국제 무역 및 전세계 수산물 소비의 증가로 인해 다양한 수산물이 국내로 수입되어 유통되고 있다. 최근 수입 수산물의 종명 및 원산지 표시사항을 허위로 기재하는 경우가 급증하여 식품안전성에 심각한 문제가 야기되고 있다. 불법적으로 유통되는 수산물의 안전관리를 위해 DNA 기반 기술을 이용한 종 판별법 마련이 시급하다. 본 연구에서는 전세계적으로 중요한 대형선망어업 어종 중 하나인 전갱이속 어류의 종을 판별하기 위해 duplex-PCR을 사용한 검출 방법을 개발하였다. 국내에 유통되는 T. japonicus과 T. novaezelandiae의 시료를 확보하여 COI 영역의 염기서열 분석을 통하여 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였으며, PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 2개의 종 특이적인 정방향 primer를 설계하였다. Duplex-PCR 분석 결과, T. japonicus (103 bp), T. novaezelandiae (214 bp)와 같은 단일 밴드를 전기영동상에서 확인 할 수 있었으며 상호간의 비 특이적 밴드는 형성되지 않았다. 또한 duplex-PCR 방법을 통한 T. japonicus과 T. novaezelandiae에서 최저 $0.01ng/{\mu}l$까지 검출됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 duplex-PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어류의 종 판별법은 정확도와 민감도가 우수하여 수산물의 수출입 및 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 수산물안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
국제 무역 및 전세계 수산물 소비의 증가로 인해 다양한 수산물이 국내로 수입되어 유통되고 있다. 최근 수입 수산물의 종명 및 원산지 표시사항을 허위로 기재하는 경우가 급증하여 식품안전성에 심각한 문제가 야기되고 있다. 불법적으로 유통되는 수산물의 안전관리를 위해 DNA 기반 기술을 이용한 종 판별법 마련이 시급하다. 본 연구에서는 전세계적으로 중요한 대형선망어업 어종 중 하나인 전갱이속 어류의 종을 판별하기 위해 duplex-PCR을 사용한 검출 방법을 개발하였다. 국내에 유통되는 T. japonicus과 T. novaezelandiae의 시료를 확보하여 COI 영역의 염기서열 분석을 통하여 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였으며, PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 2개의 종 특이적인 정방향 primer를 설계하였다. Duplex-PCR 분석 결과, T. japonicus (103 bp), T. novaezelandiae (214 bp)와 같은 단일 밴드를 전기영동상에서 확인 할 수 있었으며 상호간의 비 특이적 밴드는 형성되지 않았다. 또한 duplex-PCR 방법을 통한 T. japonicus과 T. novaezelandiae에서 최저 $0.01ng/{\mu}l$까지 검출됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 duplex-PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어류의 종 판별법은 정확도와 민감도가 우수하여 수산물의 수출입 및 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 수산물안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
Reliable labeling of fish products can reassure consumers regarding the identity and quality of seafoods. Therefore, techniques that can identify adulteration or mislabeling are valuable. To rapidly identify two Trachurus species, Trachurus japonicus and Trachurus novaezelandiae, a highly efficient,...
Reliable labeling of fish products can reassure consumers regarding the identity and quality of seafoods. Therefore, techniques that can identify adulteration or mislabeling are valuable. To rapidly identify two Trachurus species, Trachurus japonicus and Trachurus novaezelandiae, a highly efficient, rapid, duplex polymerase chain reaction (PCR) having two species-specific primers simultaneously was identified. This species-specific primer focused on a single nucleotide mismatch in the 3'-terminal base of a primer designed in the mitochondrial cytochrome c oxidase (COI) subunit I DNA. To optimize the duplex PCR condition, gradient PCR reactions were conducted to determine the primer annealing temperature and the primer concentration. The PCR's product was observed on the gel, suggesting that DNA molecules may be useful in differentiating the two species. The length of the amplification fragments were 103 bp for Trachurus japonicus and 214 bp for Trachurus novaezelandiae, which, along with the species-specific primer visualized by agarose gel electrophoresis, enabled accurate distinction of the species of the Trachurus genus. These results indicate that the duplex PCR, which has a species-specific primer based on single nucleotide polymorphism (SNP), can be useful for rapidly differentiating the two species of Trachurus. This duplex PCR analysis is simple, rapid, and reliable, and could be beneficial to protecting consumers' rights.
Reliable labeling of fish products can reassure consumers regarding the identity and quality of seafoods. Therefore, techniques that can identify adulteration or mislabeling are valuable. To rapidly identify two Trachurus species, Trachurus japonicus and Trachurus novaezelandiae, a highly efficient, rapid, duplex polymerase chain reaction (PCR) having two species-specific primers simultaneously was identified. This species-specific primer focused on a single nucleotide mismatch in the 3'-terminal base of a primer designed in the mitochondrial cytochrome c oxidase (COI) subunit I DNA. To optimize the duplex PCR condition, gradient PCR reactions were conducted to determine the primer annealing temperature and the primer concentration. The PCR's product was observed on the gel, suggesting that DNA molecules may be useful in differentiating the two species. The length of the amplification fragments were 103 bp for Trachurus japonicus and 214 bp for Trachurus novaezelandiae, which, along with the species-specific primer visualized by agarose gel electrophoresis, enabled accurate distinction of the species of the Trachurus genus. These results indicate that the duplex PCR, which has a species-specific primer based on single nucleotide polymorphism (SNP), can be useful for rapidly differentiating the two species of Trachurus. This duplex PCR analysis is simple, rapid, and reliable, and could be beneficial to protecting consumers' rights.
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문제 정의
국외 연구의 경우 분자생물학적 방법을 이용한 계통분류학적 연구가 많이 수행되었으며, 주로 mtDNA의 cytochrome b, control region, 16S rRNA, 그리고 ND5 유전자 영역을 대상으로 전갱이속 어류를 분류하였다[9, 21]. 국제생물바코드컨소시엄(CBOL, Consortium for the Barcode of life)에서는 전세계 생물종의 분류를 위해 COI 유전자 영역을 생물종을 분류하기 위한 공통의 바코드 영역으로 제안하고 있으며[2], 이에 본 연구에서는 COI 유전자 영역을 분석하여 국내 유통되는 전갱이속 어류 2종을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 PCR 기법을 개발하고자 하였다.
본 연구에서는 mtDNA의 cytochrome c oxidase I (COI) 유전자를 이용하여 국내에 유통되는 전갱이속 어류 T. japonicus와 T. novaezelandiae의 종간 유연관계를 분석하여, 신속ㆍ정확하게 각 종을 판별할 수 있는 종 특이적 primer를 개발하였다. 또한, 전갱이속 어류 2종을 동시에 감별이 가능한 duplex-PCR (multiplex PCR involving two primers simultaneously)법의 최적화된 조건을 확립하였다.
다중 PCR 분석법을 이용한 연구들은 뱀장어류, 바리과 및 참서대과 어류 등 다양한 어종의 종판별에 활용되고 있다[5, 7, 18, 20]. 본 연구에서는 우리나라에 유통되는 전갱이속 어류 2종을 대상으로 mtDNA COI 유전자 영역을 분석하고, 종 특이적 primer를 제작하여 T. japonicus와 T. novaezelandiae를 동시에 판별할 수 있는 duplex-PCR 분석법을 개발하였다. 개발된 분석법은 감별력이 우수하여 전갱이속 어류의 정확한 판별이 가능하므로, 향후 수산물의 안정성 확보 및 유통질서 확립에 적극 활용될 것으로 기대된다.
제안 방법
3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 양방향으로 dye-termination 반응을 수행하였다. Sequencing PCR 조건은 96℃에서 2분간 변성시키고 96℃에서 15초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분씩 총 25회 반복하였다.
COI 유전자 증폭을 위한 PCR 반응액의 조성은 1 μl의 DNA, 0.5 units의 DNA Taq (Anti-HS Taq, TNT Research, Seoul, Korea), dNTP 250 μM, 1x PCR buffer (2mM MgCl2), 10 pmol의 VF2 (5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3)’와 FishR2 (5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’)를 혼합하여 최종 용량은 20 μl로 하였다.
MagExtractor genome DNA purification kit (Toyobo, Japan)를 사용하여 시료의 근육 조직에서 genomic DNA를 추출하였다. 각 시료 20 mg을 1.
5 μl로 구성되었다. PCR 반응은 ABI 2720 Thermocycler (Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며, 최적의 PCR 반응 조건은 95℃에서 10분 초기 변성 후, 94℃ 45초 변성, 60℃ 45초 재결합, 72℃ 45초중합 반응 등의 과정을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 처리하였다. PCR 증폭 산물 4 μl를 취하여 2% 아가로스 겔로 전기영동 하였다.
PCR 증폭 산물 4 μl를 취하여 2% 아가로스 겔로 전기영동 하였다. PCR 산물의 크기 확인은 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였으며, 전기영동 완료 후 UV 투영기(ATTO E-graph, AE-9000, Takara, Japan)를 이용하여 결과를 확인하였다.
5 units의 DNA Taq (Anti-HS Taq, TNT Research, Seoul, Korea), dNTP 250 μM, 1x PCR buffer (2mM MgCl2), 10 pmol의 VF2 (5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3)’와 FishR2 (5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’)를 혼합하여 최종 용량은 20 μl로 하였다. PCR 증폭 반응은 ABI 2720 Thermocycler를 이용하였으며, 95℃에서 10분간 초기 변성 후, 94℃ 1분, 54℃ 1분, 72℃ 1분으로 구성된 연쇄반응을 35회 반복한 후 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR 증폭 산물은 agarose gel 전기영동을 통해 증폭 유무를 확인하였으며, Expin PCR SV (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였다.
PCR 증폭 산물 4 μl를 취하여 2% 아가로스 겔로 전기영동 하였다.
PCR 증폭 반응은 ABI 2720 Thermocycler를 이용하였으며, 95℃에서 10분간 초기 변성 후, 94℃ 1분, 54℃ 1분, 72℃ 1분으로 구성된 연쇄반응을 35회 반복한 후 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR 증폭 산물은 agarose gel 전기영동을 통해 증폭 유무를 확인하였으며, Expin PCR SV (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI BigDye Terminator v.
1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 양방향으로 dye-termination 반응을 수행하였다. Sequencing PCR 조건은 96℃에서 2분간 변성시키고 96℃에서 15초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분씩 총 25회 반복하였다. Sequencing PCR로 증폭된 DNA에 50 ml EDTA (pH 8.
nih) 유전자 은행에 등록된 염기서열과 비교하였으며, NCBI에 등록된 동일유전자 영역의 염기서열을 함께 활용하여 종 특이 primer를 설계하였다. mtDNA의 COI 영역을 표적으로 하는 종 특이 primer의 설계를 위해 point mutation에 의해 나타나는 종내 변이 유전자를 배제하고 모든 개체의 염기서열이 일치하는 동시에 종간 특이성을 나타내는 SNP(single nucleotide polymorphism)을 확인하였다. 종 특이 primer의 제작은 SNP이 3’ 말단에 위치하도록 2개의 종 특이 primer를 제작하였으며, 제작된 종 특이 primer는 서로 비슷한 Tm값을 가지며 30% 이상의 GC 비율과 self-dimer을 고려하여 제작하였다(Table 1).
그 후 70% ethanol로 세척하였으며, 상온에서 10분간 건조시킨 후 10 μl Hi-Di formamide (Applied Biosystems, USA)로 DNA pellet을 녹여 ABI 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
염기서열분석으로 얻어진 전갱이속 어류에 대한 양방향 서열은 SeqMan program (DNASTAR Inc, USA)을 사용하여 각각 assemble하였다. 얻어진 COI 염기서열은 미국의 National Center for biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih) 유전자 은행에 등록된 염기서열과 비교하였으며, NCBI에 등록된 동일유전자 영역의 염기서열을 함께 활용하여 종 특이 primer를 설계하였다. mtDNA의 COI 영역을 표적으로 하는 종 특이 primer의 설계를 위해 point mutation에 의해 나타나는 종내 변이 유전자를 배제하고 모든 개체의 염기서열이 일치하는 동시에 종간 특이성을 나타내는 SNP(single nucleotide polymorphism)을 확인하였다.
염기서열분석으로 얻어진 전갱이속 어류에 대한 양방향 서열은 SeqMan program (DNASTAR Inc, USA)을 사용하여 각각 assemble하였다. 얻어진 COI 염기서열은 미국의 National Center for biotechnology Information (NCBI, www.
이와 같은 조건을 충족시키며, PCR 산물이 종간 약 100 bp 이상의 차이를 나타낼 수 있는 최적의 specific primer를 개발하기 위해 493 bp와 607 bp의 SNP 위치에서 specific forward primer를 설계하였으며, 3’-말단에 SNP에 상보적인 nucleotide를 포함시켰다(Fig. 1).
종 특이 primer의 제작은 SNP이 3’ 말단에 위치하도록 2개의 종 특이 primer를 제작하였으며, 제작된 종 특이 primer는 서로 비슷한 Tm값을 가지며 30% 이상의 GC 비율과 self-dimer을 고려하여 제작하였다(Table 1). 전갱이속 2종에 대한 종별 특이 forward primer의 교차 반응 여부 및 최적 온도를 확인하기 위해서 singleplex-PCR을 진행하였다. 최적 조건을 설정하기 위해 56℃에서 65℃까지 10개의 온도를 설정하고 PCR을 수행하였다.
novaezelandiae (TN493F/ FishR2)의 경우 55~63℃에서 종 특이적인 증폭 반응이 일어났으며, 비특이적 증폭 산물이 관찰되지 않았다. 전갱이속 어류 2종 모두에서 뚜렷한 유전자 증폭을 보인 온도는 58℃에서 61℃로, 60℃를 duplex-PCR을 위한 적정 온도로 설정하였다.
전갱이속 어류의 동시 감별에 대한 duplex-PCR의 민감도 검사를 위해 genomic DNA를 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0.1 ng/μl, 0.01 ng/μl, 0.001 ng/μl으로 희석하여 실험하였다.
제작된 종 특이 forward primer는 gradient PCR을 통해 교차반응 여부 검사를 진행하였다. 그 결과, T.
종 특이 primer의 제작은 SNP이 3’ 말단에 위치하도록 2개의 종 특이 primer를 제작하였으며, 제작된 종 특이 primer는 서로 비슷한 Tm값을 가지며 30% 이상의 GC 비율과 self-dimer을 고려하여 제작하였다(Table 1).
전갱이속 2종에 대한 종별 특이 forward primer의 교차 반응 여부 및 최적 온도를 확인하기 위해서 singleplex-PCR을 진행하였다. 최적 조건을 설정하기 위해 56℃에서 65℃까지 10개의 온도를 설정하고 PCR을 수행하였다.
대상 데이터
본 연구에서는 2014년 뉴질랜드에서 수입되어 국립수산과학원 생명공학과 수산생명자원 수장고에 보관중인 T. novaezelandiae의 표본 시료 16개체와 국내 여수, 통영 및 제주에 서식하는 T. japonicus의 표본 시료 16개체를 분석에 사용하였다.
이론/모형
Identification of species of genus Trachurus using the duplex-PCR. Eight specimens of each species were used for the duplex-PCR. Lane: (M) 100 bp DNA ladder (iNtRON, South Korea)
성능/효과
EF609485)의 COI 유전자와 99% 상동성이 나타남을 확인 하였다. DNA Sequece Polymorphism (DnaSP, ver. 5.10.01) 프로그램을 사용하여 종별 haplotype을 분석한 결과 T. novaezelandiae는 3개의 haplotype이 나타났으며, T. japonicus는 1개의 동일한 haplotype이 나타났다. 종내 유전적 변이를 배제하고 종 특이성을 나타내는 SNP은 493, 607, 622 위치에서 나타났다(Fig.
Duplex-PCR 방법의 검출 한계는 T. japonicus와 T. novaezelandiae에서 모두 최저 0.1 ng/μl까지 검출됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
novaezelandiae는 214 bp의 크기로 2종이 뚜렷하게 구별되었다. Primer dimer 및 상호간의 비특이적인 증폭은 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
제작된 종 특이 forward primer는 gradient PCR을 통해 교차반응 여부 검사를 진행하였다. 그 결과, T. japonicus (TJ607F/FishR2)의 경우 58~61℃, T. novaezelandiae (TN493F/ FishR2)의 경우 55~63℃에서 종 특이적인 증폭 반응이 일어났으며, 비특이적 증폭 산물이 관찰되지 않았다. 전갱이속 어류 2종 모두에서 뚜렷한 유전자 증폭을 보인 온도는 58℃에서 61℃로, 60℃를 duplex-PCR을 위한 적정 온도로 설정하였다.
동일한 양의 forward primer를 넣은 duplex-PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 각각의 종은 선명한 DNA 증폭을 나타냈으며, 증폭된 산물의 크기에 따라 T. japonicus는 103 bp, T. novaezelandiae는 214 bp의 크기로 2종이 뚜렷하게 구별되었다. Primer dimer 및 상호간의 비특이적인 증폭은 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
두 전갱이속 어류의 미토콘드리아 COI 유전자 영역 640bp의 비교를 통해서 두 종간 특이성을 나타내는 3개의 SNP(493 bp, 607 bp, 622 bp)를 확인하였으며, 추가적으로 이들 SNP가 종내 변이 혹은 종간 특이성인지를 명확하게 확인하기 위하여 NCBI에 등록된 T. japonicus haplotype 15개와 T. navaezelandiae haplotype 40개를 확보하여 서열분석을 진행하여 3개의 SNP가 모두 종간 특이성을 나타냄을 확인하였다.
novaezelandiae의 종간 유연관계를 분석하여, 신속ㆍ정확하게 각 종을 판별할 수 있는 종 특이적 primer를 개발하였다. 또한, 전갱이속 어류 2종을 동시에 감별이 가능한 duplex-PCR (multiplex PCR involving two primers simultaneously)법의 최적화된 조건을 확립하였다. 향후 이를 바탕으로 시중에 유통되는 전갱이속 어류의 종 판별에 적용하여 안전한 수산물 유통체계 확립 및 국내외 전갱이속 어종의 수산자원관리에 기여하고자 한다.
novaezelandiae는 전갱이속 어류 중에서도 유전적으로 매우 가까운 것으로 보고되었다[9, 21]. 본 연구에서 분석된 COI 유전자영역을 기준으로 두 종을 비교하였을 경우 유전적 차이는 약 0.5%로 확인이 되었으며, 이는 선행 연구들을 뒷받침할 수 있는 과학적인 근거로서 활용될 수 있을 것이다.
염기서열분석을 통해 얻어진 약 640 bp의 염기서열을 NCBI 유전자 은행에 등록된 염기서열 정보와 비교한 결과, T. japonicus (Accession No. AP003092), T. novaezelandiae (Accession No. EF609485)의 COI 유전자와 99% 상동성이 나타남을 확인 하였다. DNA Sequece Polymorphism (DnaSP, ver.
1). 최적화된 PCR 조건을 이용하여 duplex-PCR을 수행한 결과 T. japoniucs는 103 bp, T. novaezelandiae는 214 bp에서 증폭이 일어나는 것을 확인할 수 있었으며, 상호간에 비 특이적인 증폭은 나타나지 않았다(Fig. 2).
후속연구
novaezelandiae를 동시에 판별할 수 있는 duplex-PCR 분석법을 개발하였다. 개발된 분석법은 감별력이 우수하여 전갱이속 어류의 정확한 판별이 가능하므로, 향후 수산물의 안정성 확보 및 유통질서 확립에 적극 활용될 것으로 기대된다.
또한, 전갱이속 어류 2종을 동시에 감별이 가능한 duplex-PCR (multiplex PCR involving two primers simultaneously)법의 최적화된 조건을 확립하였다. 향후 이를 바탕으로 시중에 유통되는 전갱이속 어류의 종 판별에 적용하여 안전한 수산물 유통체계 확립 및 국내외 전갱이속 어종의 수산자원관리에 기여하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
전갱이의 자원량 감소 원인은?
우리나라의 전갱이 어획량은 1950년대에 약 5만톤까지 증가하였으나, 이후 점차 감소하여 현재에는 총허용가능어획량제(Total allowable catch, TAC)로 관리하여 매년 약 2만톤 내외로 어획되고 있다[10]. 이러한 전갱이의 자원량 감소는 무분별한 남획과 초기생활사에서 해양 환경요인에 민감하게 반응하는 전갱이의 특성에 따라 연안 오염의 증가로 인한 생태계 환경변화에 의한 것으로 볼 수 있다[13]. 이에 따라, 국내에서는 전갱이의 안정적인 공급을 위해 냉동 형태로 상당부분이 수입 유통되고 있는 실정이다(농수산식품수출지원정보, http:// www.
국내에 수입 유통되는 전갱이속 어류 T. japonicus와 T. novaezelandiae의 판별법을 연구하게 된 배경은?
novaezelandiae가 확인되었다. T. japonicus 와 T. novaezelandiae은 형태적으로 매우 유사하여 육안으로 두 종을 구분하는 것은 매우 어려우며, 그로 인해 정확한 분류가 이루어지지 않은 채 유통이 이루어지고 있을 가능성이 매우 높은 상황이다.
다중 PCR 분석을 위한 종 특이적 primer의 개발을 위해서 필요한 조건은?
navaezelandiae haplotype 40개를 확보하여 서열분석을 진행하여 3개의 SNP가 모두 종간 특이성을 나타냄을 확인하였다. 다중 PCR 분석을 위한 종 특이적 primer의 개발을 위해서는 an-nealing 온도 조건이 일치하고, 비특이적 PCR 반응이 일어나지 않아야 하며, PCR 증폭 산물의 크기가 서로 달라야 하는등 여러 가지 조건이 고려되어야 한다[18]. 이와 같은 조건을 충족시키며, PCR 산물이 종간 약 100 bp 이상의 차이를 나타낼 수 있는 최적의 specific primer를 개발하기 위해 493 bp와 607 bp의 SNP 위치에서 specific forward primer를 설계하였으며, 3’-말단에 SNP에 상보적인 nucleotide를 포함시켰다(Fig.
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