[논문]어성초 추출물 및 분획물의 항균, 항산화 및 세포보호활성

윤믿음; 이예슬; 이윤주; 박영민; 박수남

doi:10.14478/ace.2018.1035

어성초 추출물 및 분획물의 항균, 항산화 및 세포보호활성
Antimicrobial, Antioxidant and Cellular Protective Effects of Houttuynia cordata Extract and Fraction 원문보기

공업화학 = Applied chemistry for engineering, v.29 no.4, 2018년, pp.452 - 460

윤믿음 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원센터) , 이예슬 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원센터) , 이윤주 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원센터) , 박영민 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원센터) , 박수남 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원센터)

초록
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본 연구에서는 어성초(Houttuynia cordata)의 추출물 및 분획물을 제조하고 이들에 대한 생리활성과 성분분석을 하였다. 어성초는 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 제조하여 실험에 사용하였다. 항균활성 측정결과, S. aureus, B. subtilis에 대한 에틸아세테이트 분획의 MIC 값은 각각 78, $312{\mu}g/mL$으로 나타나 그람 양성균에 대하여 높은 활성을 보이는 것으로 나타났다. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 자유라디칼 소거활성($FSC_{50}$)은 50% 에탄올 추출물($27.15{\mu}g/mL$) 및 에틸아세테이트 분획($12.00{\mu}g/mL$)을 측정한 결과 에틸아세테이트 분획에서 활성이 더 크게 나타났다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 총항산화능($OSC_{50}$)은 50% 에탄올 추출물($2.91{\mu}g/mL$), 에틸아세테이트 분획($0.983{\mu}g/mL$) 측정 결과 DPPH에 대한 소거활성과 같은 경향성을 보였다. 어성초 추출물의 HaCaT 세포보호효과를 확인하기 위해 UVB 조사 후 세포 내 ROS 소거활성을 확인한 결과, 어성초 에틸아세테이트 분획은 $1.6{\mu}g/mL$부터 농도 의존적으로 ROS 소거활성을 나타내었으며, 최고 농도인 $12.5{\mu}g/mL$에서 54.3%의 감소율을 보였다. 과산화수소로 유도된 세포보호효과 또한, 어성초 에틸아세테이트 분획은 $0.8{\mu}g/mL$부터 세포생존율을 유의적으로 증가시켜 최대 86.9%까지 증가시켰다. 실험에 사용된 어성초 추출물의 에틸아세테이트 분획을 가지고 TLC와 HPLC를 이용한 성분분석을 수행하였다. 그 결과 quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, rutin 및 afzelin이 있음을 확인하였다. 이상의 결과들로부터, 어성초 추출물 및 분획물은 ROS를 소거하고 항균효과를 나타냄으로써 외부 환경으로부터 세포막을 보호할 수 있는 천연 항산화제 및 천연 방부제로서 화장품 분야에서 응용가능성이 있음을 시사하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate the physiological activities of Houttuynia cordata extracts and fractions. H. cordata extracts were extracted with 50% ethanol and the ethyl acetate fractions were obtained from the extracts. Minimum inhibitory concentration (MIC) values of the ethyl acetate fraction for S. aureus and B. subtilis were $78{\mu}g/mL$ and $312{\mu}g/mL$, respectively, indicating the high activity against gram-positive bacteria. The free radical scavenging activity ($FSC_{50}$) for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) was higher in the ethyl acetate fraction with $12.00{\mu}g/mL$ compared to that of $27.15{\mu}g/mL$ for 50% ethanol extract. The total antioxidant activity ($OSC_{50}$) values for reactive oxygen species (ROS) produced in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system by a luminol-dependent chemiluminescence method were 2.91 and $0.983{\mu}g/ml$ for the 50% ethanol extract and ethyl acetate fraction, respectively. To investigate cellular protective effects on the HaCaT cell, the intracellular ROS scavenging activity was measured after UVB irradiation and the ethyl acetate fraction of H. cordata showed the activity in a concentration-dependent from $1.6{\mu}g/mL$ and a reduction rate of 54.3% at a maximum concentration of $12.5{\mu}g/mL$. Also, HaCaT cell protective effect against $H_2O_2$-mediated decreased the cell viability of the ethyl acetate fraction of H. cordata which significantly increased the cell viability from $0.8{\mu}g/mL$ and the maximum cell viability showed 86.9%. The ethyl acetate fraction of the H. cordata extracts was analyzed by TLC and HPLC. As a result, quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, rutin and afzelin were identified. From the above results, it was suggested that the extracts and fractions of H. cordata have a potential to be applied in the field of cosmetics as a natural antioxidant/preservative capable of protecting the cell membrane from the oxidative stress by eliminating ROS and exhibiting the antimicrobial effect.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 화장품 소재로의 적용을 위한 항균활성이나 각종 ROS (H₂O₂, O₂⋅-,⋅OH 등)가 생성되는 계에서의 이들 ROS에 대한 총항산화능에 대해서는 아직 연구가 되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 어성초 추출물을 제조하여 이들 추출물과 분획물의 항균활성, 항산화 활성 및 세포보호활성을 측정하고 그 성분을 밝혀냄으로써 화장품 소재로서의 개발 가능성을 검토하였다.

제안 방법

0.2-200.0 µg/mL 농도의 어성초 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획을 HaCaT 세포에 24 h 처리 후 세포 생존율을 확인하였다.
20 µM H2DCFH-DA로 30 min 동안 37 ℃에서 처리한 후, CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에서 200 mJ/cm2 UVB를 조사하여 세포 내 ROS를 생성시켰다.
Figure 5의 ⑤번에 나타난 어성초 에틸아세테이트 분획의 여러 띠 중 주요 성분이라 판단되어지는 8개의 띠(HCE1, HCE2, HCE3, HCE4,HCE5, HCE6, HCE7, HCE8)를 확인하였다. 8개의 띠를 다양한 표준물질을 사용하여 R_f value, 자외선, NP (natural products, 2-aminoethyldiphenylborinate) 발색시약으로 비교하여 확인하였다. 그 결과 HCE1(R_f = 0.
9) 실험을 통해 더 높은 생리활성을 보인 어성초 에틸아세테이트 분획에 대하여 TLC와 HPLC 크로마토그램을 이용한 성분분석을 진행하였으며, quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, rutin, afzelin을 확인하였다.
성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료 및 표준물질의 R_f 값과 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.5% acetic acid를 함유한 50% acetonitrile 수용액을 이용해 기울기 용리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 Table 3에 나타내었다.
, Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤, 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시켰다. 각 시료를 흡수시킨 paper disc를 균주를 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 후 배양시켜 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
각 실험군을 96-well plate에 20 µL 주입한 후 50% DMSO를 사용하여 2배 희석법을 이용하여 농도를 희석하였다.
Figure 6에 나타난 어성초 에틸아세테이트 분획의 HPLC 크로마토그램에서 7개의 높은 peak를 확인하였다. 각각의 peak를 TLC 분석에서 사용한 표준물질의 retention time과 UV-visible 흡수스펙트럼을 비교하여 분석을 진행하였다. 각각의 peak를 분석한 결과, peak 1은 neochlorogenic acid, peak 2는 chlorogenic acid, peak 3은 cryptochlorogenic acid, peak 4는 hyperoside, peak 5는 rutin, peak 6은 isoquercitrin, peak 7은 quercitrin으로 나타났다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. DPPH의 소거율(%)은 다음 식과 같이 나타내었고, 자유라디칼 소거활성(free radical scavenging activity, FSC₅₀)은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도로 표기하였다.
13)은 rutin으로 확인하였다. 그러나 HCE3~7에 해당하는 성분은 띠의 명확한 구별이 어려워 좀 더 정확한 분석을 위하여 HPLC로 분석을 진행하였다.
대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O 대신 증류수를 첨가하였다.
본 실험에서 사용한 어성초 에틸아세테이트 분획은 50% 에탄올 추출물에 비하여 더 높은 생리활성을 나타내었다. 따라서 이러한 효과를 나타내는 유효성분에 대한 동정이 필요한 것으로 판단하여 성분분석을 진행하였다. 어성초 에틸아세테이트 분획에 대한 TLC 크로마토그램은 Figure 5에 나타내었고, HPLC 크로마토그램은 Figure 6와 Table 6에 나타내었다.
세척 후, 무혈청 배지로 바꿔 24 h 배양하였다. 배양 후, MTT assay로 세포 생존율을 확인하여 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 세포보호효과를 확인하였다.
배양된 균주는 1 × 106- 1 × 107CFU/mL으로 맞추어 본 실험에 사용하였으며, 각 균주는 평판배지에 100µL씩 멸균 면봉을 사용하여 도말하였다.
본 실험에서는 MTT assay를 이용하여 어성초 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획의 HaCaT 세포에 대한 독성을 확인하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 0.
그러므로 세포 내 ROS 소거활성을 가지는 항산화 물질은 피부 노화를 억제할 수 있다. 본 실험에서는 어성초 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획의 각질 형성 세포 내 UVB로 유도된 ROS 소거 활성을 H₂DCF-DA를 이용하여 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군에 비해 ROS가 3배가량 증가하였다.
본 실험에서는 어성초 추출물 및 분획의 라디칼 소거활성을 측정하였고 지용성 항산화제로 잘 알려진 (+)-α-tocopherol의 자유라디칼 소거활성과 비교하였다.
이렇게 생성된 과산화수소는 세포막을 통과하여 Fe²⁺, Ca²⁺ 등과 같은 생체 내 미량으로 존재하는 금속 이온과 반응하여 ⋅OH를 생성시켜 산화적 손상을 야기한다. 본 실험에서는 이러한 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 어성초 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획의 세포보호효과를 확인하였다. 실험 결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 76.
TLC 분석 시 사용한 전개 용매는 Table 2에 나타내었다. 성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료 및 표준물질의 R_f 값과 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.
세포 내 ROS 소거활성 평가를 위하여 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate H2DCF-DA)를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이용하였다.
어성초 추출물에 대한 항균활성은 화장품의 방부력 평가를 위해 대표적으로 사용되는 호기성 그람 양성 균주인 S. aureus (황색포도상구균), B. substilis (고초균), 호기성 그람 음성 균주인 E. coli (대장균), P. aeruginosa (녹농균), 효모균인 C. albicans, 곰팡이균인 A. niger 총 6종의 균주에 대하여 disc diffusion assay로 실시하였으며, 실험 결과는 Figure 2와 Table 4에 나타내었다. 어성초 50% 에탄올 추출물은 그람 양성균(S.
어성초의 에틸아세테이트 분획을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milopore 0.45 µm)를 이용하여 여과시키고 이 여액을 극성 TLC(normal phase) 및 비극성 HPLC (C18) 분석을 위한 시료로 이용하였다.
에틸아세테이트 분획은 S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, C. albicans, A. niger에 대하여 각각 78, 312, 1,250, 5,000, 10,000 µg/mL에서 MIC를 나타냈으며 E. coli에 대해서는 항균활성을 나타내지 않았다.
Luminol은 ROS와 반응하여 들뜬 상태의 아미노프탈산이 되고, 이어서 아미노프탈산이 바닥상태로 되면서 발광(420-450 nm)을 하는 것으로 알려져 있다. 이 계에 항산화제를 첨가하면 ROS가 감소되어 화학발광이 감소하는데 이를 이용하여 총 항산화능(ROS scavenging concentration, OSC₅₀)을 평가하였다. 활성산소가 50% 감소하는 농도인 OSC₅₀은 어성초 50% 에탄올 추출물이 2.
생체 내에 존재하는 항산화제인 (+)-α- tocopherol은 지질과산화 연쇄 반응에서 생성된 지질 라디칼에 수소 주개로 작용함으로써 연쇄반응을 종결시켜 세포막을 보호한다. 이와 같이 수소주개로 작용하여 라디칼을 소거하는 능력인 환원력을 측정하기 위하여 비교적 안정한 라디칼로 존재하는 DPPH와의 반응을 통하여 시료의 자유라디칼 소거활성(FSC₅₀)을 측정하였다. 본 실험에서는 어성초 추출물 및 분획의 라디칼 소거활성을 측정하였고 지용성 항산화제로 잘 알려진 (+)-α-tocopherol의 자유라디칼 소거활성과 비교하였다.

대상 데이터

ROS 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), EDTA, luminol, (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid 는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT 제품을 사용하였고, HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 Shim-pack VP-ODS C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 제품을 사용하였다.
기타 FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
본 실험에 사용된 균주는 Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association (CTFA) challenge test에서 사용되는 호기성 그람 양성 균주인 S. aureus ATCC 6538 (황색포도상구균), B. substilis ATCC 6051(고초균), 호기성 그람 음성 균주인 E. coli ATCC 23736 (대장균), P.aeruginosa ATCC 29336 (녹농균), 효모균인 C. albicans ATCC10231, 곰팡이균인 A. niger ATCC 16404 총 6가지 균주를 한국 미생물 보존센터에서 분양 받아 사용하였다. 해당 균주를 배양하는 데 필요한 배지 및 배양 조건을 Table 1에 나타내었다.
에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, rutin 및 afzelin은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 어성초는 경상북도 영천시 원산지로 (주)갑당약초에서 구매하여 사용하였다.
사람 각질형성 세포주인 HaCaT 세포는 Dr. Fusenig (German Cancer Research Center, DKFZ)로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Capricorn, Germany)는 10% fetal bovine serum (FBS, PAA, Austria), 1% penicillin/streptomycin, (P/S, PAA, Austria)을 혼합하여 사용하였고, 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 배양하였다.
세포배양에 사용된 배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Capricorn, Germany)는 10% fetal bovine serum (FBS, PAA, Austria), 1% penicillin/streptomycin, (P/S, PAA, Austria)을 혼합하여 사용하였고, 37 ℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
(USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 어성초는 경상북도 영천시 원산지로 (주)갑당약초에서 구매하여 사용하였다.
(Japan) 제품을, H₂O₂는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, rutin 및 afzelin은 Sigma Chemical Co.
각 추출물의 정확한 최소저해농도를 조사하기 위하여 broth-dilution method를 사용하였다. 음성 대조군으로는 50% DMSO를, 양성 대조군으로는 화장품에 방부제로 널리 사용되는 methyl paraben을 사용하였다. 각 실험군을 96-well plate에 20 µL 주입한 후 50% DMSO를 사용하여 2배 희석법을 이용하여 농도를 희석하였다.

데이터처리

One-way ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 이상의 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
본 연구의 모든 실험결과는 3회 반복 실시하였으며, 통계분석은 GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA) 프로그램을 이용하였다. One-way ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.

이론/모형

cordata 50% EtOH extract and EtOAc fraction treatment on HaCaT cell viability. HaCaT cells were treated with various concentrations of samples for 24 h and cell viability was determined using the MTT assay. Data are presented as the mean ±SD.
각 추출물의 정확한 최소저해농도를 조사하기 위하여 broth-dilution method를 사용하였다. 음성 대조군으로는 50% DMSO를, 양성 대조군으로는 화장품에 방부제로 널리 사용되는 methyl paraben을 사용하였다.
각 추출물의 항균활성을 disc diffusion assay로 측정하였다. 배양된 균주는 1 × 10⁶- 1 × 10⁷CFU/mL으로 맞추어 본 실험에 사용하였으며, 각 균주는 평판배지에 100µL씩 멸균 면봉을 사용하여 도말하였다.
어성초 추출물에 대하여 성장 억제의 경향성을 확인하기 위해 broth-dilution method를 사용하여 각 추출물의 정확한 최소저해농도(MIC)를 조사하였으며 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 어성초 50% 에탄올 추출물의 MIC 값은 S.

성능/효과

1) 어성초 추출물의 수율은 50% 에탄올 추출물의 경우 24.18%, 에틸아세테이트 분획의 경우 2.18%이었다.
2) 어성초 추출물의 disc diffusion method를 사용한 항균활성 측정 결과 50% 에탄올 추출물은 그람 양성균인 S. aureus, B. subtilis에 저해환을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 E.
3) 어성초 추출물의 MIC 측정 결과 두 추출물 모두 그람 양성균인 S. aureus, B. subtilis에 대하여 기존의 방부제와 유의하거나 더 낮은 MIC 값을 나타내어 높은 항균효과를 보였으며, 에틸아세테이트 분획은 P. aeruginosa, C. albicans, A. niger 균주에 대해서도 MIC 값을 나타내었기 때문에 50% 에탄올 추출물에 비하여 높은 항균효과를 나타내었다.
4) 어성초 추출물의 DPPH free radical 소거활성 측정 결과, FSC50 값은 50% 에탄올 추출물(27.15 µg/mL), 에틸아세테이트 분획(12.00µg/mL), (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL)로 나타나 어성초 추출물은 대조군보다는 낮은 활성을 보였으나 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물보다 더 높은 활성을 나타내었다.
5) 어성초 추출물의 활성산소 소거활성 측정 결과, 총 항산화능 OSC50 값은 50% 에탄올 추출물(2.910 µg/mL), 에틸아세테이트 분획(0.983 µg/mL)으로 나타나 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물보다 더 높은 활성을 나타내었으며, 두 추출물 모두 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid (4.946 µg/mL)보다도 더 높은 활성을 나타내었다.
50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획은 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid (1.50 µg/mL)보다 각각 약 1.7, 5배 높은 활성을 나타내었으며 통계적으로도 유의하게 더 높은 총 항산화능을 나타냄을 확인하였다.
6) 어성초 추출물의 세포 독성 평가 결과, 어성초 50% 에탄올 추출물은 12.5 µg/mL, 에틸아세테이트 분획은 25 µg/mL의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았으며, 이에 따라 0.4-12.5 µg/mL의 농도 범위를 설정하여 HaCaT 세포보호효과를 측정하였다.
7) 어성초 추출물의 세포 내 ROS 소거활성 측정 결과, 어성초 50% 에탄올 추출물의 경우 ROS 소거활성을 나타내지 않은 반면, 에틸아세테이트 분획의 경우 1.6 µg/mL 이상에서 농도 의존적으로 ROS 소거활성을 나타내었다.
8) 어성초 추출물의 과산화수소로 유도된 세포손상에 대한 보호 효과 측정 결과, 50% 에탄올 추출물은 유의한 효과를 나타내지 않은 반면, 에틸아세테이트 분획은 0.8 µg/mL 이상의 농도에서 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다.
coli에 대해서는 항균활성을 나타내지 않았다. MIC 측정 결과는 어성초 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획이 그람 양성균에 대하여 대조군으로 사용된 methyl paraben과 비교하여 비슷하거나 더 높은 항균활성을 나타냄을 보였으며, 이는 disc diffusion assay 실험 결과와도 경향성이 일치하였다. 또한 에틸아세테이트 분획은 P.
각각의 peak를 TLC 분석에서 사용한 표준물질의 retention time과 UV-visible 흡수스펙트럼을 비교하여 분석을 진행하였다. 각각의 peak를 분석한 결과, peak 1은 neochlorogenic acid, peak 2는 chlorogenic acid, peak 3은 cryptochlorogenic acid, peak 4는 hyperoside, peak 5는 rutin, peak 6은 isoquercitrin, peak 7은 quercitrin으로 나타났다. 따라서 peak 5와 peak 7은 TLC에서 확인한 HCE2, HCE8과 일치하는 것으로 확인하였으며 TLC에서 명확하게 구별하지 못한 HCE3 - 7에 해당하는 성분은 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4, peak 6번으로 확인되어진 성분으로 HCE3 (R_f = 0.
수율은 100 g을 기준으로 계산하였다. 건조된 어성초의 수율은 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획에서 각각 24.18, 2.14%로 나타났다.
8개의 띠를 다양한 표준물질을 사용하여 R_f value, 자외선, NP (natural products, 2-aminoethyldiphenylborinate) 발색시약으로 비교하여 확인하였다. 그 결과 HCE1(R_f = 0.67)은 afzelin, HCE2 (R_f = 0.55)은 quercitrin, HCE8 (R_f =0.13)은 rutin으로 확인하였다. 그러나 HCE3~7에 해당하는 성분은 띠의 명확한 구별이 어려워 좀 더 정확한 분석을 위하여 HPLC로 분석을 진행하였다.
각각의 peak를 분석한 결과, peak 1은 neochlorogenic acid, peak 2는 chlorogenic acid, peak 3은 cryptochlorogenic acid, peak 4는 hyperoside, peak 5는 rutin, peak 6은 isoquercitrin, peak 7은 quercitrin으로 나타났다. 따라서 peak 5와 peak 7은 TLC에서 확인한 HCE2, HCE8과 일치하는 것으로 확인하였으며 TLC에서 명확하게 구별하지 못한 HCE3 - 7에 해당하는 성분은 peak 1, peak 2, peak 3, peak 4, peak 6번으로 확인되어진 성분으로 HCE3 (R_f = 0.37)은 isoquercitrin, HCE4 (R_f = 0.35)은 cryptochlorogenic acid, HCE5 (R_f = 0.33)은 neochlorogenic acid, HCE6 (R_f = 0.32)은 hyperoside, HCE7 (R_f = 0.30)은 chlorogenic acid임을 각각 확인하였다.
본 실험에서 사용한 어성초 에틸아세테이트 분획은 50% 에탄올 추출물에 비하여 더 높은 생리활성을 나타내었다. 따라서 이러한 효과를 나타내는 유효성분에 대한 동정이 필요한 것으로 판단하여 성분분석을 진행하였다.
본 실험에서는 어성초 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획의 각질 형성 세포 내 UVB로 유도된 ROS 소거 활성을 H₂DCF-DA를 이용하여 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군에 비해 ROS가 3배가량 증가하였다. 어성초 50% 에탄올 추출물의 경우 UVB를 조사한 실험군과 유의한 차이를 보이지 않아 ROS 소거활성을 나타내지 않았다.
본 실험에서는 이러한 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 어성초 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획의 세포보호효과를 확인하였다. 실험 결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 76.3%의 생존율을 나타내었다. 50% 에탄올 추출물을 처리한 군은 실험에 사용된 모든 농도에서 과산화수소를 처리한 실험군과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실험 결과, 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 어성초 50% 에탄올 추출물은 12.5 µg/mL, 에틸아세테이트 분획은 25 µg/mL의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았다 (Figure 5).
subtilis)에서만 저해환을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 E. coli를 제외한 5가지 균주에서 모두 저해환을 나타내었으며 특히 그람 양성균(S. aureus, B. subtilis)에 대하여 대조군으로 사용된 methyl paraben과 비슷하거나 더 넓은 범위의 저해환을 보여 그람 양성균에 대하여 높은 항균활성을 가지는 것으로 나타났다.
subtilis에 저해환을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 E. coli를 제외한 모든 균주에서 저해환을 나타내어 50% 에탄올 추출물에 비하여 높은 항균활성을 나타내었다.
이들은 항산화제로 알려진 (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL)보다는 낮은 활성을 보였으나 에틸아세테이트 분획에서 50% 에탄올 추출물보다 통계적으로 유의하게 더 높은 자유라디칼 소거활성을 나타냄을 확인하였다.
9%까지 증가시켰다. 이러한 결과로 어성초 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물보다 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효능이 뛰어남을 확인하였다(Figure 7).
3%의 감소율을 나타내어 농도 의존적으로 ROS 소거활성을 나타내었다. 이러한 결과로 어성초 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물보다 뛰어난 세포 내 ROS 소거활성을 보임을 확인하였다(Figure 6).

후속연구

MIC 측정 결과는 어성초 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획이 그람 양성균에 대하여 대조군으로 사용된 methyl paraben과 비교하여 비슷하거나 더 높은 항균활성을 나타냄을 보였으며, 이는 disc diffusion assay 실험 결과와도 경향성이 일치하였다. 또한 에틸아세테이트 분획은 P. aeruginosa, C. albicans, A. niger 균주에 대해서도 methyl paraben보다는 낮은 농도이지만 MIC 값을 나타내었기 때문에 화학적 방부제의 함량을 줄이거나 다른 천연물과의 시너지 효과를 이용하여 화학적 방부제를 대신할 수 있을 것으로 사료된다.
위 결과를 통하여 어성초 추출물의 항균 및 항산화 활성과 세포보호효과를 확인할 수 있었으며, 기능성 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	화장품은 사람의 피부에 어떤 악영향을 끼치는가?	그러나 화장품에 사용되는 수분함량은 제형에 따라 적게는 30%에서 많게는 95% 정도로 다량의 물이 함유되어 있어 미생물에 의한 오염이 일어나기 쉽다. 화장품은 접촉되는 사용방법에 따라 사람의 손 및 피부 등 신체와 공기 중의 다양한 미생물에 의해 쉽게 오염될 수 있으며, 이러한 미생물 오염은 화장품을 사용하는 소비자에게 치명적인 영향을 끼칠 수 있다[3-5]. 이에 화장품에는 화장품이 추구하는 본래의 목적 외에 보조성분으로 미생물의 생육을 억제하는 방부제가 첨가되어야 한다.
	사람의 피부는 무엇인가?	사람의 피부는 인체의 겉 부분을 덮고 있는 조직으로, 체내의 근육들과 피부를 보호하며 여러 가지 생명활동이 일어나는 중요한 기관이다. 피부의 기능은 보호기능, 호흡기능, 저장기능, 감각기능, 분비기능으로 크게 5가지로 나뉘는데 특히 피부는 자외선이나 미생물, 공해와 같은 외부자극으로부터 신체 내부를 보호하는 데 있어 중요한 역할을 하게 된다.
	피부의 기능은 어떤 것들이 있는가?	사람의 피부는 인체의 겉 부분을 덮고 있는 조직으로, 체내의 근육들과 피부를 보호하며 여러 가지 생명활동이 일어나는 중요한 기관이다. 피부의 기능은 보호기능, 호흡기능, 저장기능, 감각기능, 분비기능으로 크게 5가지로 나뉘는데 특히 피부는 자외선이나 미생물, 공해와 같은 외부자극으로부터 신체 내부를 보호하는 데 있어 중요한 역할을 하게 된다. 피부는 이렇듯 자체적으로 보호기능을 가지기는 하지만, 외부 자극에 지속적으로 노출되어 있기 때문에 손상을 받기 쉽다[1-2].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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