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문제 정의
- 그러므로, 본 연구에서는 국내 주요 자생지에서 실제로 병풀을 재배하였을 때 나타나는 주요성분 및 항산화 활성의 조직별 변화를 지상부 조직을 중심으로 재배 시기별로 조사하고자 하였습니다.
제안 방법
- ABTs 라디칼 양이온 탈색화법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 Re et al. [10]의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다. 7 mM의 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt와 2.
- 45 um 주사기필터로 여과 후 농축시켜 조제하였다. 각 시료들은 감압 여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 수율을 측정하고 실험에 사용하였다.
- 각 지상부 조직에서 병풀 시료의 성분 차이를 알아보고자 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 병풀의 주요 활성물질로 알려져 있는 asiatic acid (AA), asiaticoside (AS), medecasic acid (MA), medecassoside (MS)를 각 추출공정을 통한 병풀 추출물의 peak를 얻고 상호 비교 분석을 시도하였다. 시료의 분석을 위해 물, 20% 에탄올 및 메탄올을 이용한 추출물의 시료를 HPLC 분석용 water에 녹여 각각 100 μg/ml의 농도로 조제하고 0.
- Urban)은 2017년 4월, 7월, 10월 3회에 걸쳐 경남 합천군에서 약 900평의 하우스 시설에서 재배중인 농가에서 지원 받아 사용하였으며, 각 시료는 수확 후 세척 과정을 거쳐 40℃에서 열풍 건조시킨 것을 사용하였다. 건조된 병풀은 조직부위별 비교를 위해 잎과 잎 자루 부분을 분리한 것과 분리하지 않은 시료들로 모아서 각 각 믹서기에 곱게 마쇄하여 사용하였으며, 병풀 분말은 시료 양의 10배의 추출용매를 넣고 30분간 초음파추출한 후에 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 그 상층액을 0.45 um 주사기필터로 여과 후 농축시켜 조제하였다. 각 시료들은 감압 여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 수율을 측정하고 실험에 사용하였다.
- 5×10-4 M 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 용액과 시료를 96-well plate에 첨가한 후 10분간 반응시킨 다음 Multimicroplate reader-SpectraMax M5 (Molecular Devices, USA) 로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거활성은 에탄올을 첨가한 시료의 흡광도를 기준값(blank)으로 하고 시료의 용매를 넣은 것을 대조구로 측정하였다.
- 2A). 다음으로 서식환경에 따라 생육에 영향을 받는 식물의 특성상 재배 시기에 따라 triterpenoid glycosides의 함량 변화를 확인하기 위해 재배 시기별로 수확하여 분석을 진 행하였다. 병풀은 기후가 따뜻하고 습한 지역에서 자라는 식물로 하우스 시설재배를 하더라도 추운 겨울에는 생육이 어려워 따뜻해지는 봄철부터 가을까지 4, 7, 10월에 수확하되 성장 정도에 따른 차이를 줄이기 위해 일정구획을 정하여 1차 수확 후에 2차 수확까지 자라는 기간을 고려하여 3개월씩 키워서 동일한 구간에서 자란 병풀을 수확하여 건조시켜 실험에 사용하였다.
- 대조구로는 BHA와 ascorbic acid를 사용하였고, 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 radical 소거능(IC50)으로 표시하였으며 각 실험은 다음 식에 의하여 계산하였다.
- 병풀의 생육부위별 항산화 활성의 차이를 확인하기 위해 4월에 수확한 병풀시료의 잎과 자루 및 지상부 전잎(잎+자루) 시료를 각각 메탄올, 에탄올, 물을 이용하여 추출한 후 분석을 진행하였다. 항산화 활성의 분석은 ABTs와 DPPH 소거활성 분석 방법을 이용하여 진행하였다.
- 본 연구에서는 병풀이 매년 첫 수확 시기가 4월이고, 첫 수확 이후 조직이 균일하지 않기 때문에 각 시기별 실험을 원활히 진행되지 못했으며, 또한 재배의 특성상 수확 후 유통에 있어서 전잎만 사용되기 때문에 조직을 구분하지 않고 실험을 진행하였다. 그러므로, 향후 연구에서는 시기별 및 조직별로 주요 성분의 함량변화와 추출용매에 따른 항산화 활성의 차이를 고려할 때, 본 연구결과들을 토대로 향후 생육 시기별 수확 한 병풀 식물체의 시료들을 이용하여 항균활성, 세포독성조사 및 피부개선효과 분석과 같은 보다 실제적인 생리활성에 연관된 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 수집된 병풀은 잎, 잎자루, 전잎(잎과 잎자루)를 시료로 이용하였고 용매에 따른 추출 효율을 확인하기 위해 메탄올과 에탄올, 물을 이용하여 각각 시료 1 g에 10 ml의 용매를 넣어 동일한 조건으로 추출하였다. 그 결과, 세 가지 시료에서 공통적으로 메탄올을 용매로 이용 하였을 때 추출효율이 가장 높게 나오는 것을 각 표준시료와 일치하는 MS, AS, MA, AA의 피크를 통해 확인하였다(Fig.
- 시료의 분석을 위해 물, 20% 에탄올 및 메탄올을 이용한 추출물의 시료를 HPLC 분석용 water에 녹여 각각 100 μg/ml의 농도로 조제하고 0.2 μm syringe filter로 여과하여 injection volume 10 μl로 측정하였다.
- 총 폴리페놀 함량의 측정은 각 추출물을 96-well plate에 분주한 후 1 N Folin-Ciocalteu (Sigma, USA) 시약을 넣고 실온에서 3분간 반응시킨 다음 10% sodium carbonate 용액을 80 μL 가하여 1시간 반응시키고 나서 Multimicroplate reader-SpectraMax M5 (Molecular Devices, USA) 로 765 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 플라보노이드 함량의 측정은 추출물과 ethanol을 섞은 후, 2% aluminum chloride용액을 1:1 비율로 첨가하여 1시간 반응시킨 후, Multimicroplate reader-SpectraMax M5(Molecular Devices, USA) 로 430 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 0∼250 μg/ml의 농도의 quercetin용액을 이용하여 기준 곡선을 작성하고 시료 1g 당 quercetin의 함량을 계산하여 catechin equivalents (CAE)로 환산한 값으로 나타내었다.
- 희석된 ABTS 용액 225 μl에 시료 25 μl를 가한 후, Multimicroplate reader-SpectraMax M5 (Molecular Devices, USA) 를 사용하여 734 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
대상 데이터
- HPLC 기기는 Waters e2675 Alliance system과 Waters 2998 PDA detector (200 nm)를 사용하였고, Column은 Phenomenex사의 Luna C18 (3 μm, 4.6×15 mm)을 사용하였다.
- 1B). 그러므로, 이 후의 HPLC 분석을 위한 시료의 추출은 가장 추출 효율이 높게 나타난 메탄올을 사용하여 추출한 것을 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 병풀(Centella asiatica L. Urban)은 2017년 4월, 7월, 10월 3회에 걸쳐 경남 합천군에서 약 900평의 하우스 시설에서 재배중인 농가에서 지원 받아 사용하였으며, 각 시료는 수확 후 세척 과정을 거쳐 40℃에서 열풍 건조시킨 것을 사용하였다. 건조된 병풀은 조직부위별 비교를 위해 잎과 잎 자루 부분을 분리한 것과 분리하지 않은 시료들로 모아서 각 각 믹서기에 곱게 마쇄하여 사용하였으며, 병풀 분말은 시료 양의 10배의 추출용매를 넣고 30분간 초음파추출한 후에 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 그 상층액을 0.
- 6×15 mm)을 사용하였다. 이동상은 물과 메탄올(50:50, v/v)의 혼합 용액을 사용하였고, 유속은 1.0 ml/min으로 흘려주었으며, 표준시료는 Madecassic acid (ChemFaces, China), Madecassoside (ChemFaces, China), Asiatic acid (ChemFaces, China), Asiaticoside (ChemFaces, China)를 사용하였다.
이론/모형
- 병풀의 생육부위별 항산화 활성의 차이를 확인하기 위해 4월에 수확한 병풀시료의 잎과 자루 및 지상부 전잎(잎+자루) 시료를 각각 메탄올, 에탄올, 물을 이용하여 추출한 후 분석을 진행하였다. 항산화 활성의 분석은 ABTs와 DPPH 소거활성 분석 방법을 이용하여 진행하였다. ABTs는 비교적 안정한 자유 래디컬로 친유성, 친수성 항산화물질의 측정에 모두 적용이 가능한 분석 방법이다[2].
성능/효과
- 페놀성 화합물은 천연물에 함유되어 있는 성분으로 총 폴리 페놀은 DPPH 소거활성과 같은 항산화 활성에 매우 중요한 인자로 작용하는 특성을 갖는다. 4월에 수확한 병풀시료를 각 용매별, 부위별로 추출하여 폴리페놀 함량을 분석한 결과, 추출용매에는 큰 차이를 보이지 않았고 생육부위별로 비교했을 때 잎에 함량이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 식물에 의해 합성된 대표적인 폴리페놀의 한 종류인 quercetin, kaempferol, luteolin를 포함하는 화합물인 플라보노이드의 함량을 조사한 결과, 세가지 용매에서 동일하게 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타나는 특징을 보였다(Fig.
- 각 추출물을 1,000 μg/ml의 농도로 처리했을 때 IC50 값의 분석결과, 메탄올과 에탄올, 물 추출물 모두 유사한 결과를 보였으며, 잎의 추출물이 자루추출물에 비해 높은 소거능을 나타내었다(Fig. 3A).
- 수집된 병풀은 잎, 잎자루, 전잎(잎과 잎자루)를 시료로 이용하였고 용매에 따른 추출 효율을 확인하기 위해 메탄올과 에탄올, 물을 이용하여 각각 시료 1 g에 10 ml의 용매를 넣어 동일한 조건으로 추출하였다. 그 결과, 세 가지 시료에서 공통적으로 메탄올을 용매로 이용 하였을 때 추출효율이 가장 높게 나오는 것을 각 표준시료와 일치하는 MS, AS, MA, AA의 피크를 통해 확인하였다(Fig. 1A). 실제로 정량적 분석을 통해 확인해 본 결과, 세 가지 추출용매 모두 MS와 AS가 MA와 AA에 비해 상당히 높게 함유되어 있는 것을 확인할 수 있다 (Fig.
- 2). 또한 재배 시기별로 보면 기온이 높아지는 여름철에 수확했을 때 성분이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 병풀의 첫 수확시기인 4월의 시료로 생리활성검증을 위하여 항산화 활성 및 항산화효과와 밀접한 관련이 있는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사한 결과, 자루부위보다 잎에 많이 함유되었음을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 실험의 결과로서, DPPH 소거활성은 ABTs 소거활성과는 다른 경향을 보였다. 물 추출물은 ABTs 소거활성과 같게 잎 부위가 가장 낮게 확인되었으나 메탄올과 에탄올 추출물의 경우에는 잎에 비해 자루부위에서 IC50 값이 오히려 낮게 나타나는 결과를 보였다(Fig. 3B).
- 병풀의 첫 수확시기인 4월의 시료로 생리활성검증을 위하여 항산화 활성 및 항산화효과와 밀접한 관련이 있는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사한 결과, 자루부위보다 잎에 많이 함유되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 3 and Fig. 4).
- 본 연구의 결과로서, 국내에서 재배중인 병풀을 수확하여 주요 triterpenoid glycosides에 대한 HPLC 분석을 수행한 결과, 용매에 따른 추출효율은 메탄올 추출 시에 가장 높게 확인되었고(Fig. 1), 생육부위별로 주로 잎 부위에 높게 축적되는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 또한 재배 시기별로 보면 기온이 높아지는 여름철에 수확했을 때 성분이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 생육부위별 triterpenoid glycosides의 함량차이를 확인하기 위해 4월에 수확한 병풀의 잎과 자루 및 지상부 전잎(잎과 잎자루) 시료를 각각 추출하여 분석한 결과, AA를 제외한 세 가지 성분은 자루와 비교할 때 잎 부위에 높은 함량을 나타내었다(Fig. 2A). 다음으로 서식환경에 따라 생육에 영향을 받는 식물의 특성상 재배 시기에 따라 triterpenoid glycosides의 함량 변화를 확인하기 위해 재배 시기별로 수확하여 분석을 진 행하였다.
- 4A). 식물에 의해 합성된 대표적인 폴리페놀의 한 종류인 quercetin, kaempferol, luteolin를 포함하는 화합물인 플라보노이드의 함량을 조사한 결과, 세가지 용매에서 동일하게 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타나는 특징을 보였다(Fig. 4B).
- 1A). 실제로 정량적 분석을 통해 확인해 본 결과, 세 가지 추출용매 모두 MS와 AS가 MA와 AA에 비해 상당히 높게 함유되어 있는 것을 확인할 수 있다 (Fig. 1B). 그러므로, 이 후의 HPLC 분석을 위한 시료의 추출은 가장 추출 효율이 높게 나타난 메탄올을 사용하여 추출한 것을 이용하였다.
- 병풀은 기후가 따뜻하고 습한 지역에서 자라는 식물로 하우스 시설재배를 하더라도 추운 겨울에는 생육이 어려워 따뜻해지는 봄철부터 가을까지 4, 7, 10월에 수확하되 성장 정도에 따른 차이를 줄이기 위해 일정구획을 정하여 1차 수확 후에 2차 수확까지 자라는 기간을 고려하여 3개월씩 키워서 동일한 구간에서 자란 병풀을 수확하여 건조시켜 실험에 사용하였다. 앞서 분석한 결과와 실제 농가에서 재배 및 수확 후에 전잎(잎과 잎자루) 그대로 유통되는 점을 바탕으로 이후 실험은 생육부위를 구분하지 않고 전잎을 메탄올 추출하여 HPLC 로 분석한 결과, AS와 MS는 점점 증가하여 10월에 가장 높게 나타났고 AA와 MA는 7월에 가장 높게 나타나는 결과를 얻었 다(Fig. 2B).
- 4). 항산화활성의 경우, ABTs 분석의 결과는 triterpenoid glycosides 함량이 높았던 잎의 추출물이 자루보다 높은 소거능력을 보인 반면에 DPPH 분석의 결과에서는 물 추출물을 제외한 메탄올과 에탄올 추출물에서 오히려 자루 부분의 소거능력이 더 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).
후속연구
- 본 연구에서는 병풀이 매년 첫 수확 시기가 4월이고, 첫 수확 이후 조직이 균일하지 않기 때문에 각 시기별 실험을 원활히 진행되지 못했으며, 또한 재배의 특성상 수확 후 유통에 있어서 전잎만 사용되기 때문에 조직을 구분하지 않고 실험을 진행하였다. 그러므로, 향후 연구에서는 시기별 및 조직별로 주요 성분의 함량변화와 추출용매에 따른 항산화 활성의 차이를 고려할 때, 본 연구결과들을 토대로 향후 생육 시기별 수확 한 병풀 식물체의 시료들을 이용하여 항균활성, 세포독성조사 및 피부개선효과 분석과 같은 보다 실제적인 생리활성에 연관된 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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