[논문]간암세포주에서 상피간엽전환억제를 통한 Silymarin의 침윤 및 전이 억제 효과

김도훈; 박소정; 이승연; 윤현서; 박충무

doi:10.15324/kjcls.2018.50.3.337

간암세포주에서 상피간엽전환억제를 통한 Silymarin의 침윤 및 전이 억제 효과
Silymarin Attenuates Invasion and Migration through the Regulation of Epithelial-mesenchymal Transition in Huh7 Cells 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.50 no.3, 2018년, pp.337 - 344

김도훈 (동의대학교 임상병리학과) , 박소정 (동의대학교 임상병리학과) , 이승연 (동의대학교 임상병리학과) , 윤현서 (동의대학교 치위생학과) , 박충무 (동의대학교 임상병리학과)

초록
AI-Helper

발생하는 간암 중 가장 주요한 형태인 간세포암은 강한 전이특성으로 인해 높은 재발율과 사망률을 보인다. Silymarin은 엉겅퀴에서 추출한 플라보노이드 성분으로 여러 암세포주에서 상피간엽전환(epithelial mesenchymal transition, EMT) 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 silymarin이 EMT의 조절을 통해 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는지를 분석하고자 하였다. Huh7 cell의 침윤과 전이 활성을 분석하기 위하여 wound healing assay와 in vitro invasion assay를 시행하였고 EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현 분석을 위해 Western blot assay를 실시하였다. 그 결과 silymarin은 농도 의존적으로 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하였다. EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor $(NF)-{\kappa}B$ 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상위신호전달물질 중 silymarin은 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt의 인산화 억제를 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 것으로 나타났고 이것은 selective inhibitor인 LY294002의 처리 결과로 확인할 수 있었다. 결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다. 이를 통해 silymarin이 간세포암의 전이 억제에 효과적인 항암물질의 후보가 될 수 있는 잠재력을 가진 후보물질이 될 수 있음을 보여주었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Hepatocellular carcinoma (HCC), a major type of hepatoma, is associated with high recurrence and mortality because of its uncontrolled metastatic feature. Silymarin is a polyphenolic flavonoid from Silybum marianun (milk thistle) and exhibits anti-carcinogenic activity through modulation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in several cancer cells. In this study, the inhibitory mechanism of silymarin against migration and invasion was investigated in the Huh7 HCC cell line. Wound healing and in vitro invasion assays were conducted to examine the effects of silymarin on migration and invasion. Western blot analysis was also applied to evaluate the inhibitory effects of silymarin on the EMT-related genes and their upstream signaling molecules. Silymarin inhibited the migratory and invasive activities of Huh7 cells. In addition, silymarin attenuated the protein expression levels of vimentin and matrix metalloproteinase (MMP)-9 as well as their transcription factors, Snail, and nuclear factor $(NF)-{\kappa}B$, while the expression of E-cadherin was increased by the silymarin treatment. Among the upstream signaling molecules, the phosphorylation of Akt was inhibited by the silymarin treatment, which was confirmed by the selective inhibitor, LY294002. Consequently, silymarin inhibited the invasive and migratory activities in Huh7 cells through the modulation of EMT-related gene expression by the PI3K/Akt signaling pathway, which may have potential as a chemopreventive agent against HCC metastasis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

특히 이들은 leptin으로 유도된 간세포암의 성장, 침윤과 전이에 관련된 것으로 보고되기도 하였다[15]. 따라서 본 연구에서는 Huh7 cell의 EMT관련 유전자 조절에 어떤 신호전달물질이 관여하고, silymarin에 의해 조절되는지의 여부를 분석하였다. 실험 결과 Figure 5에서 보는 바와 같이 silymarin이 ERK, JNK, p38의 인산화에는 영향을 주지 못하였으나 Akt의 인산화는 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
절제 후 초기에 재발하는 암은 주로 간내 전이로부터 발생되고 후기 재발 암은 다발성 발암과정으로 인해 발생하는 것으로 보고되고 있다[19, 20]. 따라서, 본 연구에서는 간염의 치료에 효과적인 것으로 알려진 silymarin이 EMT 조절을 통해 간세포암의 침윤과 전이를 억제하는지를 밝히고자 하였다. 분석 결과 Huh7 cell의 운동성에 의해 시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 silymarin을 처리한 세포는 운동성이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않았다.
Silymarin은 엉겅퀴에서 추출한 플라보노이드 성분으로 여러 암세포주에서 상피간엽전환(epithelial mesenchymal transition, EMT) 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 silymarin이 EMT의 조절을 통해 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는지를 분석하고자 하였다. Huh7 cell의 침윤과 전이 활성을 분석하기 위하여 wound healing assay와 in vitro invasion assay를 시행하였고 EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현 분석을 위해 Western blot assay를 실시하였다.
Silymarin은 항산화효과, 지질과산화 억제효과 등으로 인해 간 보호효과가 있고, 간세포막의 독성물질이 수용체와 결합 후 세포막을 파괴하는 작용을 방해함으로써 세포를 안정시켜 간세포를 보호하기도 하며 혈중지단백의 대사를 정상화함으로써 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 효과가 있는 것으로 보고되었다[10]. 특히, silymarin은 non-small cell lung carcinoma, prostate cancer, bladder cancer 등 다양한 암세포에서 EMT 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었으나 간세포암에서는 그 효과가 보고되지 않았으므로 본 논문에서는 그 활성을 분석하고자 하였다[7, 9, 11].

제안 방법

1차 항체와의 보합반응이 끝난 membrane은 TBST로 3회 세척 후 다시 1:1,000으로 희석한 2차 항체와 실온에서 2시간동안 보합반응을 하였다. 2차 항체까지 반응이 끝난 후 enhanced chemiluminescence solution (ECL, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)을 이용하여 반응을 유도한 후 ECL sensitive film에 감광시켜 단백질의 발현 변화를 측정하였고 Gel Doc EQ system (Biorad)으로 정량 분석하였다.
그 후 10 μL pipet tip을 이용하여 plate의 바닥을 일자로 긁어 wound를 만들었다. Silymarin을 농도별로 처리한 후 24, 48시간동안 배양하면서 시간별로 세포가 이동한 정도를 현미경으로 관찰하여 결과를 비교하였다.
Silymarin이 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이에 미치는 영향을 알아보기 위하여 silymarin이 cell migration에 미치는 효과를 분석하였다. 먼저 silymarin이 Huh7 cell에 미치는 세포 독성 효과를 알아본 결과 Figure 1에서 보는 바와 같이 silymarin을 12.
그러므로 wound healing assay, in vitro invasion assay의 silymarin 50, 100 μg/mL 실험군에는 Huh7 cell을 10, 20% 더 파종하여 세포독성에 의한 효과를 상쇄하고자 하였다.
In vitro invasion assay에서도 silymarin을 처리한 세포의 이동이 현저히 억제되는 것을 볼 수 있었고 이 결과를 바탕으로 silymarin이 HCC인 Huh7 cell의 세포 운동성을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다. 그리고 silymarin에 의해 억제된 Huh7 cell의 운동성이 침윤과 전이를 억제하는지를 확인하기 위하여 EMT와 관련된 전이와 침윤 단백질의 발현을 분석하였다. EMT의 중요한 과정 중 하나는 E-cadherin이 N-cadherin으로 전환되는 cadherin switch로서 세포간의 부착을 유도하는 세포표면단백질인 E-cadherin이 소실되면서 N-cadherin이 활성화되는 과정이다.
그리고 이 결과를 바탕으로 in vitro에서 침윤을 억제하는 효과가 있는지의 여부를 8 μm의 pore size를 가진 transwell membrane을 이용하여 분석하였다.
그러므로 silymarin이 EMT 관련 유전자의 조절을 통해 이러한 활성을 보이는지를 확인하기 위하여 Huh7 cell내에서 발현되는 관련 단백질의 발현을 western blot analysis를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 EMT 관련 유전자 중 세포 표면 단백질인 E-cadherin, 세포외 기질을 분해하는 효소인 MMP-9과 중간엽세포의 지표인 vimentin을 분석하였다. E-cadherin은 인접한 세포의 E-cadherin 분자와 부착하여 세포간 강한 결합을 유지하고 세포의 극성을 유지하는 역할을 한다.

대상 데이터

, 가습된 조건에서 배양하였다. Silymarin, dimethyl sulfoxide (DMSO), and sodium dodecyl sulfate (SDS)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot을 위한 E-cadherin (clone 24E10, mAb), vimentin (clone D21H3, mAb), MMP-9 (clone D6O3H, mAb), Snail (clone C15D3, mAb), p-p65 (clone 93H1, mAb), phospho-Akt (clone D9E, mAb), Akt (clone C67E7, mAb), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p-ERK, clone D13.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot을 위한 E-cadherin (clone 24E10, mAb), vimentin (clone D21H3, mAb), MMP-9 (clone D6O3H, mAb), Snail (clone C15D3, mAb), p-p65 (clone 93H1, mAb), phospho-Akt (clone D9E, mAb), Akt (clone C67E7, mAb), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p-ERK, clone D13.14.4E, mAb), ERK (clone 137F5, mAb), phospho-c-Jun NH2-protein kinase (p-JNK, clone 81E11, mAb), JNK (pAb), phospho-p38 (clone D3F9, mAb), p38 (clone D13E1, mAb), actin (clone 13E5, mAb)등에 대한 1차 항체는 토끼를 호스트로 하여 제조된 것을, 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG는 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 모두 구입하여 1:1,000의 비율로 희석하여 분석에 사용하였다.
실험에 사용한 Huh7 cell (human hepatocellular carcinoma)은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양 받았고, 10%의 fetal bovine serum (FBS, Hyclone, South Logan, UT, USA), Penicillin/Streptomycin (Hyclone)이 포함된 DMEM배지를 사용하여 37°C, 5% CO2, 가습된 조건에서 배양하였다.

데이터처리

3회 반복 시행한 모든 실험 결과는 SPSS 통계 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차(mean ±SD)로 나타내었다.
실험군 간의 유의성 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검증을 시행하였다. 대조군과 실험군 사이의 비교에는 t-test를 사용하였고, P값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실험군 간의 유의성 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검증을 시행하였다.

이론/모형

본 연구에서는 silymarin이 EMT의 조절을 통해 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는지를 분석하고자 하였다. Huh7 cell의 침윤과 전이 활성을 분석하기 위하여 wound healing assay와 in vitro invasion assay를 시행하였고 EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현 분석을 위해 Western blot assay를 실시하였다. 그 결과 silymarin은 농도 의존적으로 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하였다.
Wound healing assay와 in vitro invasion assay 결과, silymarin은 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 활성이 있는 것으로 판단할 수 있었다. 그러므로 silymarin이 EMT 관련 유전자의 조절을 통해 이러한 활성을 보이는지를 확인하기 위하여 Huh7 cell내에서 발현되는 관련 단백질의 발현을 western blot analysis를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 EMT 관련 유전자 중 세포 표면 단백질인 E-cadherin, 세포외 기질을 분해하는 효소인 MMP-9과 중간엽세포의 지표인 vimentin을 분석하였다.
용해된 세포가 포함된 단백질 추출 용액은 13,000 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후 분리된 상층을 새 튜브로 옮겨 분석에 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford법으로 정량하였다. 분리한 단백질 50 μg이 포함된 시료를 준비하여 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후 polyvinylidene fluoride membrane (PVDF, Bio-rad)으로 이동시켰다.
세포생존율은 EZ-Cytox cell viability assay kit (Daeil lab service, Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다. Huh7 cell을 24 well plate에 1×10⁵ cell/well의 농도로 파종한 후 24시간동안 배양하고 silymarin을 농도별로 처리하였다.

성능/효과

EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor (NF)-κB 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
Huh7 cell이 파종된 6-well plate에 pipet tip으로 scratch를 만든 후 silymarin을 처리한 결과 Figure 2A에서 보는 것과 같이 Huh7 cell의 migration에 의해 24시간, 48시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 25, 50, 100μg/mL의 농도로 silymarin을 처리한 세포의 경우에는 migration이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
분석 결과 Huh7 cell의 운동성에 의해 시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 silymarin을 처리한 세포는 운동성이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않았다. In vitro invasion assay에서도 silymarin을 처리한 세포의 이동이 현저히 억제되는 것을 볼 수 있었고 이 결과를 바탕으로 silymarin이 HCC인 Huh7 cell의 세포 운동성을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다. 그리고 silymarin에 의해 억제된 Huh7 cell의 운동성이 침윤과 전이를 억제하는지를 확인하기 위하여 EMT와 관련된 전이와 침윤 단백질의 발현을 분석하였다.
특히 silymarin의 주요 활성 성분 중 하나인 silibinin은 human lung cancer cell인 A549 cell line, human breast cancer cell인 MCF-7 cell line, human osteosarcoma cell인 MG63 cell line, prostate cancer cell 등의 다양한 암세포주에서 MAPKs 조절을 통해 전이와 침윤에 영향을 주는 여러 단백질들의 활성을 억제하는 결과를 보여왔다[6, 25, 26]. Silymarin의 침윤과전이 억제 기전을 분석한 결과 Akt의 인산화가 억제되는 것을 확인하였고 이는 선택적 저해제를 활용한 분석에서 검증되었다. 이 결과로 미루어보아 silymarin은 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성을 억제하여 간세포암인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 저해하는 것으로 나타났다.
Wound healing assay와 in vitro invasion assay 결과, silymarin은 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 활성이 있는 것으로 판단할 수 있었다. 그러므로 silymarin이 EMT 관련 유전자의 조절을 통해 이러한 활성을 보이는지를 확인하기 위하여 Huh7 cell내에서 발현되는 관련 단백질의 발현을 western blot analysis를 이용하여 분석하였다.
특히, 상위신호전달물질 중 silymarin은 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt의 인산화 억제를 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 것으로 나타났고 이것은 selective inhibitor인 LY294002의 처리 결과로 확인할 수 있었다. 결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다. 이를 통해 silymarin이 간세포암의 전이 억제에 효과적인 항암물질의 후보가 될 수 있는 잠재력을 가진 후보물질이 될 수 있음을 보여주었다.
Huh7 cell의 침윤과 전이 활성을 분석하기 위하여 wound healing assay와 in vitro invasion assay를 시행하였고 EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현 분석을 위해 Western blot assay를 실시하였다. 그 결과 silymarin은 농도 의존적으로 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하였다. EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor (NF)-κB 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
그리고 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 또한 silymarin에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
그리고 이러한 EMT 관련 유전자들의 발현 조절은 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 억제를 통한 것임을 알 수 있었다.
이 결과로 미루어보아 silymarin은 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성을 억제하여 간세포암인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 저해하는 것으로 나타났다. 그리로 이들의 상위신호전달물질을 분석한 결과 PI3K/Akt 신호전달체계로 인한 것임을 알 수 있었다.
또한 silymarin이 PI3K/Akt 신호전달경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절하는 지 검증하기 위하여 PI3K의 선택적 저해제인 LY294002를 20μM로 처리한 후 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현정도를 분석한 결과 Figure 6에서 보는 것과 같이 EMT 관련 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이들을 분석한 결과 Figure 3에서 보는 바와 같이 silymarin의 처리에 의해 농도의존적으로 E-cadherin의 발현은 증가하고 vimentin은 감소하는 결과를 볼 수 있었다. 또한, 세포외기질을 분해하여 종양세포의 전이를 돕는 MMP-9의 활성 또한 silymarin의 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 세포 내 여러 전사인자 중 Snail과 NF-κB는 EMT가 진행되는 동안 활성이 증가함으로써 종양세포의 침윤과 전이활성을 높이는 것으로 보고되고 있고[5], 본 실험에서 이 두 전사인자의 활성은 silymarin에 의해 유의적으로 억제되었다(Figure 4).
먼저 silymarin이 Huh7 cell에 미치는 세포 독성 효과를 알아본 결과 Figure 1에서 보는 바와 같이 silymarin을 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리했을 때 50, 100 μg/mL에서 10, 20%가량 세포생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
특히, Hsieh 등[12]의 연구에 의하면 간세포암세포주에서 NF-κB와 activator protein (AP)-1의 조절을 통해 MMP-9의 활성을 억제함으로써 침윤과 전이를 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서 E-cadherin과 vimentin을 분석한 결과 silymarin에 의해 농도 의존적으로 E-cadherin은 증가하고 vimentin과 MMP-9는 억제되었다. 그리고 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 또한 silymarin에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 연구에서는 간염의 치료에 효과적인 것으로 알려진 silymarin이 EMT 조절을 통해 간세포암의 침윤과 전이를 억제하는지를 밝히고자 하였다. 분석 결과 Huh7 cell의 운동성에 의해 시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 silymarin을 처리한 세포는 운동성이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않았다. In vitro invasion assay에서도 silymarin을 처리한 세포의 이동이 현저히 억제되는 것을 볼 수 있었고 이 결과를 바탕으로 silymarin이 HCC인 Huh7 cell의 세포 운동성을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 Huh7 cell의 EMT관련 유전자 조절에 어떤 신호전달물질이 관여하고, silymarin에 의해 조절되는지의 여부를 분석하였다. 실험 결과 Figure 5에서 보는 바와 같이 silymarin이 ERK, JNK, p38의 인산화에는 영향을 주지 못하였으나 Akt의 인산화는 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 silymarin이 PI3K/Akt 신호전달경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절하는 지 검증하기 위하여 PI3K의 선택적 저해제인 LY294002를 20μM로 처리한 후 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현정도를 분석한 결과 Figure 6에서 보는 것과 같이 EMT 관련 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이 결과로 미루어보아 silymarin은 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성을 억제하여 간세포암인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 저해하는 것으로 나타났다.
Figure 2B에서 보는 바와 같이 시료를 처리하지 않은 세포의 경우 transwell membrane을 통과하여 chamber의 아래쪽으로 많은 수의 세포가 이동한 것과 달리 silymarin을 처리한 세포의 경우 이동한 세포의 수가 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어보아 silymarin은 Huh7 cell의 cell migration과 in vitro에서의 침윤을 억제할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
그리고 세포 내 여러 전사인자 중 Snail과 NF-κB는 EMT가 진행되는 동안 활성이 증가함으로써 종양세포의 침윤과 전이활성을 높이는 것으로 보고되고 있고[5], 본 실험에서 이 두 전사인자의 활성은 silymarin에 의해 유의적으로 억제되었다(Figure 4). 이러한 결과로 미루어보아 silymarin은 Ecadherin 증가와 vimentin의 활성을 억제하여 Huh7 cell의 EMT 유도를 효과적으로 저해하고, 종양세포 주변 세포외기질의 재구성에 관여하는 효소인 MMP-9의 활성을 억제함으로써 종양세포의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 이러한 EMT 관련 유전자들의 발현 조절은 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 억제를 통한 것임을 알 수 있었다.
이를 바탕으로 silymarin은 Huh7 cell의 EMT 유도와 MMP-9의 활성을 조절함으로써 HCC의 침윤을 억제하였고 이것은 Snail과 NF-κB를 통한 것임을 알 수 있었다.
결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다. 이를 통해 silymarin이 간세포암의 전이 억제에 효과적인 항암물질의 후보가 될 수 있는 잠재력을 가진 후보물질이 될 수 있음을 보여주었다.
또한 silymarin이 PI3K/Akt 신호전달경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절하는 지 검증하기 위하여 PI3K의 선택적 저해제인 LY294002를 20μM로 처리한 후 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현정도를 분석한 결과 Figure 6에서 보는 것과 같이 EMT 관련 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절함으로써 Huh7 cell의 전이와 침윤을 억제하는 것으로 생각된다.
EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor (NF)-κB 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상위신호전달물질 중 silymarin은 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt의 인산화 억제를 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 것으로 나타났고 이것은 selective inhibitor인 LY294002의 처리 결과로 확인할 수 있었다. 결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	간세포암이 가진 특성은 무엇인가?	발생하는 간암 중 가장 주요한 형태인 간세포암은 강한 전이특성으로 인해 높은 재발율과 사망률을 보인다. Silymarin은 엉겅퀴에서 추출한 플라보노이드 성분으로 여러 암세포주에서 상피간엽전환(epithelial mesenchymal transition, EMT) 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었다.
	Silymarin은 암세포에서 어떤 효과를 보이는 것으로 보고되었는가?	발생하는 간암 중 가장 주요한 형태인 간세포암은 강한 전이특성으로 인해 높은 재발율과 사망률을 보인다. Silymarin은 엉겅퀴에서 추출한 플라보노이드 성분으로 여러 암세포주에서 상피간엽전환(epithelial mesenchymal transition, EMT) 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 silymarin이 EMT의 조절을 통해 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는지를 분석하고자 하였다.
	EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현이 silymarin 에 어떤 영향을 받는지 분석을 실시한 결과 상위신호전달물질이 어떤 과정을 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 지 알 수 있었으며 관련 물질은 무엇이었는가 ?	EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor $(NF)-{\kappa}B$ 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상위신호전달물질 중 silymarin은 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt의 인산화 억제를 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 것으로 나타났고 이것은 selective inhibitor인 LY294002의 처리 결과로 확인할 수 있었다. 결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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