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문제 정의
- 본 연구에서는 금강 하구에서 어류와 갑각류를 채집하여 생물종의 군집을 분석하고, 그 중 잉어과 어류와 갑각류를 대상으로 KHVD, SVC, EUS 및 WSD를 포함한 법정전염병 및 기생충 감염현황을 조사하였다. 본 조사의 결과는 내수면 자연수계의 수산생물방역 체계의 확립과 수산물의 안전성 향상에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
제안 방법
- 각각의 분리된 조직으로부터 PCR 검사를 위해 핵산을 추출하였다. RNA 추출에는 TRIsure (Bioline, USA)을 이용하였고, DNA 추출에는 high pure PCR template preparation kit(ROCHE, Germany)를 이용하였다. 각 제조사의 protocol에 따라 핵산 추출이 진행되었다.
- RNA 추출에는 TRIsure (Bioline, USA)을 이용하였고, DNA 추출에는 high pure PCR template preparation kit(ROCHE, Germany)를 이용하였다. 각 제조사의 protocol에 따라 핵산 추출이 진행되었다. 법정전염병의 PCR검사는 RNA 바이러스인 SVC의 경우 BIONEER사의 rocketscript RT-PCRkit 와 hotstart PCR kit를 이용하여 실험을 수행하였고, DNA바이러스인 KHV와 EUS는 Promega사의 Go Taq green mastermix, WSSV는 Takara사의 EX Taq을 각각 이용하였다.
- 법정전염병의 PCR검사는 RNA 바이러스인 SVC의 경우 BIONEER사의 rocketscript RT-PCRkit 와 hotstart PCR kit를 이용하여 실험을 수행하였고, DNA바이러스인 KHV와 EUS는 Promega사의 Go Taq green mastermix, WSSV는 Takara사의 EX Taq을 각각 이용하였다. 각PCR검사를 위한 PCR mixture 또한 각 제조사의 protocol에 따라 수행하였다. 본 실험에서 수행하고자 하는 법정전염병 검사를 위한 방법은 국립수산과학원의 병성감정지침서를 따랐으며, primer와 PCR 조건은 Mun et al (2018)에서 제시한 것과 같다.
- 세 마리로부터 채취한 각 조직을 pooling하여 1개 시료로서 사용하였고 PCR 검사 전까지 -80℃에서 보관하였다. 각각의 분리된 조직으로부터 PCR 검사를 위해 핵산을 추출하였다. RNA 추출에는 TRIsure (Bioline, USA)을 이용하였고, DNA 추출에는 high pure PCR template preparation kit(ROCHE, Germany)를 이용하였다.
- 삼각망의 경우 어류의 이동이 활발한 구간을 선정하여 설치 후 24시간을 기준으로 수거하였다. 갑각류의 채집을 위하여 어류조사 시 갑각류(십각목)의 채집도 진행하였으며, 통발 등의 채집 장치를 사용하였다. 채집된 담수생물 중 잉어과 어류에 해당되는 개체와 갑각류는 아이스박스 및 기포기를 이용하여 살아있는 상태로 실험실로 운반하였다.
- 군집분석을 위하여 어종의 개체수를 기준으로 종다양도(H, diversity index), 균등도(E, evenness), 우점도(DI, dominance index) 및 종풍부도(R, richness)를 계산하였다. 군집분석 시 종 다양도는 Margalef (1958)의 정보 이론에 의하여 유도된 Shannon-Weaver function (Pielou, 1975)을 사용하여 도출하였다.
- RT5-1 (5’-ACTTCATCGAGTCATTGGTCGT-3’)과 RH3 (5’-CGTACTGTAACGCGTTTGTGCA-3’)은 929 bp 크기의 PCR 산물을 증폭하고 Int5-2 (5’-GGACATGCTAACTTCCCTCTCA-3’)과 Int3-1(5’-CCCAGGATGTCAGATCCTT-3’)은 1349 bp 크기의 PCR 산물을 증폭한다. 두 쌍의 primer에 대한 PCR 조건은98℃에서 10분간의 denaturation 과정을 거친 후, 95℃에서 30초간의 denaturation, 54℃에서 1분간의 annealing, 72℃에서 1분간의 extension을 30 주기를 수행한 후에 추가적으로 72℃에서 5분간의 final extension을 수행하였다.
- 채집된 잉어과 어류에 대해서는 법정전염병으로 지정된 KHVD, SVC 및 EUS (epizootic ulcerative syndrome)를 검사하고 갑각류로부터는WSD를 검사하였다. 또한 간흡충을 포함한 기생충의 감염현황도 조사하였다.
- 채집된 수산생물 중 법정전염병에 대한 임상검사를 위해 외부 및 해부 후의 내부 장기를 관찰하여 특별한 소견이 있는지를 확인하였다. 또한 채집된 어류 중 잉어과 어류를 선별하여 전장, 체고 및 체중을 계측하고, 갑각류는 각장과 전장, 체중을 각각 계측하였다. 질병 진단의 PCR 검사를 위한 표적 장기는 해당 법정전염병의 주요 감염 장기 중 SVC와 KHV는 아가미와 신장을, EUS는 근육을, WSSV는 두흉갑 아래 근육을 분석 시료로서 채취하였다.
- 아가미 두 번째 새엽을 슬라이드 글라스에 넓게 펼쳐놓고 커버글라스로 덮어 현미경으로 관찰하였다. 모든 시료의 체표 및 체내로부터 발견된 기생충은 어체로부터 분리하여 생리식염수에 담근 후 현미경으로 관찰하였다.
- 각 제조사의 protocol에 따라 핵산 추출이 진행되었다. 법정전염병의 PCR검사는 RNA 바이러스인 SVC의 경우 BIONEER사의 rocketscript RT-PCRkit 와 hotstart PCR kit를 이용하여 실험을 수행하였고, DNA바이러스인 KHV와 EUS는 Promega사의 Go Taq green mastermix, WSSV는 Takara사의 EX Taq을 각각 이용하였다. 각PCR검사를 위한 PCR mixture 또한 각 제조사의 protocol에 따라 수행하였다.
- 1차를 제외한 모든 조사시기에서는 다수의 metacercaria가 관찰되었다(Table 1). 본 연구에서 관찰된 metacercaria는 대부분 충체 내에 안점을 가지고 있어, 기존에 알려져 있는 간흡충 metacercaria의 특징과는 차이가 있었기 때문에 PCR 법을 통한 확인이 필요하였다. 검출된 metacercaria가 간흡충의 것인지 확인하기 위하여 간흡충에 대한 specific primer를 사용하여 PCR을 수행하였으나 band가 검출되지 않았다(data not shown).
- 본 연구에서는 2016년에 금강 하구에서 어류 및 갑각류를 4회에 걸쳐 채집하였으며 채집된 생물에 대하여 군집분석을 실시하였다. 채집된 잉어과 어류에 대해서는 법정전염병으로 지정된 KHVD, SVC 및 EUS (epizootic ulcerative syndrome)를 검사하고 갑각류로부터는WSD를 검사하였다.
- 생물의 채집은 2016년 5월 2일, 6월 28일, 8월 31일 및 10월 12일의 총 4회에 걸쳐 실시하였다. 조사정점(36.
- 체표는 슬라이드 글라스로 긁어서 생리식염수가 든 페트리디쉬에 넣어 실체현미경으로 검경하였다. 아가미 두 번째 새엽을 슬라이드 글라스에 넓게 펼쳐놓고 커버글라스로 덮어 현미경으로 관찰하였다. 모든 시료의 체표 및 체내로부터 발견된 기생충은 어체로부터 분리하여 생리식염수에 담근 후 현미경으로 관찰하였다.
- 85% NaCl)로 완충하였고, 여러 번 재침전시켜 상층액을 버리고 원심분리를 진행하였다. 원심분리후 침전물을 현미경으로 관찰함으로서 피낭유충의 유무를 확인하였다. 피낭유충이 발견된 시료는 간흡충의 것인지를 확인하기 위해 핵산을 추출하고 PCR 검사를 실시하였다.
- 정량적 채집을 위하여 투망으로의 채집은 20회 내외로 비교적 동일하게 투척하였으며, 족대는 하천좌·우안 수초 주변에서 60분간 채집하였다.
- 조사정점(36.01°N,126.44°E) 기준으로 사방 200 m의 범위에서 투망(7×7 mm 망목), 족대(5×5 mm 망목) 및 삼각망(5×5 mm 망목)을 병행하여 채집을 실시하였다.
- 채집된 수산생물 중 법정전염병에 대한 임상검사를 위해 외부 및 해부 후의 내부 장기를 관찰하여 특별한 소견이 있는지를 확인하였다. 또한 채집된 어류 중 잉어과 어류를 선별하여 전장, 체고 및 체중을 계측하고, 갑각류는 각장과 전장, 체중을 각각 계측하였다.
- 채집된 어류와 갑각류 시료에서 체표 및 구강과, 아가미 뚜껑의 내벽, 비강, 점액, 지느러미 등에 기생하는 외부기생충을 육안으로 관찰 하였고, 해부 후에는 내장 표면, 장간막, 체강 내에 기생충이 존재하는지 관찰하였다. 체표는 슬라이드 글라스로 긁어서 생리식염수가 든 페트리디쉬에 넣어 실체현미경으로 검경하였다.
- 본 연구에서는 2016년에 금강 하구에서 어류 및 갑각류를 4회에 걸쳐 채집하였으며 채집된 생물에 대하여 군집분석을 실시하였다. 채집된 잉어과 어류에 대해서는 법정전염병으로 지정된 KHVD, SVC 및 EUS (epizootic ulcerative syndrome)를 검사하고 갑각류로부터는WSD를 검사하였다. 또한 간흡충을 포함한 기생충의 감염현황도 조사하였다.
- 채집된 어류와 갑각류 시료에서 체표 및 구강과, 아가미 뚜껑의 내벽, 비강, 점액, 지느러미 등에 기생하는 외부기생충을 육안으로 관찰 하였고, 해부 후에는 내장 표면, 장간막, 체강 내에 기생충이 존재하는지 관찰하였다. 체표는 슬라이드 글라스로 긁어서 생리식염수가 든 페트리디쉬에 넣어 실체현미경으로 검경하였다. 아가미 두 번째 새엽을 슬라이드 글라스에 넓게 펼쳐놓고 커버글라스로 덮어 현미경으로 관찰하였다.
- 원심분리후 침전물을 현미경으로 관찰함으로서 피낭유충의 유무를 확인하였다. 피낭유충이 발견된 시료는 간흡충의 것인지를 확인하기 위해 핵산을 추출하고 PCR 검사를 실시하였다. Cho et al.
- 환경이 악화되면 특정 종에서의 우세 현상이 나타나므로 본 조사에서는 종별 출현 결과를 바탕으로 종별 우점도를 계산하였다(McNaughton, 1967).
대상 데이터
- Cho et al.(2013)에 제시된 대로 간흡충의 retrotransposon을 target으로하는 2쌍의 primer를 사용하였다. RT5-1 (5’-ACTTCATCGAGTCATTGGTCGT-3’)과 RH3 (5’-CGTACTGTAACGCGTTTGTGCA-3’)은 929 bp 크기의 PCR 산물을 증폭하고 Int5-2 (5’-GGACATGCTAACTTCCCTCTCA-3’)과 Int3-1(5’-CCCAGGATGTCAGATCCTT-3’)은 1349 bp 크기의 PCR 산물을 증폭한다.
- 금강 하구 조사지점에서 채집된 어류는 총 8과 28종 504개체였다. 과별 출현 종수는 잉어과(Cyprinidae) 어류가 18종으로 가장 많았고, 다음으로 망둑어과(Gobiidae)가 3종, 동자개과(Bagridae)가 2종, 멸치과(Engraulidae), 숭어과(Mugilidae),학공치과(Hemiramphidae), 검정우럭과(Centrarchidae), 가물치과(Channidae) 어류가 각각 1종씩 확인되었다.
- 그러나 우점종으로 나타난 큰납지리는 잉어과 어류가 아니므로 법정 전염병 검사에 사용되지 않았다. 또한 각 조사 차수마다 15마리의 잉어과 어류를 검사에 사용하였고 갑각류의 경우에는 주로 줄새우와 참게를 대상으로 9마리씩 검사에 사용하였다. 채집된 어류 및 갑각류에서 SVC, KHVD, EUS 및 WSD에 대한 임상증상은 관찰되지 않았으며, 각 질병 검출용 specificprimer를 사용한 PCR 및 RT-PCR에서도 양성 결과가 검출되지 않았다(Table 1).
- 질병 진단의 PCR 검사를 위한 표적 장기는 해당 법정전염병의 주요 감염 장기 중 SVC와 KHV는 아가미와 신장을, EUS는 근육을, WSSV는 두흉갑 아래 근육을 분석 시료로서 채취하였다. 세 마리로부터 채취한 각 조직을 pooling하여 1개 시료로서 사용하였고 PCR 검사 전까지 -80℃에서 보관하였다. 각각의 분리된 조직으로부터 PCR 검사를 위해 핵산을 추출하였다.
- 또한 채집된 어류 중 잉어과 어류를 선별하여 전장, 체고 및 체중을 계측하고, 갑각류는 각장과 전장, 체중을 각각 계측하였다. 질병 진단의 PCR 검사를 위한 표적 장기는 해당 법정전염병의 주요 감염 장기 중 SVC와 KHV는 아가미와 신장을, EUS는 근육을, WSSV는 두흉갑 아래 근육을 분석 시료로서 채취하였다. 세 마리로부터 채취한 각 조직을 pooling하여 1개 시료로서 사용하였고 PCR 검사 전까지 -80℃에서 보관하였다.
- 갑각류의 채집을 위하여 어류조사 시 갑각류(십각목)의 채집도 진행하였으며, 통발 등의 채집 장치를 사용하였다. 채집된 담수생물 중 잉어과 어류에 해당되는 개체와 갑각류는 아이스박스 및 기포기를 이용하여 살아있는 상태로 실험실로 운반하였다.
- 채집된 어종 중 법정전염병의 조사대상은 잉어과 어류를 중심으로 우점종과 아우점종을 우선하여 선발하였다. 검사에 사용된 어류에 대한 정보는 Table 1과 같다.
이론/모형
- 군집 내 종구성의 정도를 나타내는 균등도는 각 지수의 최대치에 대한 실제치의 비로서 표현되며, 각 다양도 지수는 군집 내 모든 종의 개체수가 동일할 때가 최대가 되므로 결국 균등도 지수는 Pielou (1975)의 식을 사용하여 계산하였다.
- 군집분석을 위하여 어종의 개체수를 기준으로 종다양도(H, diversity index), 균등도(E, evenness), 우점도(DI, dominance index) 및 종풍부도(R, richness)를 계산하였다. 군집분석 시 종 다양도는 Margalef (1958)의 정보 이론에 의하여 유도된 Shannon-Weaver function (Pielou, 1975)을 사용하여 도출하였다.
- 각PCR검사를 위한 PCR mixture 또한 각 제조사의 protocol에 따라 수행하였다. 본 실험에서 수행하고자 하는 법정전염병 검사를 위한 방법은 국립수산과학원의 병성감정지침서를 따랐으며, primer와 PCR 조건은 Mun et al (2018)에서 제시한 것과 같다.
- 종풍부도는 군집 내에 존재하는 종의 수에 근거한 종의 밀도로서 단위 지점별 종의 출현을 나타낸다. 이때 고려할 것은 전체종의 수(S)이며, 금강 하구에서 채집된 수산생물의 총 개체수 와 총 종수의 값을 기초로 하여 Margalef (1958)의 지수를 계산하였다.
성능/효과
- 한편 1차 조사시기에는 눈불개의 아가미에서 nematoda가 관찰되었으며, 3차 조사시기에서는 끄리의 아가미와 근육의 소화액에서도 nematoda가 관찰되었다. 1차와 2차 조사에서 채집된 눈불개의 아가미와 4차 조사에서 채집된 붕어의 아가미에서 copepoda가 다수 관찰되었다. 1차를 제외한 모든 조사시기에서는 다수의 metacercaria가 관찰되었다(Table 1).
- 검사에 사용된 어류에 대한 정보는 Table 1과 같다. 4회에 걸쳐 채집된 어류의 군집분석을 통해 금강 지역의 우점종은 큰납지리로 나타났다. 그러나 우점종으로 나타난 큰납지리는 잉어과 어류가 아니므로 법정 전염병 검사에 사용되지 않았다.
- 과별 출현 종수는 잉어과(Cyprinidae) 어류가 18종으로 가장 많았고, 다음으로 망둑어과(Gobiidae)가 3종, 동자개과(Bagridae)가 2종, 멸치과(Engraulidae), 숭어과(Mugilidae),학공치과(Hemiramphidae), 검정우럭과(Centrarchidae), 가물치과(Channidae) 어류가 각각 1종씩 확인되었다. 과별 개체수분포는 전체 504개체 중 잉어과 어류가 416개체로 가장 많이 채집되어 82.5%를 차지하였다. 다음으로 망둑어과가 6.
- 금강 하구 조사지점에서 채집된 어류는 총 8과 28종 504개체였다. 과별 출현 종수는 잉어과(Cyprinidae) 어류가 18종으로 가장 많았고, 다음으로 망둑어과(Gobiidae)가 3종, 동자개과(Bagridae)가 2종, 멸치과(Engraulidae), 숭어과(Mugilidae),학공치과(Hemiramphidae), 검정우럭과(Centrarchidae), 가물치과(Channidae) 어류가 각각 1종씩 확인되었다. 과별 개체수분포는 전체 504개체 중 잉어과 어류가 416개체로 가장 많이 채집되어 82.
- 금강 하구에서 채집된 갑각류의 종수는 2종으로서, 줄새우(Palaemon paucidens)가 87개체 및 참게(Eriocheir sinensis)가 23개체 채집되어 우세하게 나타났다.
- 금강 유역의 대하천에서 강준치는 강한 포식력 및 적응력으로 끄리와 함께 상대풍부도가 꾸준하게 증가하는 추세이며, 중·소형 어류를 무분별하게 섭식하기 때문에 배스 못지않게 수생태계를 교란하는 종이다. 본 조사에서 강준치는 아우점종으로 많은 개체수가 채집되었고, 상대적으로 배스는 적게 출현한 것으로 볼 때 해당 수역의 먹이경쟁에서 강준치가 우위를 점하고 있는 것으로 판단된다.
- 또한 각 조사 차수마다 15마리의 잉어과 어류를 검사에 사용하였고 갑각류의 경우에는 주로 줄새우와 참게를 대상으로 9마리씩 검사에 사용하였다. 채집된 어류 및 갑각류에서 SVC, KHVD, EUS 및 WSD에 대한 임상증상은 관찰되지 않았으며, 각 질병 검출용 specificprimer를 사용한 PCR 및 RT-PCR에서도 양성 결과가 검출되지 않았다(Table 1).
- 8% (9개체) 등으로 조사되었다. 출현 어류의 상대풍부도(relative abundance, RA)를 살펴보면, 큰납지리(Acanthorhodeus macropterus)가 총 108개체로 21.4%를 차지하여 우점종으로 나타났고, 아우점종은 강준치(Erythroculter erythropterus)가 64개체로 12.7%로 조사되었다(Fig. 1). 기타 우세종으로는 누치(Hemibarbus labeo)가 10.
후속연구
- , 2016). 또한 전국에 비해 금강 유역의 인체 간흡충 감염율이 전국 평균에 비하여 높기 때문에 지속적인 간흡충 및 기타 기생충에 대한 방역이 강화되어야 할 것으로 보인다.
- 본 연구에서는 금강 하구에서 어류와 갑각류를 채집하여 생물종의 군집을 분석하고, 그 중 잉어과 어류와 갑각류를 대상으로 KHVD, SVC, EUS 및 WSD를 포함한 법정전염병 및 기생충 감염현황을 조사하였다. 본 조사의 결과는 내수면 자연수계의 수산생물방역 체계의 확립과 수산물의 안전성 향상에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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