선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 최근 본 연구자들은 기존 열수추출방법과 다양한 유기용매를 활용하여 추출한 후 항산화 및 항염증 활성을 포함한 다양한 생리활성이 보고된 느릅나무를 대상으로 친환경적이고 인체 유해성이 낮으며, 현재까지 밝혀지지 않은 느릅나무 초임계 추출물의 항균활성, 항산화 및 항염증 활성 연구를 수행하여 천연물 유래 생리활성 기능성 신소재를 발굴하기 위해 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- ABTS 래디칼 소거 활성은 Re 등[24]의 방법을 수정하여 측정하였다. ABTS(Sigma Co.
- , Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 에탄올을 사용하였으며, 배양 후 disc 주변에 생성된 저해환 (clear zone, mm) 을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
- 본 실험에서 RAW 264.7 cells에 대한 느릅나무 가지 초임계 추출물의 세포 독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하기 위해 MTT assay를 실행하였다. RAW 264.
- 최근 많은 연구자들로부터 식물의 자원 활용성 및 이용성 등을 연구하는 주된 이유는, 식물의 이차대사산물중 항산화활성을 기반으로 한 다양한 질환을 치료 또는 예방에 주된 활성을 나타내는 폴리페놀(poly-phenol)화합물 때문이라고 할 수 있다[36,37]. 본 실험에서는 총 페놀 함량을 측정하기 위해서 페놀 화합물의 표준물질로 가장 보편적으로 잘 활용되고 있는 gallic acid와 ethyl gallate를 각각 사용하여 Folin-Denis법[28]에 의해 구해진 검량선 으로부터 총 페놀 함량을 Table 3과 같이 확인이 되었다. 이러한 결과로 인해서 신규 천연 항산화제로서의 가치가 있을 것으로 기대가 된다.
- 본 연구에서는 느릅나무 가지 추출은 초임계유체 추출 연구용 장비(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 사용한 느릅나무 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거 하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다.
- 온도가 안정화되면 느릅나무 가지 시료를 넣고 CO2 가스를 등압으로 유지시킨 후, 고압펌프를 이용하여 line을 통해 실험압력 조건인 400 bar에 도달할 때까지 Control valve를 조절하여 주입하였다. 설정 압력에 도달 후 추출조 하부로 에탄올 (HPLC grade)을 분당 3 mL씩 60분 동안 총 180 mL를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 30min 동안 고압펌프를 이용하여 CO2 를 흘려보내며 추출을 완료하였다.
- Nitric oxide 생성 억제 작용은 Griess의 방법[26,27] 으로 측정하였다. 즉, Griess reagent (1% sulfanilamine, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylene diamine dihydrochloride, 2.5% H3PO4 )는 NO를 산화시켜 NO2 로 변화시키며 생성된 NO2 는 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 농도를 NaNO2 의 검량선을 이용하여 구하였다. 즉, RAW 264.
- 즉, RAW 264.7 cell을 DMEM으로 medium 1 mL 당 5×104 개 만큼 배양 시킨 다음, 1 mL 당 1×104 개로 희석하여 96 well에 160 uL씩 넣고 2시간 동안 배양해서 cell들이 부착되도록 한다음 LPS (1 ug/mL) 10 uL을 포함한 각각의 시료를 20 uL씩 넣고 20시간 배양시킨 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 정량하였다.
- 용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치시킨 후 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid와 ethyl gallate를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다.
대상 데이터
- Mouse macrophage RAW 264.7 cell은 한국 세포주 은행에서 동결상태로 구입하였으며 cell이 들어있는 앰플을 미온수 (30-40℃)에 바로 녹여 10% FBS(fetal bovine serum), penicillin G(100 IU/mL), streptomycin (100 ug/mL)을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 동결 과정에서 넣어준 DMSO를 제거하고, DMSO를 제거한 RAW 264.7 cells에 DMEM을 5mL 넣어, 온도 37 ℃와 5%의 CO2 를 유지하면서 incubator에서 배양하였으며, 1-2일마다 세포의 성장 정도에 따라 계대 배양하였다.
- 무좀의 주 원인균으로는 T. mentagrophytes와 T. rubrum이 알려져 있고[32], 이번 실험에 사용한 균종은 T. mentagrophytes 이다. 최근 Trichophyton 균이 단순히 무좀관련 피부질환 뿐만 아니라 알레르기성 질환군 즉, 아토피피부염, 비염 및 천식 등의 질환들을 유발하는 것으로 밝혀져 왔다[33,34].
- 본 연구에서는 느릅나무 가지 추출은 초임계유체 추출 연구용 장비(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 사용한 느릅나무 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거 하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 건조된 시료 450 g을 200 mesh의 분쇄망을 통과하도록 분쇄 하고, 분쇄된 느릅나무 가지를 추출조의 온도를 50℃ 로조절하여 온도를 유지시킨다.
- 항균활성에 사용된 미생물 균주를 한국생명공학 연구원 생물자원센터(KCTC/BRC, Jeongeup, Korea), 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)로부터 분양받았다, 실험에 사용한 각 미생물 균주의 균종과 번호를 Table 1 에 정리하였다.
데이터처리
- 각 실험 농도 별 표준차이를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며, 유의성이 발견된 경우 Tukey’s HSD test[29]에 의해 농도 간의 유의성을 분석하였다.
- 본 연구의 실험 결과들은 3회 반복 측정하여 평균값± 표준편차로 나타내었으며, 모든 자료의 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Science, version 24.0 SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였다.
이론/모형
- Nitric oxide 생성 억제 작용은 Griess의 방법[26,27] 으로 측정하였다. 즉, Griess reagent (1% sulfanilamine, 0.
- The cell viability was measured by MTT assay. Results were expressed as % of control absorbance.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법[28]에 따라 각 추출물 1 mL에 Folin-Ciocalteu 시약 및 10% Na2CO3 용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치시킨 후 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid와 ethyl gallate를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다.
- 항균력 검색은 paper disc법을 사용하였다[23]. 배양된 균주는 1.
성능/효과
- 0.5-10 mg/mL 농도에서 느릅나무 가지 초임계 추출물은 농도의존적으로 항균력이 증가되는 것이 확인 되었다. 항균력 확인된 농도에서 각각 12, 16 mm clear zone 이 확인 되어 농도가 높아짐에 따라서 해당 균종에 대해서 항균력이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
- 0.5-10 mg/mL 농도에서 느릅나무 가지 초임계 추출물은 농도의존적으로 항균력이 증가되는 것이 확인되어 T. mentagrophytes에 대한 항균력이 있음을 확인할 수 있었다(Table 2).
- 2B와 같이 나타났다. 0.5-10 mg/mL 농도에서 느릅나무 가지 초임계 추출물은 농도의존적으로 항균력이 증가되는 경향이 확인되었다(Table 2).
- 난치성 자가면역질환으로 잘 알려진 아토피피부염은 다양한 유발원인 또는 악화원인 중 하나는 과생성된 NO 로 알려져 있으며, 이로 인해 NO생성 저해는 만성염증성 피부면역 질환에서 치료적 방법으로 중요한 영역으로 알려져 있다[35]. 그에따라서 느릅나무 가지 초임계 추출물의 만성 염증성 피부면역 질환 소재로서 활용 가능성을 확인하기 위해서 Raw 264.7 macrophage cell line에서 LPS로 유도된 NO 생성 억제능을 실험하기에 앞서 실험에 사용된 농도 12.5-50 ug/mL 모든 농도에서 MTT assay를 통해서 세포 독성을 확인해 본 결과는 Fig. 4에 서와 같이 모든 실험군에서 느릅나무 가지 초임계 추출물의 첨가에 따른 세포활성 억제가 관찰되지 않았다. 느릅나무 가지 초임계 추출물의 NO 소거능을 확인해 본 결과는 Fig.
- 2C와 같이 나타났다. 느릅나무 가지 초임계 추출물은 모든 실험농도 즉, 0.5 -10 mg/mL에서 clear zone(mm)이 11, 13, 14, 15 mm로 각각 항균력이 확인되었다(Table 2).
- 2A와 같이 나타났다. 느릅나무 가지 초임계 추출물은 모든 실험농도(0.5 -10 mg/mL)에서 clear zone(mm)이 12, 16 mm로 각각 항균력이 확인 되었다(Table 2).
- 3과 같다. 느릅나무 가지 초임계 추출물을 0.1-500 ug/mL까지 측정한 결과 모든 실험 농도에서 농도 의존적으로 유의적인 ABTS 라디컬 소거능이 관찰 되었다. 특히, 실험 농도인 250 ug/mL 이상에서는 양성 대조군인 비타민 C 항산화 활성과 동등한 것으로 확인되었다.
- mentagrophytes)에 대하여 항균력을 확인한 결과 추출물은 시험된 모든 균종에 대해 항균력이 확인이 되어서 각 균으로 유발될 수 있는 질환으로 알려진, 무좀 및 아토피 피부병, 비염 및 천식으로 이루어진 알레르기성 질환, 염증성 피부질환, 여드름, 모낭염 등의 질환을 예방 및 치료 보조 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다. 또한, ABTS 라디컬 소거능과 NO 소거능 실험을 통해서 느릅나무 가지 초임계 추출물의 항산화 활성과 항염증 활성의 우수한 활성이 확인이 되어서 산화적 스트레스 질환과 염증성 질환에 대해서 예방 또는 치료 보완 병용 기능성 원료로 개발이 가능성이 높다는 점이 확인되었다. 결론적으로 느릅나무 가지 초임계 추출물은 피부상재균에 대한 항균활성, 프리라디컬 소거능에 의한 항산화 활성, NO소거능에 의한 항염증활성이 각각 확인이 되어 향후 난치성 피부면역 질환 개선 및 치료 관련 천연물 의약품 또는 기능성 화장품 개발 관련 천연 신기능성 소재로 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- mentagrophytes에 대한 항균력이 있음을 확인할 수 있었다(Table 2). 이러한 결과를 통해서 느릅나무 가지 초임계 추출물은 0.5 mg/mL 농도 이상에서 T. mentagrophytes에 의해 유발될 수 있는 무좀관련 피부 질환을 포함하여 아토피 피부염, 비염 및 천식 등 알러지성 질환군을 예방 또는 치료를 위한 천연물 유래 신소재로 활용될 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 5-10 mg/mL 농도에서 느릅나무 가지 초임계 추출물은 농도의존적으로 항균력이 증가되는 것이 확인 되었다. 항균력 확인된 농도에서 각각 12, 16 mm clear zone 이 확인 되어 농도가 높아짐에 따라서 해당 균종에 대해서 항균력이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 또한, ABTS 라디컬 소거능과 NO 소거능 실험을 통해서 느릅나무 가지 초임계 추출물의 항산화 활성과 항염증 활성의 우수한 활성이 확인이 되어서 산화적 스트레스 질환과 염증성 질환에 대해서 예방 또는 치료 보완 병용 기능성 원료로 개발이 가능성이 높다는 점이 확인되었다. 결론적으로 느릅나무 가지 초임계 추출물은 피부상재균에 대한 항균활성, 프리라디컬 소거능에 의한 항산화 활성, NO소거능에 의한 항염증활성이 각각 확인이 되어 향후 난치성 피부면역 질환 개선 및 치료 관련 천연물 의약품 또는 기능성 화장품 개발 관련 천연 신기능성 소재로 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 난치성 피부질환에 적용이 가능한 천연물 유래 신소재를 발굴하기 위해서 느릅나무 가지를 초임계 유체 기술을 활용하여 추출을 수행하였고, 확보된 느릅나무 가지 초임계 추출물을 3종의 피부상재균(S. epidermidis, P. acnes, T. mentagrophytes)에 대하여 항균력을 확인한 결과 추출물은 시험된 모든 균종에 대해 항균력이 확인이 되어서 각 균으로 유발될 수 있는 질환으로 알려진, 무좀 및 아토피 피부병, 비염 및 천식으로 이루어진 알레르기성 질환, 염증성 피부질환, 여드름, 모낭염 등의 질환을 예방 및 치료 보조 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다. 또한, ABTS 라디컬 소거능과 NO 소거능 실험을 통해서 느릅나무 가지 초임계 추출물의 항산화 활성과 항염증 활성의 우수한 활성이 확인이 되어서 산화적 스트레스 질환과 염증성 질환에 대해서 예방 또는 치료 보완 병용 기능성 원료로 개발이 가능성이 높다는 점이 확인되었다.
- 특히, 실험 농도인 250 ug/mL 이상에서는 양성 대조군인 비타민 C 항산화 활성과 동등한 것으로 확인되었다. 이러한 결과로서 느릅나무 가지 초임계 추출물이 산화적 스트레스로 인해 유발하는 피부노화질환, 알러지성 질환군을 포함한 난치성 피부질환을 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 신규 천연항산화제로 개발이 가능할 것으로 판단된다.
- 5에 나타내었다. 즉, 실험에 사용된 모든 농도에서 음성 대조군인 LPS 유도군에 비해서 통계적으로 유의성 있게 NO 소거능이 확인이 되었으며, Normal 대조군과 비교하였을 때 느릅나무 가지 초임계 추출물은 NO 소거능이 매우 강한 것으로 확인되어, 신규 천연물 유래 항염증 활성 소재로 개발이 가능할 것으로 판단되며, 특히 만성 염증성 피부면역 질환에 적용할 수 있는 신규 천연 신소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 이러한 결과로 인해서 신규 천연 항산화제로서의 가치가 있을 것으로 기대가 된다. 하지만, 초임계 추출물이 항산화 활성 실험에서는 상대적으로 고농도에서 활성이 확인되고, NO 억제능 실험인 cell line에서는 저농도에서도 강력한 활성을 나타내는 원인에 대해서는 향후 지속적인 성분 연구를 통하여 느릅나무 가지 초임계 추출물의 생리활성을 나타낸 단일 화합물을 밝혀나가야 할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.