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다중 PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어종의 신속한 종판별 분석법 개발

Development of the Duplex PCR Method of Identifying Trachurus japonicus and Trachurus novaezelandiae

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.9 = no.221, 2018년, pp.1062 - 1067  

박연정 (국립수산과학원 생명공학과) ,  이미난 (국립수산과학원 생명공학과) ,  김은미 (국립수산과학원 생명공학과) ,  노은수 (국립수산과학원 생명공학과) ,  노재구 (국립수산과학원 생명공학과) ,  박중연 (국립수산과학원 생명공학과) ,  강정하 (국립수산과학원 생명공학과)

초록
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국제 무역 및 전세계 수산물 소비의 증가로 인해 다양한 수산물이 국내로 수입되어 유통되고 있다. 최근 수입 수산물의 종명 및 원산지 표시사항을 허위로 기재하는 경우가 급증하여 식품안전성에 심각한 문제가 야기되고 있다. 불법적으로 유통되는 수산물의 안전관리를 위해 DNA 기반 기술을 이용한 종 판별법 마련이 시급하다. 본 연구에서는 전세계적으로 중요한 대형선망어업 어종 중 하나인 전갱이속 어류의 종을 판별하기 위해 duplex-PCR을 사용한 검출 방법을 개발하였다. 국내에 유통되는 T. japonicus과 T. novaezelandiae의 시료를 확보하여 COI 영역의 염기서열 분석을 통하여 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였으며, PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 2개의 종 특이적인 정방향 primer를 설계하였다. Duplex-PCR 분석 결과, T. japonicus (103 bp), T. novaezelandiae (214 bp)와 같은 단일 밴드를 전기영동상에서 확인 할 수 있었으며 상호간의 비 특이적 밴드는 형성되지 않았다. 또한 duplex-PCR 방법을 통한 T. japonicus과 T. novaezelandiae에서 최저 $0.01ng/{\mu}l$까지 검출됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 duplex-PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어류의 종 판별법은 정확도와 민감도가 우수하여 수산물의 수출입 및 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 수산물안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Reliable labeling of fish products can reassure consumers regarding the identity and quality of seafoods. Therefore, techniques that can identify adulteration or mislabeling are valuable. To rapidly identify two Trachurus species, Trachurus japonicus and Trachurus novaezelandiae, a highly efficient,...

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

  • 국외 연구의 경우 분자생물학적 방법을 이용한 계통분류학적 연구가 많이 수행되었으며, 주로 mtDNA의 cytochrome b, control region, 16S rRNA, 그리고 ND5 유전자 영역을 대상으로 전갱이속 어류를 분류하였다[9, 21]. 국제생물바코드컨소시엄(CBOL, Consortium for the Barcode of life)에서는 전세계 생물종의 분류를 위해 COI 유전자 영역을 생물종을 분류하기 위한 공통의 바코드 영역으로 제안하고 있으며[2], 이에 본 연구에서는 COI 유전자 영역을 분석하여 국내 유통되는 전갱이속 어류 2종을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 PCR 기법을 개발하고자 하였다.
  • 본 연구에서는 mtDNA의 cytochrome c oxidase I (COI) 유전자를 이용하여 국내에 유통되는 전갱이속 어류 T. japonicus와 T. novaezelandiae의 종간 유연관계를 분석하여, 신속ㆍ정확하게 각 종을 판별할 수 있는 종 특이적 primer를 개발하였다. 또한, 전갱이속 어류 2종을 동시에 감별이 가능한 duplex-PCR (multiplex PCR involving two primers simultaneously)법의 최적화된 조건을 확립하였다.
  • 다중 PCR 분석법을 이용한 연구들은 뱀장어류, 바리과 및 참서대과 어류 등 다양한 어종의 종판별에 활용되고 있다[5, 7, 18, 20]. 본 연구에서는 우리나라에 유통되는 전갱이속 어류 2종을 대상으로 mtDNA COI 유전자 영역을 분석하고, 종 특이적 primer를 제작하여 T. japonicus와 T. novaezelandiae를 동시에 판별할 수 있는 duplex-PCR 분석법을 개발하였다. 개발된 분석법은 감별력이 우수하여 전갱이속 어류의 정확한 판별이 가능하므로, 향후 수산물의 안정성 확보 및 유통질서 확립에 적극 활용될 것으로 기대된다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
전갱이의 자원량 감소 원인은? 우리나라의 전갱이 어획량은 1950년대에 약 5만톤까지 증가하였으나, 이후 점차 감소하여 현재에는 총허용가능어획량제(Total allowable catch, TAC)로 관리하여 매년 약 2만톤 내외로 어획되고 있다[10]. 이러한 전갱이의 자원량 감소는 무분별한 남획과 초기생활사에서 해양 환경요인에 민감하게 반응하는 전갱이의 특성에 따라 연안 오염의 증가로 인한 생태계 환경변화에 의한 것으로 볼 수 있다[13]. 이에 따라, 국내에서는 전갱이의 안정적인 공급을 위해 냉동 형태로 상당부분이 수입 유통되고 있는 실정이다(농수산식품수출지원정보, http:// www.
국내에 수입 유통되는 전갱이속 어류 T. japonicus와 T. novaezelandiae의 판별법을 연구하게 된 배경은? novaezelandiae가 확인되었다. T. japonicus 와 T. novaezelandiae은 형태적으로 매우 유사하여 육안으로 두 종을 구분하는 것은 매우 어려우며, 그로 인해 정확한 분류가 이루어지지 않은 채 유통이 이루어지고 있을 가능성이 매우 높은 상황이다.
다중 PCR 분석을 위한 종 특이적 primer의 개발을 위해서 필요한 조건은? navaezelandiae haplotype 40개를 확보하여 서열분석을 진행하여 3개의 SNP가 모두 종간 특이성을 나타냄을 확인하였다. 다중 PCR 분석을 위한 종 특이적 primer의 개발을 위해서는 an-nealing 온도 조건이 일치하고, 비특이적 PCR 반응이 일어나지 않아야 하며, PCR 증폭 산물의 크기가 서로 달라야 하는등 여러 가지 조건이 고려되어야 한다[18]. 이와 같은 조건을 충족시키며, PCR 산물이 종간 약 100 bp 이상의 차이를 나타낼 수 있는 최적의 specific primer를 개발하기 위해 493 bp와 607 bp의 SNP 위치에서 specific forward primer를 설계하였으며, 3’-말단에 SNP에 상보적인 nucleotide를 포함시켰다(Fig.
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참고문헌 (24)

  1. Aranishi, F., Okimoto, T. and Izumi, S. 2005. Identification of gadoid species (Pisces, Gadidae) by PCR-RFLP analysis. J. Appl. Genet. 46, 69-73. 

  2. Chakraborty, M. and Ghosh, S. K. 2014. An assessment of the DNA barcodes of Indian freshwater fishes. Gene 537, 20-28. 

  3. Chow, S., Nohara, K., Tanabe, T., Itoh, T., Tsuji, S., Nishikawa, Y., Uyeyanagi, S. and Uchikawa, K. 2003. Genetic and morphological identification of larval and small juvenile tunas (Pisces: Scombridae) caught by a mid-water trawl in the western Pacific. Bull. Fish. Res. Agen. 8, 1-14. 

  4. DiMauro, S. 2007. Mitochondrial DNA medicine. Biosci. Rep. 27, 5-9. 

  5. Fahmi, M. R., Solihin, D. D., Soewardi, K., Pouyaud, L., Shao, Z. and Berrebi, P. 2013. A novel semi-multiplex PCR assay for identification of tropical eels of genus Anguilla in Indonesian water. Fish. Sci. 79, 185-191. 

  6. Galtier, N., Nabholz, B., Glemin, S. and Hurst, G. D. D. 2009. Mitochondrial DNA as a marker of molecular diversity: a reappraisal. Mol. Ecol. 18, 4541-4550. 

  7. Hsieh, C. H., Chang, W. T., Chang, H. C., Hsieh, H. S., Chung, Y. L. and Hwang, D. F. 2010. Puffer fish-based commercial fraud identification in a segment of cytochrome b region by PCR-RFLP analysis. Food Chem. 121, 1305-1311. 

  8. Hwang, H. J., Kang, S. W., Park, S. Y., Chung, J. M., Song, D. K., Park, H. C., Park, H. S., Han, Y. S., Lee, J. S. and Lee, Y. S. 2016. Classification and Phylogenetic Studies of Cephalopods from four countries of South-East Asia. Kor. J. Malacol. 32, 55-62. 

  9. Karaiskou, N., Apostolidis, A. P., Triantafyllidis, A., Kouvatsi, A. and Triantaphyllidis, C. 2003. Genetic identification and phylogeny of three species of the genus Trachurus based on mitochondrial DNA analysis. Mar. Biotechnol. 5, 493-504. 

  10. Kim, B. K., Lee, H. H., Jeong, M. H., Cho, Y. J. and Shim, K. B. 2012. Effect of fermentation temperature and salt concentration on the quality of jack mackerel (Trachurus japonicus) fish sauce. J. Fish. Mar. Sci. Edu. 24, 755-762. 

  11. Kim, K. H., Lee, H. Y., Kim, Y. S., Kim, M. R., Jung, Y. K., Lee, J. H., Chang, H. S., Park, Y. C., Kim, S. Y., Choi, J. D. and Jang, Y. M. 2014. Development of species-specific PCR to determine the animal raw material. J. Fd. Hyg. Safety. 29, 347-355. 

  12. Kim, M. J. and Song, C. B. 2014. New record of the white trevally, Pseudocaranx dentes (Carangidae, Perciformes) from Korea. Kor. J. Ichthyol. 26, 340-344. 

  13. Lee, J. B., Lee, D. W., Choi, I. S. and Zhang, C. I. 2012. Forecasting biomass and recruits by age-structured spawner-recruit model incorporating environmental variables. J. Kor. Sco. Fish. Tech. 48, 445-451. 

  14. Lee, D. J., Kang, S. K., Jung, K. M. and Cha, H. K. 2016. Age and growth of jack mackerel Trachurus japonicas off jeju island, korea. Kor. J. fish. Aquat. Sci. 49, 648-656. 

  15. Moon, S. K., Kang, J. Y., Kim, I. S. and Jeong, B. Y. 2013. Change in proximate composition and lipid components in chub mackerel Scomber japonicus and Japanese jack mackerel Trachurus japonicus with various cooking methods. Kor. J. Fish. Aquat. Sci. 46, 708-716. 

  16. Nelson, J.S. 2006. Fishes of the world. 4th ed. John Wiley and Sons,Inc., Hoboken, NJ, p. 362. 

  17. Nichols, J. T. A key to the species of Trachurus. 1920. Bull. Am. Mus. Nat. Hist. 42, 477-481. 

  18. Noh, E. S., Kang, H. S., An, C. M., Park, J. Y., Kim, E. M and Kang, J. H. 2016. Rapid and specific identification of genus Cynoglossus by multiplex PCR assay using speciesspecific derived from the COI region. J. Life Sci. 26, 1007-1014. 

  19. Park, J. D., Kim, J. S., Choi, J. D., Choi, Y. J. and Cho, Y. J. 2003. Optimum formulation of starch and non-muscle protein for alkali surimi gel from frozen white croaker. J. Kor. Soc. Food. Sci. Nutr. 32, 1032-1038. 

  20. Park, Y. C., Jung, Y. H., Kim, M. R., Shin, J. H., Kim, K. H., Lee, J. H., Cho, T. Y., Lee, H. J., Lee, S. J. and Han, S. B. 2013. Development of detection method for Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus using 16S rRNA gene. Kor. J. Food Sci. Technol. 45, 1-7. 

  21. Poulin, E., Cardenas, L., Hernandez, C. E., Kornfield, I. and Ojeda, F. P. 2004. Resolution of the taxonomic status of Chilean and Californian jack mackerels using mitochondrial DNA sequence. J. Fish Biol. 65, 1160-1164. 

  22. Rocha-Olivares, A. and Chavez-Gonzalez, J. P. 2008. Molecular identification of dolphinfish species (genus Coryphaena) using multiplex haplotype-specific PCR of mitochondrial DNA. Ichthyol. Res. 55, 389-393. 

  23. Takashima, Y., Morita, T. and Yamashita, M. 2006. Complete mitochondrial DNA sequence of Atlantic horse mackerel Trachurus trachurus and molecular identification of two commercially important species T. trachurus and T. japonicus using PCR-RFLP. Fish. Sci. 72, 1054-1065. 

  24. Wakao, T. 1999. A simple DNA analysis for identifying eel species by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method. Nippon Suisan Gakkaishi 65, 391-399. 

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