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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 이에 천연물질이나 약용물질로부터 항산화 물질을 분리하여 항산화능이 우수한 천연탈모방지제 개발 연구가 더욱 활발하게 진행되고 있기에 떫은감 추출물을 이용하여 발모 및 탈모 효과 여부를 알아보고자 하였다.
- 이상에서와 같이, 탈모 또한 두피조직의 산화적 손상과 관련이 있으므로, 본 실험에서는 떫은감 추출물에 의한 산화억제 정도를 실험하기 위해, DPPH에 의한 항산화 실험을 실시하였다. 항산화 물질의 가장 큰 특징인 기작은 자유 유리기(free radical)와 반응하는 것으로 유리기에 자를 공여하여 유리기를 전자적으로 안전하게 만듦으로써 free radical의 독성을 감소시키는 것이다[18].
제안 방법
- 모발 길이를 측정하기 위해 Bomviewer Image Analyzer을 사용하여 80x에서 약 6개의 이미지를 사용하였다. 80x와 200x의 약 6 개의 이미지가 Bomviewer 이미지 분석기를 사용하여 각각 머리 길이와 머리카락 밀도를 측정하기 위해 사용하였다. 누드마우스의 모발면적을 각 마우스에 대하여 주당 3 회 체계적으로 분석 하였다.
- BrdU 염색 면역세포 증식은 PBS 용액에 5 mg/ml의 농도에서 50 mg/kg 체중의 Bromodeoxyuridine(BrdU;Sigma, USA)의 복강 내 주사에 의해 검출하였다. BrdU 결합은 마우스 anti-BrdU 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 파라핀 블록 절편을 IHC 염색에 의해 검출하였다. 1 차 항체와 함께 배양하지 않은 피부 절편을 음성 대조군으로 사용하였다.
- BrdU 염색 면역세포 증식은 PBS 용액에 5 mg/ml의 농도에서 50 mg/kg 체중의 Bromodeoxyuridine(BrdU;Sigma, USA)의 복강 내 주사에 의해 검출하였다. BrdU 결합은 마우스 anti-BrdU 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 파라핀 블록 절편을 IHC 염색에 의해 검출하였다.
- 파라핀이 삽입 된 4μm 절편을 Hematoxylin & eosin(H & E)으로 염색 하였다. 누드 마우스의 HF 형태와 HF의 수는 배율 100 배에서 배면의 5 개 필드에서 현미경으로 분석 하였다.
- 80x와 200x의 약 6 개의 이미지가 Bomviewer 이미지 분석기를 사용하여 각각 머리 길이와 머리카락 밀도를 측정하기 위해 사용하였다. 누드마우스의 모발면적을 각 마우스에 대하여 주당 3 회 체계적으로 분석 하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- 이러한 조건에 적응시킨 후 5 마리의 마우스를 무작위로 4 그룹으로 나누었다. 떫은감 추출물(10mg/마우스), 표준화된 대조군 제제에 현탁시키고 미녹시딜(2 %)을 2 번 모발 성장이 완료 될 때까지 누드 마우스의 등 피부에 매일 일정량씩 도포 하였다.
- 마우스를 anagen 단계에서 희생시키고 피부 샘플을 조직학적 분석을 위해 10% 완충 포르말린에 고정시켰다. 파라핀이 삽입 된 4μm 절편을 Hematoxylin & eosin(H & E)으로 염색 하였다.
- 매일 일정량의 피부 도포를 시작한 직후, KONG, Bom-Viewer Plus(서울, 한국)를 사용하여 목, 등 및 엉덩이 부위의 이미지를 주당 2회 이미지를 촬영하였다. 모발 길이를 측정하기 위해 Bomviewer Image Analyzer을 사용하여 80x에서 약 6개의 이미지를 사용하였다.
- 활성산소를 제거하는 radical scavenger로서의 작용을 하는지의 여부를 조사하기 위해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)법을 이용해 평가하였다. 무수에탄올로 0.01%와 0.001% 희석한 떫은감 추출물 1mL와 1,3-BG(butylene glycol)로 100배와 1,000배 희석한 각각의 떫은감 추출물 1mL에 0.1 mM DPPH용액 1 mL를 가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응물의 흡도를 분도계를 이용해 516 nm에서 측정하였다. 양성대조군으로는 butylated bydroxytoluene (BHT)을,음성대조군으로는 무수에탄올을 사용하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 이러한 조건에 적응시킨 후 5 마리의 마우스를 무작위로 4 그룹으로 나누었다. 떫은감 추출물(10mg/마우스), 표준화된 대조군 제제에 현탁시키고 미녹시딜(2 %)을 2 번 모발 성장이 완료 될 때까지 누드 마우스의 등 피부에 매일 일정량씩 도포 하였다.
- 첫번째 및 두번째 모발 성장주기 모두에서 모발 길이에서 유의적인 증가 (P<0.0001)가 대조군과 비교하여 관찰되었다.
- 첫번째와 두번째의 모발 성장주기 모두에서 각 마우스에 대해 '0'에서 '4'점수를 부여하여 모든 처리 그룹의 모발 탈모 복원 영역에 미치는 영향을 정확하게 측정하였다.
- 파라핀이 삽입 된 4μm 절편을 Hematoxylin & eosin(H & E)으로 염색 하였다.
대상 데이터
- 7 주령의 C57BL/6 수컷 누드 마우스를 대한바이오링크(음성, Korea)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 하였다.
- 매일 일정량의 피부 도포를 시작한 직후, KONG, Bom-Viewer Plus(서울, 한국)를 사용하여 목, 등 및 엉덩이 부위의 이미지를 주당 2회 이미지를 촬영하였다. 모발 길이를 측정하기 위해 Bomviewer Image Analyzer을 사용하여 80x에서 약 6개의 이미지를 사용하였다. 80x와 200x의 약 6 개의 이미지가 Bomviewer 이미지 분석기를 사용하여 각각 머리 길이와 머리카락 밀도를 측정하기 위해 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 떫은 감은 재래시장에서 판매되는 청도반시를 사용하였으며, 떫은 감은 착색 후 15일이 경과 한 것을 사용하였다. 떫은감을 약 500kg을 증류수를 이용하여 100℃에서 2시간 가열하여 5회 추출하였고, Diatomiter를 사용하여 여과 한 후 95℃에서 30분간 살균 과정을 거치고 동결 건조하여, 21%의 수득율로 얻어진 떫은감 추출물 파우더를 –80℃에 보관하여 사용하였다.
- 1 mM DPPH용액 1 mL를 가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응물의 흡도를 분도계를 이용해 516 nm에서 측정하였다. 양성대조군으로는 butylated bydroxytoluene (BHT)을,음성대조군으로는 무수에탄올을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 () Version 22.0 (IBM, USA)의 unpaired Student's t-test를 이용하여 통계처리 하였으며, 그 값은 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표기하였다.
이론/모형
- 활성산소를 제거하는 radical scavenger로서의 작용을 하는지의 여부를 조사하기 위해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)법을 이용해 평가하였다. 무수에탄올로 0.
성능/효과
- 미녹시딜의 발모효과에 대한 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았지만, 혈관작용을 통한 영양공급 증가 및 potassium channel opening 효과 등이 모발 성장을 유도하는 것으로 생각되고 있다. minoxidil는 대머리 치료 가운데서도 남성형 대머리(male-pattern baldness), 즉 남성호르몬에 의한 남성형 탈모증(androgenic alopenia)에 효과적으로 알려져 있지만, 치료 중단 후 수개월 이내에 치료효과가 사라지는 것으로 밝혀졌다. 이에 비해 피나스테라이드와 프로페시아는 전립샘비대증 및 전립샘암 치료제로 testosterone를 전립샘비대 및 탈모의 원인물질인 dihydrotestestosterone(DHT)로 전환 시키는 효소인 type II 5-reductase를 억제한다.
- 국소 적용은 블랙 마우스 피부의 뒷면에서 매일 두 번의 모발 성장 세대가 완료 될 때까지 수행하였다. 거시적인 외관과 모발의 국소적인 분포가 각각의 그룹에서 정확하게 관찰되었고 명확하게 구별 가능한 특징을 보였다. 누드 계통의 유산 발기부전 모발 패턴의 지역적 분포는 모발의 물결 모양 패턴과 일치하였다.
- 떫은감 추출물의 DPPH 생성억제능 결과, 떫은감 추출물은 5, 10, 25, 50mg/ml 농도에서 각각 56.1±4.9%, 50.6±9.5%, 43.5±0.1 %, 71.1±11.7%로 활성을 나타내었다.
- 누드 계통의 유산 발기부전 모발 패턴의 지역적 분포는 모발의 물결 모양 패턴과 일치하였다. 떫은감추출물로 처리된 생쥐의 모발 성장 부위가 뚜렷하게 보이고 동시에 등의 최대 부분을 덮는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 항산화, 표피세포재생, 모유두세포 증식전 효과를 가짐으로써 두피개선 발모 및 탈모예방진 효과를 가진 물질임을 증명하고, 탈모 치료제의 개발 시 유용한 원료로의 가치가 있음을 제시할 수 있었다.
- 그러므로 탈모를 예방하고 피모의 재성장 및 모발성장을 촉진할 수 있는 안전하고 간편한 천연활성 생물학적 성분을 확인함으로써 잠재력을 가질 수 있으며 이들의 성공적인 사용은 약물 발견에 대한 새로운 접근법인 약리학을 열 수 있다. 떫은감추출물의 알려진 치료 효능을 감안할 때, 본 실험에서 BALB/C 블랙마우스 모델에서 다른 식물 추출물을 엄청나게 효과검색 하였으며 이것은 모발 성장 메커니즘을 연구하는 독특한 모델로 사용할 수 있었다. 떫은감추출물은 탁월한 모발 성장 촉진 효과를 나타 냈습니다.
- 모발 길이의 측정에 있어서, 떫은감 추출물 처리군에서 현저한 효과가 관찰되었다. 첫번째 및 두번째 모발 성장주기 모두에서 모발 길이에서 유의적인 증가 (P<0.
- 떫은감추출물로 처리된 생쥐의 모발 성장 부위가 뚜렷하게 보이고 동시에 등의 최대 부분을 덮는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 항산화, 표피세포재생, 모유두세포 증식전 효과를 가짐으로써 두피개선 발모 및 탈모예방진 효과를 가진 물질임을 증명하고, 탈모 치료제의 개발 시 유용한 원료로의 가치가 있음을 제시할 수 있었다.
- 첫번째와 두번째 모발 성장주기 동안 대조군보다 미녹시딜과 떫은감 추출물로 처리 한 생쥐에서 최대 모발 성장 점수가 유의하게 (P <0.001) 증가하였다(Figure 2).
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