재균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 제공받아 37℃의 조건에서 Table 1과 같이 배양하였다. Staphylococcus aureus (S.

데이터처리

본 실험의 결과는 반복 수행결과의 평균값과 표준편차로 나타내었으며, SPSS 21.0 for windows (SPSS Inc., USA) 통계프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)으로 실시하였다. 분석결과 검증을 위하여 Duncan’s multiple range test를 이용하였으며, 통계학적인 유의성 검증은 p<0.
분석결과 검증을 위하여 Duncan’s multiple range test를 이용하였으며, 통계학적인 유의성 검증은 p<0.05의 수준으로 하였다.

이론/모형

실험물질의 ABTS⁺ free radical 소거능은 Re 등 방법(1999)¹⁹⁾에 의거하여 ABTS⁺ radical cation decolorization assay로 측정하였다. 7 mM 2,2-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt와 2.
실험물질의 전자공여능(electron-donating ability, EDA)은 Blois법(1958)¹⁸⁾에 의거하여 측정하였다. 실험물질은 1,000 μg/mL에서 5개의 농도로 희석하여 시료 용액 100 μL에 0.
실험물질의 총 폴리페놀 함량은 Folin and Denis법(1912)¹⁶⁾에 의거하여 측정하였다. 실험물질은 200μg/mL의 농도로 제조하여 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent와 동량 혼합 후 증류수 7.
실험물질의 총 플라보노이드 함량은 Davies 등 방법(1980)¹⁷⁾에 의거하여 측정하였다. 실험물질은 200μg/mL의 농도로 제조하여 시료 용액 200 μL에 diethylene glycol 2 mL을 균질하게 혼합하여 5분간 방치하였다.
실험물질의 항균 활성은 paper disc diffusion assay를 이용하여 측정하였다. 1×10⁷ CFU/mL로 조절된 균액을 한천배지에 100 μL씩 균일하게 도말하였다.

성능/효과

1000μg/mL 농도에서 PDEE는 96.4±0.2%, T-PDEE는 96.6±0.6%로 나타나 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid의 전자공여능과 비슷한 활성이 나타나 항산화 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
9) 소나무잎의 주요성분은 quercetin, kaempferol 등의 flavonoid류, α-oinene, β-pinene, camphene 등의 정유 성분 및 수지, 당류, 카로틴, 비타민 C 등이 있다.
DPPH assay와 ABTS+ assay결과 모두 250 μg/mL 이상의 농도에서 trypsin의 처치 여부와 상관없이 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid와 유사한 활성을 나타냈으며, 이것은 적송 자체의 높은 항산화능을 확인할 수 있는 결과라고 할 수 있다.
PDEE와 T-PDEE의 수율은 Table 2와 같다. PDEE와 T-PDEE의 수율은 4.2%, 14.8%로 trypsin에 의해 수율이 약 3배 이상 증가되었다.
PDEE와 T-PDEE의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 PDEE에서 73.3 mg/g, T-PDEE에서 100.0 mg/g으로 나타나 trypsin을 처리한 것이 더 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과에서도 PDEE에서 30.
radical 소거능 또한 처치 전 적송잎 에탄올 추출물보다 높은 수치를 보여 trypsin의 처리는 항산화 활성에 영향을 주는 것으로 보인다. Paper disc diffusion assay 결과 2종의 피부상재균에서 항균 활성을 확인하였으며, TPDEE가 PDEE보다 활성이 높은 것으로 보아 trypsin은 PDEE의 항균력을 증가시키는 것으로 보인다.
aureus에 대해 PDEE는 농도 의존적으로 clear zone이 증가한 반면 T-PDEE에서는 모든 농도에서 약 10mm 이상의 clear zone이 나타났다. S. epidermidis에 대한 PDEE와 T-PDEE의 항균 활성은 시료의 농도가 증가할수록 clear zone의 크기도 증가함을 알 수 있었고 T-PDEE에서 더 높은 항균 활성이 나타났다. T-PDEE가 PDEE 보다 항균 활성이 더 높게 나타나 항산화능과 마찬가지로 trypsin의 처리가 항균 활성에 영향을 주는 것으로 보여지며, T-PDEE의 항균력은 전반적으로 S.
3과 Table 4와 같다. S.aureus에 대해 PDEE는 농도 의존적으로 clear zone이 증가한 반면 T-PDEE에서는 모든 농도에서 약 10mm 이상의 clear zone이 나타났다. S.
epidermidis에 대한 PDEE와 T-PDEE의 항균 활성은 시료의 농도가 증가할수록 clear zone의 크기도 증가함을 알 수 있었고 T-PDEE에서 더 높은 항균 활성이 나타났다. T-PDEE가 PDEE 보다 항균 활성이 더 높게 나타나 항산화능과 마찬가지로 trypsin의 처리가 항균 활성에 영향을 주는 것으로 보여지며, T-PDEE의 항균력은 전반적으로 S. aureus보다 S. epidermidis에서 크게 나타났다.
²⁴⁾ 그러므로 천연보존제로서 적송잎 추출물의 활용 가능성을 확인하고 trypsin처리에 따른 활성도 증대를 비교하기 위해 paper disk diffusion assay를 통해 2가지 피부상재균에 대한 항균 활성을 비교하였다. 그 결과 모든 균에서 항균 활성이 나타났으며, 모든 피부상재균에서 T-PDEE가 PDEE 보다 항균 활성이 더 높게 나타나 항산화능과 마찬가지로 단백질 분해효소인 trypsin의 처리가 항균 활성에 도움을 주는 것으로 보인다. 특히 T-PDEE는 S.
DPPH assay와 ABTS⁺assay결과 모두 250 μg/mL 이상의 농도에서 trypsin의 처치 여부와 상관없이 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid와 유사한 활성을 나타냈으며, 이것은 적송 자체의 높은 항산화능을 확인할 수 있는 결과라고 할 수 있다. 또한 PDEE와 T-PDEE 모두 250 mg/mL 이하의 농도에서 농도 의존적으로 항산화능이 증가함을 확인하였으며, trypsin으로 인해 PDEE의 항산화 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 강승협(2015)의 연구²²⁾에서 같이 솔잎은 항산화능이 높은 물질로 확인되어졌으며, 솔잎의 일종인 적송잎 또한 본 연구를 통해 솔잎과 같이 높은 항산화능을 확인할 수 있었다.
8%로 나타났다. 또한 시료의 농도증가에 따라 radical 소거능이 증가하는 양상을 보였으며 trypsin을 처리한 T-PDEE가 더 높은 활성을 나타냈다. 이와 같은 결과에 따라 PDEE보다는 trypsin을 처리한 T-PDEE가 응용가능성이 더 높을 것으로 보인다.
4 mg/g으로 발효공정을 통해 더덕추출물의 항산화 능이 강화되었으며, 이 결과를 미루어볼 때 발효공정은 물질이 가지는 생리활성능을 상승 할 수 있는 것으로 보여진다. 본 연구에서는 단백질 분해효소인 trypsin 처리를 통해 물질이 가지는 생리활성능의 상승 정도를 확인하였으며, trypsin 처치 시 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량이 증가되었음을 확인하였다. 전자공여능을 평가하는 DPPH assay와 radical 소거능을 평가하는 ABTS⁺assay를 통해 실험물질의 항산화능을 평가하였다.
시험결과 trypsin을 처치한 적송잎 에탄올 추출물이 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 처치 전 적송잎 에탄올 추출물보다 높은 수치를 보였으며, DPPH 전자공여능, ABTS⁺ radical 소거능 또한 처치 전 적송잎 에탄올 추출물보다 높은 수치를 보여 trypsin의 처리는 항산화 활성에 영향을 주는 것으로 보인다. Paper disc diffusion assay 결과 2종의 피부상재균에서 항균 활성을 확인하였으며, TPDEE가 PDEE보다 활성이 높은 것으로 보아 trypsin은 PDEE의 항균력을 증가시키는 것으로 보인다.
강승협(2015)의 연구²²⁾에서 같이 솔잎은 항산화능이 높은 물질로 확인되어졌으며, 솔잎의 일종인 적송잎 또한 본 연구를 통해 솔잎과 같이 높은 항산화능을 확인할 수 있었다. 이러한 적송잎에 trypsin을 처리함으로서 항산화 활성이 더욱 증가하였으며, 이러한 결과는 효소처리가 적송잎의 다양한 효능을 극대화할 수 있는 가능성을 제시하는 것으로 볼 수 있다.
이상의 결과를 종합해 볼 때 단백질 분해효소인 trypsin은 적송잎 에탄올 추출물에 항산화능 및 항균효과에 영향을 미치며, trypsin을 통해 그 효능이 증진시킬 수 있을 것으로 사료되어 진다.
6 mg/g으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 모두 단백질 분해효소인 trypsin을 처리한 T-PDEE에서 더 높은 함량을 확인할 수 있었다.
PDEE와 T-PDEE의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 Table 3과 같다. 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 PDEE에서 73.7 mg/g, T-PDEE에서 100.0 mg/g으로 나타났고 총 플라보노이드 함량에서는 PDEE에서 30.0 mg/g, T-PDEE에서 67.6 mg/g으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 모두 단백질 분해효소인 trypsin을 처리한 T-PDEE에서 더 높은 함량을 확인할 수 있었다.
0 mg/g으로 나타나 trypsin을 처리한 것이 더 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과에서도 PDEE에서 30.0 mg/g, T-PDEE에서 67.6 mg/g으로 나타나 T-PDEE에서 더 높은 함량을 확인할 수 있었다. 폴리페놀 및 플라보노이드는 항산화작용을 통해 외부물질에 의해 생성된 활성산소종의 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다.

후속연구

epidermidis)는 건강한 피부에서는 pH를 유지하며 인제에 유해한 세균의 생장을 방어해주지만 과잉 생장 시 여드름을 악화시키고 피부를 감염시키는 그람양성구균이다.⁶⁾ 이러한 균은 피부 노출 시 다양한 질환을 유발할 수 있으므로 화장품과 같은 신체에 사용되는 다양한 생활용품의 사용 시 주의하여야 한다. 균의 생장을 억제하는 것을 항균력라고 하며, 항균력의 종류로는 세포벽의 합성을 저해하거나 단백질합성저해, 핵산의 합성저해 등으로 분류할 수 있다.
적송의 생리활성능에 대해서는 다양한 연구가 보고되어 있지만, 이미 보고되어 진 생리활성능을 증가시키는 연구는 아직 미비하다. 새로운 효능 물질을 탐색하는 것도 좋지만, 이미 효능이 검증 된 물질에 공정을 추가하여 그 효능을 극대화 시킨다면 좀 더 효율적으로 기능성 원료를 개발할 수 있을 것으로 예상되어진다. 이에 본 연구는 단백질 분해효소인 trypsin이 적송잎 에탄올 추출물(Pinus densiflora ethanol extract, PDEE)의 항산화 및 항균활성 증가에 미치는 영향을 확인하여 그 응용가능성을 제시하고자 하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	효소처리란 무엇인가?	최근 식품, 의약 및 화장품 산업에서 특정 성분을 강화시키고 유용성분의 추출 수율을 높여 생리활성을 향상시키기 위해 천연 원료에 효소를 처리하는 방법이 활발하게 연구되어지고 있다. 효소처리란 동물, 식물 및 미생물에서 기원한 효소를 농축, 추출, 정제 발효 등의 과정을 통해 큰 단위의 특정 성분을 작은 단위로 분해하는 방법을 의미한다.1) 권상철 등(2010)의 연구에서는2) 효소를 첨가한 황기 추출액의 수율과 생리적 기능성이 향상되었고 박민경(2011)의 연구에서는3) 단백질 분해효소 처리가 청국장의 펩타이드 생성 및 항산화 활성 증가에 효율적임을 확인할 수 있었다.
	trypsin이 적송잎 에탄올 추출물의 항산화 및 항균활성 증가에 미치는 영향을 확인하여 산업분야에 적용가능성을 분석한 결과는 어떠한가?	시험결과 trypsin을 처치한 적송잎 에탄올 추출물이 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 처치 전 적송잎 에탄올 추출물보다 높은 수치를 보였으며, DPPH 전자공여능, ABTS+ radical 소거능 또한 처치 전 적송잎 에탄올 추출물보다 높은 수치를 보여 trypsin의 처리는 항산화 활성에 영향을 주는 것으로 보인다. Paper disc diffusion assay 결과 2종의 피부상재균에서 항균 활성을 확인하였으며, TPDEE가 PDEE보다 활성이 높은 것으로 보아 trypsin은 PDEE의 항균력을 증가시키는 것으로 보인다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 단백질 분해효소인 trypsin은 적송잎 에탄올 추출물에 항산화능 및 항균효과에 영향을 미치며, trypsin을 통해 그 효능이 증진시킬 수 있을 것으로 사료되어 진다.
	trypsin은 어떤 과정을 통해 단백질을 분해하는가?	단백질에 직접 작용하여 펩티드 결합을 가수분해하는 대표적인 단백질 분해효소인 trypsin은 췌장에서 trypsinogen 형태로 만들어져 소장으로 운반되어 enterokinase 또는 trypsin 자체에 의해 활성화되어 단백질을 분해한다.4)

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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