[논문]갯버들 추출물의 항산화 및 미백활성 연구

정용운; 박영진

doi:10.15230/scsk.2018.44.3.317

갯버들 추출물의 항산화 및 미백활성 연구
Studies on Antioxidant and Whitening Activities of Salix gracilistyla Extracts 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.44 no.3, 2018년, pp.317 - 325

정용운 (건국대학교 의료생명대학 바이오융합과학부, 의료생명연구소) , 박영진 (건국대학교 의료생명대학 바이오융합과학부, 의료생명연구소)

초록
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본 연구는 갯버들 추출물의 항산화 활성 및 미백활성을 평가하기 위해 수행하였다. 갯버들 줄기의 용매별 추출물의 총 폴리페놀 함량은 142.60-151.95 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 83.43-2.60 mg CE/g으로 확인되었다. 갯버들 줄기의 용매별 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성을 평가한 결과 30% 메탄올 추출물이 가장 높은 항산화 활성($IC_{50}$; $19.68{\mu}g/mL$)을 나타내었다. Tyrosinase 억제활성은 4종류의 용매 추출물 모두 유사하게 평가되었으며, 30% 에탄올 추출물 $200{\mu}g/mL$ 농도가 가장 높은 억제활성(35.18%)을 나타내었다. 갯버들 추출물 중 메탄올 추출물은 B16F10 세포주의 생존율에 영향을 미치지 않은 농도에서 유의적으로 멜라닌 생합성을 저해하는 것으로 확인되었다. 결과적으로 갯버들 추출물은 항산화 및 미백활성을 가지는 효과적인 화장품 성분으로 사용 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to evaluate the antioxidant and whitening activities of Salix gracilistyla extracts. The total polyphenol contents of the extracts were 142.60-151.95 mg GAE/g and total flavonoid contents were 83.43-92.60 mg CE/g. In 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay, the 30% methanol extract showed the highest antioxidant activity ($IC_{50}$; $19.68{\mu}g/mL$). Tyrosinase inhibitory activity was similar in all four solvent extracts, and the highest inhibitory activity (35.18%) was obtained at a concentration of $200{\mu}g/mL$ of 30% ethanol extract. In addition, methanol extracts did not affect cell viability at all treatment concentrations and were found to significantly reduce the melanin content of B16F10 cells. As a result, it is considered that Salix gracilistyla extracts can be used as an effective cosmetic ingredient having antioxidant and whitening activity.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 국내의 다양한 지역에 널리 분포하고 있는 갯버들에 대한 연구는 미흡한 실정이며, 특히 피부 기능 개선을 위한 생리활성 연구도 거의 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 갯버들의 새로운 화장품 소재로써의 가능성을 확인하기 위하여 갯버들 줄기 용매별 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석, DPPH radical 소거능 분석을 통한 항산화 효과, tyrosinase 억제활성 및 B16F10세포주의 멜라닌 생합성 억제능 평가를 통한 미백 효과를 확인하고자 하였다.
식물유래 소재에 많이 함유되어 있는 몇몇 페놀 화합물은 지질 과산화를 막고 DNA 산화 손상을 방지하며, 대사과정 중 생성되는 활성 산소 종(¹O₂, H₂O₂, OH)을 제거하는 능력이 있다고 보고되었다[34,37]. 특히 버드나무는 항산화능[18], 항염[19], 항비만[20], 항암[21] 등 다양한 생리활성이 있는 것으로 보고되어 본 연구에서는 갯버들(S. graci-listyla)을 대상으로 항산화 및 미백 효과를 규명하고자 하였다. 갯버들 줄기의 용매별 추출물 또한 DPPH radical 을 소거하는 항산화 효능을 나타내었으며, tyrosinase 활성이 추출물 처리 농도에 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다.

제안 방법

14,000 rpm으로 20 min 동안 원심 분리하여 회수된 세포에 1 N NaOH 150 µL (10% DMSO)를 첨가하여 1 h 동안 60 ℃에서 반응하고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포내 멜라닌 함량을 분석하였다.
반응 후 10% AlCl₃ 15 µL를 첨가하고, 6 min 추가 반응한 후, 시마즈 UV-1800 분광기를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 표준시료로 사용하였고, 총 플라보노이드 함량은 건조 추출물 무게(g)에 대한 catechin equivalents (CE)의 무게(mg)로 표현하였다.
40 µL (1 mg/mL) 시료 추출물을 20 µL의 FC 시약 및 20% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 60 µL와 혼합하여 10 min간 반응하고, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준시료로 사용하였고, 총 페놀 함량은 건조 추출물 무게(g)에 대한 gallic acid equivalents (GAE)의 무게(mg)로 표현하였다. 총 플라보노이드 함량은 Dewanto et al.
Tyrosinase 저해 활성이 확인된 갯버들 용매별 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 분석하기 위해 B16F10 세포주에 대한 MTT 분석을 수행하였다(Figure3). 세포 생존율 분석결과, 70% 메탄올 및 30% 에탄올 추출물은 처리된 모든 농도(6.
총 플라보노이드 함량은 Dewanto et al.[24]에 의해 기술된 방법을 변형하여 분석하였다. 25 µL (1 mg/mL) 시료 추출물을 125 µL의 멸균증류수와 5% NaNO₂ 용액 8 µL와 혼합하여 5 min 간 반응하였다.
갯버들 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 100 µL의 DPPH 용액(0.
갯버들의 용매별 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능을 통하여 분석하였다. DPPH는 매우 안정한 자유라디칼이며, 일반적으로 항산화제의 DPPH에 대한 수소공여능 또는 라디칼 소거능을 통하여 항산화능을 측정한다[29].
또한 각 용매별 갯버들 추출물의 농도를 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 µg/mL로 달리하여 DPPH radical 소거활성을 분석하였다.
70% 메탄올 추출물은 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었으며(Figure 3B), tyrosinase 저해 활성 분석 결과를 통하여 200 µg/mL 이상의 농도에서도 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 범위에서 더욱 효과적인 tyrosinase저해능이 나타날 것으로 사료된다. 또한, 갯버들 용매별 추출물 처리로 인한 tyrosinase 활성 억제가 멜라닌 함량 감소에도 영향을 미치는가를 평가하기 위해 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 분석하였다. 그 결과, 갯버들 용매별 추출물 중 50 µg/mL 농도의 30% 메탄올 추출물을 제외한 모든 용매별 추출물 처리는 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 감소시키는 것이 확인되었다(Figure 4).
8) 40 µL와 2 mML-tyrosine 35 µL를 혼합하고 250 U/mL의 mushroom ty-rosinase 5 µL를 첨가하여 37 ℃에서 10 min간 반응하였다. 반응 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여 ty-rosinase 저해활성을 평가하였다. 상대적 tyrosinase 저해활성을 양성대조군(arbutin)과 비교하였으며, 다음의 공식에 의해 나타내었다.
배양이 완료되면 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, 100 µL의 dimethyl sulf-oxide (DMSO)를 첨가하여 MTT formazan crystal을 용해시키고 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
반응 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여 ty-rosinase 저해활성을 평가하였다. 상대적 tyrosinase 저해활성을 양성대조군(arbutin)과 비교하였으며, 다음의 공식에 의해 나타내었다.
추출 용매는 30% 에탄올, 70% 에탄올, 30% 메탄올, 70% 메탄올 4종류로 달리하여 사용하였으며, 분쇄된 2g의 갯버들 줄기를 각 4종류의 용매 50 mL와 혼합하고 75 ℃에서 2 h 동안 2회 환류 추출하였다. 여과지(Whatman No.2, GE Health care, UK)를 이용하여 각 용매별 추출물을 여과하고 감압농축기를 이용하여 30% 에탄올, 70% 에탄올, 30% 메탄올 및 70% 메탄올 추출 농축액을 각각 확보하였다.
본 연구에 사용된 갯버들은 JW 파마켐에서 제공받아 사용하였다. 추출 용매는 30% 에탄올, 70% 에탄올, 30% 메탄올, 70% 메탄올 4종류로 달리하여 사용하였으며, 분쇄된 2g의 갯버들 줄기를 각 4종류의 용매 50 mL와 혼합하고 75 ℃에서 2 h 동안 2회 환류 추출하였다. 여과지(Whatman No.

대상 데이터

Tyrosinase 활성 측정은 mushroom tyrosinase (Sigma, Korea)와 기질인 L-tyrosine (Sigma, Korea)을 사용하였다. 다양한 농도의 갯버들 용매별 추출물이 첨가된 0.
본 연구에 사용된 갯버들은 JW 파마켐에서 제공받아 사용하였다. 추출 용매는 30% 에탄올, 70% 에탄올, 30% 메탄올, 70% 메탄올 4종류로 달리하여 사용하였으며, 분쇄된 2g의 갯버들 줄기를 각 4종류의 용매 50 mL와 혼합하고 75 ℃에서 2 h 동안 2회 환류 추출하였다.
세포 생존율 평가는 American type culture collection(ATCC, CRL-6475)로부터 분양받은 B16F10 세포주를 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Fisher Scientific, Korea)과 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific, Korea)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Thermo Fisher Scientific, Korea)으로 37 ℃ (5% CO2)에서 배양하여 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하고 평균값 ± 표준편차로 결과를 나타내었다.
통계분석은 Prism (GraphPad Software Inc., USA) 프로그램을 사용하였으며, 처리구간 간의 유의성 검증은 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA) 및 Tukey’s test에 의한 사후검정을 통해 수행하였다.

이론/모형

총 폴리페놀 함량은 Dewanto et al.[24]에 의해 기술된 Folin-Ciocalteu (FC) 방법에 의해 분석하였다. 40 µL (1 mg/mL) 시료 추출물을 20 µL의 FC 시약 및 20% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 60 µL와 혼합하여 10 min간 반응하고, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

30% 에탄올 추출물은 통계 분석에 의해 세포 생존율에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었으나, 200 µg/mL 농도에서 세포 생존율이 다소 감소 하는 것이 확인되었다(Figure 3C).
70% 메탄올 추출물은 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었으며(Figure 3B), tyrosinase 저해 활성 분석 결과를 통하여 200 µg/mL 이상의 농도에서도 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 범위에서 더욱 효과적인 tyrosinase저해능이 나타날 것으로 사료된다.
IC50 값이 낮을 수록 높은 항산화 활성을 의미하며, 4종류의 용매(30% 메탄올 추출물, 70% 메탄올 추출물, 30% 에탄올 추출물, 70% 에탄올 추출물)를 사용하여 추출한 갯버들 추출물 중 30% 메탄올 추출물이 가장 낮은 IC50 값(19.68 µg/mL)을 나타내어 가장 높은 항산화 활성이 있음이 확인되었다.
갯버들 용매별 추출물의 tyrosinase 억제활성을 평가한 결과, 각 용매별 갯버들 추출물의 처리 농도(25, 50, 100, 200 µg/mL)에 따라 tyrosinase 활성이 억제됨을 확인하였다 (Figure 2). Tyrosinase 억제활성은 4종류의 용매 추출물 모두 유사하게 평가되었다. 그중 30% 에탄올 추출물은 25 µg/mL를 제외한 모든 농도에서 유의적으로 억제활성을 나타내었고, 200 µg/mL농도에서 가장 높은 억제 활성(35.
갯버들 용매별 추출물의 tyrosinase 억제활성을 평가한 결과, 각 용매별 갯버들 추출물의 처리 농도(25, 50, 100, 200 µg/mL)에 따라 tyrosinase 활성이 억제됨을 확인하였다 (Figure 2).
graci-listyla)을 대상으로 항산화 및 미백 효과를 규명하고자 하였다. 갯버들 줄기의 용매별 추출물 또한 DPPH radical 을 소거하는 항산화 효능을 나타내었으며, tyrosinase 활성이 추출물 처리 농도에 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다. 또한 B16F10 세포의 멜라닌 생합성이 갯버들 추출물 처리로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었다.
그 결과, 갯버들 용매별 추출물 중 50 µg/mL 농도의 30% 메탄올 추출물을 제외한 모든 용매별 추출물 처리는 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 감소시키는 것이 확인되었다(Figure 4).
그중 30% 에탄올 추출물은 25 µg/mL를 제외한 모든 농도에서 유의적으로 억제활성을 나타내었고, 200 µg/mL농도에서 가장 높은 억제 활성(35.18%)이 있는 것으로 확인되었다(Figure 2C).
또한 100 µg/mL 농도의 70% 메탄올 및 70% 에탄올 추출물은 각각 58.33% 및 57.10%로 알부틴 처리(0.5 mM)에 따른 감소율인 58.42%와 유사한 결과로 확인되었다.
94 mg GAE/g로 분석되었다. 또한 AlCl₃ 방법을 이용한 총 플라보노이드 분석에서 30% 메탄올 추출물 86.27, 70% 메탄올 추출물 83.43, 30% 에탄올 추출물 87.43 및 70% 에탄올 추출물 92.60 mg CE/g으로 70% 에탄올 추출물에서 총 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다(Table 1). 특히, 총 페놀 함량은 갯버들과 근연종인 흰버들의 에탄올 추출물에서 확인된 162.
갯버들 줄기의 용매별 추출물 또한 DPPH radical 을 소거하는 항산화 효능을 나타내었으며, tyrosinase 활성이 추출물 처리 농도에 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다. 또한 B16F10 세포의 멜라닌 생합성이 갯버들 추출물 처리로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 갯버들 추출물이 항산화 및 미백 활성을 갖는 기능성 화장품 소재로 활용이 가능하다는 것으로 시사한다.
또한 용매별 추출물의 농도를 달리하여 분석한 결과, 4종류의 용매 모두 100 µg/mL 농도에서 95% 이상의 DPPH radical 소거활성을 나타내었다 (Figure 1).
9 mgCE/g의 총 플라보노이드 함량이 분석되었다. 본 연구에서 확인된 갯버들 추출물의 총 플라보노이드 함량은 녹차 열수 추출물의 총 플라보노이드 함량보다 약 2배 정도 많음이 확인되었다.
세포 생존율 분석결과, 70% 메탄올 및 30% 에탄올 추출물은 처리된 모든 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 µg/mL)에서 B16F10 세포에 대한 생존율에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(Figure 3B, C).
42%와 유사한 결과로 확인되었다. 세포 생존율 분석에서 70% 에탄올 추출물은 모든 처리 농도에서 B16F10 세포의 생존율을 감소하는 것으로 확인되었으며(Figure 3), 메탄올 추출물은 모든 처리농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것이 확인되어, 갯버들 메탄올 추출물이 보다 효과적이며 안전한 미백소재로 활용 가능할 것으로 사료된다. 멜라닌 세포의 멜라닌 생성에는 대표적으로 mi-togen-activated protein kinase (MAPK) 및 cAMP 의존적 멜라닌 생합성 경로가 존재하며, 이러한 경로에는 ex-tracellular signal-regulated kinases (ERKs), p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK) 및 CREB 등 다양한 인자들이 관여하는 것으로 보고되었다[3].
용매에 따른 갯버들 추출물의 총 폴리페놀 및 총플라보노이드 함량을 Table 1에 나타내었다. 우선 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하여 분석한 갯버들의 30% 메탄올, 70% 메탄올, 30% 에탄올 및 70% 에탄올 추출물의 총 페놀 함량은 순서대로 151.95, 142.60, 151.03 및 150.94 mg GAE/g로 분석되었다. 또한 AlCl₃ 방법을 이용한 총 플라보노이드 분석에서 30% 메탄올 추출물 86.

후속연구

멜라닌 세포의 멜라닌 생성에는 대표적으로 mi-togen-activated protein kinase (MAPK) 및 cAMP 의존적 멜라닌 생합성 경로가 존재하며, 이러한 경로에는 ex-tracellular signal-regulated kinases (ERKs), p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK) 및 CREB 등 다양한 인자들이 관여하는 것으로 보고되었다[3]. 결과적으로 추가적인 연구를 통하여 갯버들 메탄올 추출물에 함유된 ty-rosinase 저해 활성을 가지는 활성 성분 및 멜라닌 생합성 경로에 관여된 인자들에 대한 작용 기작 규명이 필요하며, 이를 통해 새로운 미백 기능성 소재의 발굴이 가능할 것으로 사료된다.
이러한 폴리페놀은 활성산소를 제거하고, 플라보노이드는 free radical 소거효과로 다양한 질병을 예방하거나 개선할 수 있다고 보고되었다[31,32]. 따라서 갯버들 추출물의 DPPH radical 소거활성은 다양한 폴리페놀 및 플라보노이드에 의한 항산화 작용과 관련이 있을 것으로 사료된다.
8%의 상대 억제활성을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 갯버들 추출물 중 tyrosinase 억제활성이 있는 성분이 있다는 것을 의미하며, 향후 추가적인 분석을 통하여 미백활성이 있는 신규 물질의 발굴이 가능할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	자외선에 의한 멜라닌의 합성에 관여하는 인자와 합성의 유도 과정은 어떠한가?	인간의 피부와 모발의 색을 결정하는 멜라닌은 피오 멜라닌과 유멜라닌으로 구분되며, 멜라닌형성세포에 의해 생성되어 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 역할을 한다[1,2]. 자외선에 의한 멜라닌형성세포의 멜라닌의 합성에는 cAMP, protein kinase A (PKA), cAMP response element binding protein (CREB) 등 다양한 인자가 관여하며, 전사조절인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)에 의해 발현된 tyrosinase가 tyrosine을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)로, 또한 L-DOPA를 L-DOPA quinone으로 전환하여 멜라닌 합성이 유도된다[3]. 그러나 과도한 멜라닌의 생성은 피부의 색소 침착을 일으키고 특히 피오멜라닌은 피부 암을 유발할 가능성이 있다고 보고되었으며[4], 피부 건강뿐 아니라 미용적인 측면에서도 피부 미백에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있다.
	버드나무는 무엇인가?	버드나무는 버드나무 속(Salix Genus)에 속하는 낙엽 활엽 교목으로 약 400여 종이 전 세계에 분포한다[13]. 한국에서는 일반적으로 버드나무(S.
	S. alba의 껍질은 어떤 성분으로 이루어져 있는가?	alba의 껍질(white willow bark)은 예로부터 약용으로 사용되었으며, 해열⋅진통 작용을 한다는 것이 오래전부터 잘 알려져 있다[15,16]. 주요 성분으로는 아스피린의 전구체인 살리신이 대표적인 활성 성분이며, 이외에도 다양한 배당체와 탄닌및 방향족 알데히드류가 확인되었다[17]. 버드나무는 항산화능[18], 항염[19], 항비만[20], 항암[21] 등 다양한 생리활성이 있는 것으로 보고되었으며, 특히 버드나무 가지는 식품의약품 안전처의 식품공전에 등록되어 다양한 분야에 그 활용 가능성이 커지고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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