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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 중국산 및 국내산 복령의 약리활성의 차이점을 확인하기 위하여 3T3-L1 세포주를 이용한 지방축적 억제활성 시험 그리고 암세포주를 이용한 Sarcoma 180에 대한 항암활성의 차이점을 비교하였다. 이 중에서 중국산 복령과 국내산 복령은 항암활성에서 차이점을 보였다.
- 본 연구에서는 국내산 50% 에탄올 복령추출물(KPE)과 중국산 50% 에탄올 복령추출물(CPE)의 약리활성 비교를 위하여 전 지방세포주인 3T3-L1 세포주와 암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 지방축적 억제활성과 항암활성을 비교하였다. 또한 노지재배 및 시설재배의 1년산 복령과 2년 산 복령의 50% 에탄올 복령추출물(LPE, FPE)에 대해서도 50% 항암억제활성(IC50)로 중국산 복령과 비교하였다.
제안 방법
- CPE와 KPE의 지방축적 억제활성 비교시험은 300 μg/mL 농도에서 배양시간을 달리하여 비교하였다.
- CPE와 KPE의 활성시험을 위하여 KPE은 control (무처리구), 1, 10, 100, 그리고 300 μg/mL의 농도로 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 전 기간 동안 처리하였다.
- Fig. 1에서 보여주는 것처럼 세포가 완전하게 성장한 상태가 된 3T3-L1 전지방세포에 KPE를 1, 10, 100, 300, 1,000 μg/mL의 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 동안 세포생존율을 측정하였다.
- KPE의 세포독성 결과를 바탕으로 세포생존율에 영향을 미치지 않는 농도범위 (1~300 μg/mL)에서 분화 완료된 후 24, 48, 72, 96, 144시간까지 전 기간 동안 KPE를 처리한 후 세포 내 지방축적 억제활성을 확인하였다.
- 항암활성은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 SRB (sulforhodamine B) assay으로 측정하였다[12]. Sarcoma 180에 대한 시험물질의 효과를 평가하기 위하여 세포수의 측정은 시험물질을 처리한 well의 흡광도를 시험물질을 처치하지 않은 음성대조군 well의 흡광도로 나누어 %로 나타내었다. 한편 최근에 복령 수요가 증가함에 따라서 국내산 복령을 인공적으로 노지재배 및 시설재배로 생산하고 있다.
- 지방축적의 측정은 지방측정키트 (AdipoRed assay Reagent; Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하였고 측정법은 제조사의 지시서를 참조하였다. 간략하게 설명하면 배지는 2일마다 교체하였고 주어진 시간마다 세포 내 지방의 양을 측정하였다. 세포는 PBS (pH7.
- 따라서 본 시험에서는 세포주를 이용하여 지방축적 억제활성과 항암활성을 50% 에탄올 중국산 복령추출물(CPE), 50% 에탄올 국내산 복령추출물(KPE)로 비교하였다. 대량생산을 위한 재배법인 1년산과 2년산의 노지재배 50% 에탄올 복령추출물(50% ethanolic extract of Korean W. cocos cultivated in a landfill, LPE)과 1년산과 2년산의 시설재배 50% 에탄올 복령추출물(50% ethanolic extract of Korean W. cocos cultivated in a facility, FPE)에 대하여 항암활성에 대한 비교도 실시하였다.
- 5% carboxylmethylcellulose-ethyl alcohol-tween 80 (v/v/v 8:1:1)에 균질하게 현탁시키고, 12시간 절식 후 투여 직전에 측정한 체중에 따라 시험물질의 투여량을 산출하여 실험동물에 1회 경구투여하였다. 대조군에는 0.5% carboxylmethylcellulose-ethyl alcohol-tween 80 (v/v/v 8:1:1)를 투여하였다. 임상증상 관찰은 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 관찰하였으며, 투여 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰하였다.
- 중국산 및 국내산 50% 에탄올 복령추출물은 최종적으로 회전식 진공감압농축기(N-2110R; Sunileyela, Seongnam, Korea)로 농축 후에 동결건 조기(DRC-1000; Sunileyela)를 이용하여 동결건조하였다. 동결 건조된 추출물은 3T3-L1 세포 내 지 방축적 억제활성과 Sarcoma 180 암세포주에 대한 항암활성을 구명하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 실험에 사용하였다. 중국산 및 국내산 복령추출물을 제조하기 전에 농약잔류 분석을 한국분석기술연구소에 의뢰하여 250여종의 농약잔류성분을 신속다성분 동시분석법으로 실시하여 잔류농약이 없음을 확인하였다.
- 따라서 CPE와 KPE의 항암활성 측정시험은 1~300 μg/mL의 농도에서 실시를 하였다(Fig. 5).
- 국내에서 중국산 복령과 국내산 복령의 이화학적 분석 등을 통하여 원산지 판별 연구를 보고하였지만 약리활성에 관한 비교 연구는 많지 않았다. 따라서 본 시험에서는 세포주를 이용하여 지방축적 억제활성과 항암활성을 50% 에탄올 중국산 복령추출물(CPE), 50% 에탄올 국내산 복령추출물(KPE)로 비교하였다. 대량생산을 위한 재배법인 1년산과 2년산의 노지재배 50% 에탄올 복령추출물(50% ethanolic extract of Korean W.
- 따라서 본 연구에서는 국내산과 중국산 복령의 항암활성 차이에 집중하여 추가적으로 CPE, KPE를 기본으로 현재 인공재배 중인 국내산 노지복령 1년산 에탄올 추출물(1-LPE)과 2년산 에탄올 추출물(2-LPE), 국내산 시설복령 1년산(1-FPE) 그리고 국내산 시설복령 2년산(2-FPE) 에탄올 복령추출물을 1~300 μg/mL에서 항암활성을 측정하여 the half maximal inhibitory concentration (IC50)으로 비교하였다.
- 버섯류는 약리활성 중에서 항암활성이 가장 많이 알려져 있다는 것은 주지의 사실이다. 따라서 시 중에 유통 중인 중국산 복령추출물(CPE)과 국내산 복령추출물(KPE)에 대하여 항암표준세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 SRB법으로 측정을 하였다. Akihisa 등 [17, 18]은 복령의 항암효과를 증진시키는 성분으로는 25-methoxyporicoic acidA와 triterpene으로 알려져 있다.
- 한편 최근에 복령 수요가 증가함에 따라서 국내산 복령을 인공적으로 노지재배 및 시설재배로 생산하고 있다. 따라서 중국산 복령, 국내산 복령, 노지재배 복령(1년산 복령, 2년산 복령), 시설재배 복령(1년산 복령,과 2년산 복령)에 대하여 위의 방법에 따라 항암활성을 비교하였다.
- 이 중에서 중국산 복령과 국내산 복령은 항암활성에서 차이점을 보였다. 따라서 중국산 복령을 국내에서 인공 재배되는 노지재배 복령 그리고 시설재배 복령과 항암활성을 추가적으로 비교하였다. 복령은 식품으로 사용이 제한되는 버섯임에도 불구하고 유통 중인 중국산 및 국내산 복령추출물에 대한 안전성 시험이 없어 추가적으로 단회 경구 독성시험을 본 연구에서 실시하였다.
- 그럼에도 불구하고 현실에서는 복령분말 및 복령추출물은 이 범주를 넘어서 많은 제품에서 활용이 되고 있다. 따라서 현재 시중에서 유통되고 있는 CPE와 KPE의 단회 경구 독성을 실시하여 안전성을 검토하였다. 본 연구에서는 오랫동안 식품 및 식품보조첨가제로 사용되어 온 점을 감안하여 최고 투여용량인 2,000 mg/kg으로 마우스에 대해 단회 경구 독성을 실시하였다.
- 본 연구에서는 국내산 50% 에탄올 복령추출물(KPE)과 중국산 50% 에탄올 복령추출물(CPE)의 약리활성 비교를 위하여 전 지방세포주인 3T3-L1 세포주와 암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 지방축적 억제활성과 항암활성을 비교하였다. 또한 노지재배 및 시설재배의 1년산 복령과 2년 산 복령의 50% 에탄올 복령추출물(LPE, FPE)에 대해서도 50% 항암억제활성(IC50)로 중국산 복령과 비교하였다. 추가적으로 현재 시중에서 유통되고 CPE와 KPE의 안전성 자료를 획득하고자 단회 경구 독성시험을 실시하였다.
- 또한, 중국산 복령을 대체할 인공재배 복령도 수확시기별로 항암활성시험을 이용하여 비교하였다. 또한 유통 중인 중국산 복령과 국내산 복령을 단회 경구 독성시험을 실시하였다. 그 결과를 종합하면 중국산 복령과 국내산 복령은 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 억제작용의 차이점은 없었으나 Sarcoma 180 암세포주에 대하여 국내산 복령의 일정 농도에서 항암활성이 높은 것이 확인되었다.
- 본 연구에서는 대부분 수입에 의존하여 유통되고 있는 중국산 복령(CPE)과 현재 시중에서 유통되는 국내산 복령(KPE)에 대하여 복령의 대표적인 약리활성인 지방축적억제시험과 항암활성시험 법을 활성편차가 적은 표준세포주인 3TL-1 세포주와 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 비교하였다. 또한, 중국산 복령을 대체할 인공재배 복령도 수확시기별로 항암활성시험을 이용하여 비교하였다. 또한 유통 중인 중국산 복령과 국내산 복령을 단회 경구 독성시험을 실시하였다.
- 배양 및 유지는 RPMI1640 배지를 이용하였고 배지는 fetal bovine serum (FBS) 10%를 첨가하고, penicillin과 streptomycin을 각각 100 units/mL와 100 μg/mL의 농도가 되게 배양액에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다.
- 약리활성 측정 전에 중국산 복령 및 국내산 복령의 농약 성분의 잔류가 있으면 복령추출물을 농축 시 생리활성에 영향을 주기 때문에 한국분석기술연구소에서 250여종의 농약잔류 다성분 동시분석을 실시한 결과 농약 성분이 검출되지 않았다. 복령에 농약이 없음을 확인 한 후 재료 및 방법에 기술한 방법에 따라 CPE와 KPE를 제조하였다. 대표적으로 KPE을 갖고 3T3-L1 지방세포 내에서 지방축적을 억제하는지 평가하기 위해서 먼저 3T3-L1 세포에서의 세포독성을 평가하여 Fig.
- 따라서 중국산 복령을 국내에서 인공 재배되는 노지재배 복령 그리고 시설재배 복령과 항암활성을 추가적으로 비교하였다. 복령은 식품으로 사용이 제한되는 버섯임에도 불구하고 유통 중인 중국산 및 국내산 복령추출물에 대한 안전성 시험이 없어 추가적으로 단회 경구 독성시험을 본 연구에서 실시하였다.
- 10 분 후에 excitation 485 nm 그리고 emission 572 nm에서 측정하였다. 복령추출물을 처리하지 않은 대 조군을 lipid accumulation (% of control)으로 계산하여 복령추출물의 지방축적 억제활성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 대부분 수입에 의존하여 유통되고 있는 중국산 복령(CPE)과 현재 시중에서 유통되는 국내산 복령(KPE)에 대하여 복령의 대표적인 약리활성인 지방축적억제시험과 항암활성시험 법을 활성편차가 적은 표준세포주인 3TL-1 세포주와 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 비교하였다. 또한, 중국산 복령을 대체할 인공재배 복령도 수확시기별로 항암활성시험을 이용하여 비교하였다.
- 인공재배는 노지재배와 시설재배로 복령을 생산하고 있다. 본 연구에서는 앞에서 실험한 유통 중인 중국산 복령, 국내산 복령을 기본으로 1년산, 2년산 노지재배 복령 그리고 1년산, 2년산 시설재배 복령을 같은 방법으로 추출하여 항암활성을 비교하였다. 따라서 본 연구에서는 국내산과 중국산 복령의 항암활성 차이에 집중하여 추가적으로 CPE, KPE를 기본으로 현재 인공재배 중인 국내산 노지복령 1년산 에탄올 추출물(1-LPE)과 2년산 에탄올 추출물(2-LPE), 국내산 시설복령 1년산(1-FPE) 그리고 국내산 시설복령 2년산(2-FPE) 에탄올 복령추출물을 1~300 μg/mL에서 항암활성을 측정하여 the half maximal inhibitory concentration (IC50)으로 비교하였다.
- 따라서 현재 시중에서 유통되고 있는 CPE와 KPE의 단회 경구 독성을 실시하여 안전성을 검토하였다. 본 연구에서는 오랫동안 식품 및 식품보조첨가제로 사용되어 온 점을 감안하여 최고 투여용량인 2,000 mg/kg으로 마우스에 대해 단회 경구 독성을 실시하였다. KPE와 CPE을 마우스에 경구투여 후 관찰기간 14일 동안 모든 시험군에서 시험기간 동안 시험물질에 의한 독성증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았다.
- Akihisa 등 [17, 18]은 복령의 항암효과를 증진시키는 성분으로는 25-methoxyporicoic acidA와 triterpene으로 알려져 있다. 본 연구에서는 이들 성분들을 동시에 추출 가능한 50% 에탄올 추출법을 이용하여 시중에 유통중인 국내산 복령과 중국산 복령에 대하여 50% 에탄올을 용매추출물(CPE, KPE)를 제조하여 추출물에 대하여 항암활성을 비교하였다. 항암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 CPE와 KPE의 항암활성시험을 평가하기 전에 세포독성을 KPE로 먼저 실시하였다(Fig.
- 본 연구에서는 중국산과 국내산 복령의 효능 상의 차이를 알아보기 위하여 Fig. 2의 결과를 바탕으로 300 μg/mL의 농도에서 국내산 50% 에탄올 복령추출물(KPE)과 중국산 50% 에탄올 복령추출물(CPE)의 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 활성을 비교하여 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다.
- 처리하지 않은 3T3-L1 전지방세포의 흡광도를 대조군으로 하여 세포 생존율을 계산(% of control)하여 CPE와 KPE의 세포독성을 평가하였다. 세포독성 결과를 확인한 후에 활성 시험에 영향을 주지 않는 농도를 설정하였다. CPE와 KPE의 활성시험을 위하여 KPE은 control (무처리구), 1, 10, 100, 그리고 300 μg/mL의 농도로 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 전 기간 동안 처리하였다.
- 세포독성은 KPE 1, 10, 100, 300 그리고 1,000 μg/mL의 농도에서 실시하였다.
- 임상증상 관찰은 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 관찰하였으며, 투여 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰하였다. 시험 종료 후 실험동물을 CO2로 마취하여 복대동맥 절단방법으로 치사시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- 시험물질은 동결 건조된 KPE와 CPE을 0.5% carboxylmethylcellulose-ethyl alcohol-tween 80 (v/v/v 8:1:1)에 균질하게 현탁시키고, 12시간 절식 후 투여 직전에 측정한 체중에 따라 시험물질의 투여량을 산출하여 실험동물에 1회 경구투여하였다. 대조군에는 0.
- 5% carboxylmethylcellulose-ethyl alcohol-tween 80 (v/v/v 8:1:1)를 투여하였다. 임상증상 관찰은 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 관찰하였으며, 투여 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰하였다. 시험 종료 후 실험동물을 CO2로 마취하여 복대동맥 절단방법으로 치사시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- 중국산과 국내산 복령은 음건 세절한 후 50% 에탄올에 3시간 95℃에서 관류하면서 중국산 50% 에탄올 복령추출물(Chinese ethanolic 50% Wolfiporia cocos extract, CPE)과 국내산 50% 에탄올 복령추출물(Korean ethanolic 50% Wolfporia cocos extract, KPE)을 제조하였다. 중국산 및 국내산 50% 에탄올 복령추출물은 최종적으로 회전식 진공감압농축기(N-2110R; Sunileyela, Seongnam, Korea)로 농축 후에 동결건 조기(DRC-1000; Sunileyela)를 이용하여 동결건조하였다. 동결 건조된 추출물은 3T3-L1 세포 내 지 방축적 억제활성과 Sarcoma 180 암세포주에 대한 항암활성을 구명하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 실험에 사용하였다.
- 건조된 복령은 50mesh 이하로 균질화하여 시험에 이용하였다. 중국산과 국내산 복령은 음건 세절한 후 50% 에탄올에 3시간 95℃에서 관류하면서 중국산 50% 에탄올 복령추출물(Chinese ethanolic 50% Wolfiporia cocos extract, CPE)과 국내산 50% 에탄올 복령추출물(Korean ethanolic 50% Wolfporia cocos extract, KPE)을 제조하였다. 중국산 및 국내산 50% 에탄올 복령추출물은 최종적으로 회전식 진공감압농축기(N-2110R; Sunileyela, Seongnam, Korea)로 농축 후에 동결건 조기(DRC-1000; Sunileyela)를 이용하여 동결건조하였다.
- 세포독성은 KPE 1, 10, 100, 300 그리고 1,000 μg/mL의 농도에서 실시하였다. 처리하지 않은 3T3-L1 전지방세포의 흡광도를 대조군으로 하여 세포 생존율을 계산(% of control)하여 CPE와 KPE의 세포독성을 평가하였다. 세포독성 결과를 확인한 후에 활성 시험에 영향을 주지 않는 농도를 설정하였다.
- 또한 노지재배 및 시설재배의 1년산 복령과 2년 산 복령의 50% 에탄올 복령추출물(LPE, FPE)에 대해서도 50% 항암억제활성(IC50)로 중국산 복령과 비교하였다. 추가적으로 현재 시중에서 유통되고 CPE와 KPE의 안전성 자료를 획득하고자 단회 경구 독성시험을 실시하였다. CPE와 KPE를 3T3-L1 세포에 처리 후 48시간 이후에 대조군과 비교 시 지방축적 억제를 보였으나(p< 0.
- 사료는 수퍼피드의 실험동물용 사료를 구입하여 실험동물에 자유로이 공급하였으며, 음수는 1차 증류수를 자유롭게 섭취시켰다. 투여용량의 설정은 예비실험에서 복령추출물을 한계용량인 2,000 ㎎/㎏의 용량에서 사망동물이 관찰되지 않아 한계용량시험의 일환으로 최고용량을 2,000 ㎎/㎏으로 하고, 매체를 투여하는 매체 대조군만을 두었다. 단, 식품의약품 안전처의 '의약품등의 독성시험기준'에는 한계용량에 대한 기준을 참고하였다.
- 본 연구에서는 이들 성분들을 동시에 추출 가능한 50% 에탄올 추출법을 이용하여 시중에 유통중인 국내산 복령과 중국산 복령에 대하여 50% 에탄올을 용매추출물(CPE, KPE)를 제조하여 추출물에 대하여 항암활성을 비교하였다. 항암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용하여 CPE와 KPE의 항암활성시험을 평가하기 전에 세포독성을 KPE로 먼저 실시하였다(Fig. 4). 그 결과 300 μg/mL까지 90% 이상의 생존율을 보여 세포독성이 없음을 확인하였지만 1,000 μg/mL에서는 CPE는 79%, KPE는 77%의 세포의 생존율을 보였다.
대상 데이터
- 단, 식품의약품 안전처의 '의약품등의 독성시험기준'에는 한계용량에 대한 기준을 참고하였다. 각 군당 투여 마리 수는 암‧수 각 5마리로 정하였다(Table 1). 시험물질을 투여하기 직전 실험동물의 체중 범위는 수컷 34 ± 0.
- 중국산 복령은 서울약령시장(서울, 중구)에서 유통되는 1 kg 용량의 제품으로 세절 건조 제품 총 10 kg을 구입하여 실험에 사용하였다. 국내산 복령은 강원도산림과학연구원(강원도, 춘천)에서 제공 받은 강원도산을 이용하였다. 한편 인공 노지재배 1년산과 2년산 복령은 2017년 3월에 강원도산림 과학연구원에서 제공 받았다.
- 약용버섯에서 약리활성이 가장 많이 알려진 것은 항암활성이다. 그러므로 CPE와 KPE의 항암활성을 비교하기 위하여 Sarcoma180 세포주(KCLBno. 40066)를 사용하였다. 배양 및 유지는 RPMI1640 배지를 이용하였고 배지는 fetal bovine serum (FBS) 10%를 첨가하고, penicillin과 streptomycin을 각각 100 units/mL와 100 μg/mL의 농도가 되게 배양액에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다.
- 실험동물은 ICR계 마우스이며, 온도 23 ± 1℃, 습도 55 ± 5%, 배기 10~18회/시간, 형광등 명암 12 시간 주기, 조도 300~500 Lux의 사육환경에서 사육하였다. 사료는 수퍼피드의 실험동물용 사료를 구입하여 실험동물에 자유로이 공급하였으며, 음수는 1차 증류수를 자유롭게 섭취시켰다. 투여용량의 설정은 예비실험에서 복령추출물을 한계용량인 2,000 ㎎/㎏의 용량에서 사망동물이 관찰되지 않아 한계용량시험의 일환으로 최고용량을 2,000 ㎎/㎏으로 하고, 매체를 투여하는 매체 대조군만을 두었다.
- 실험동물은 ICR계 마우스이며, 온도 23 ± 1℃, 습도 55 ± 5%, 배기 10~18회/시간, 형광등 명암 12 시간 주기, 조도 300~500 Lux의 사육환경에서 사육하였다.
- 한편 인공 노지재배 1년산과 2년산 복령은 2017년 3월에 강원도산림 과학연구원에서 제공 받았다. 인공 시설재배 1년산과 2년산 복령은 류충헌버섯농장(경상북도, 안동)에서 제공 받았다. 제공 받은 모든 복령은 많은 미생물과 접촉이 되어있는 상태이므로 공기살균 청정기(Clean Care HAS-5001; EnpuTech, Gwangju, Korea)가 설치된 건조실에서 동일한 조건으로 오염 없이 건조하였다.
- 중국산 복령은 서울약령시장(서울, 중구)에서 유통되는 1 kg 용량의 제품으로 세절 건조 제품 총 10 kg을 구입하여 실험에 사용하였다. 국내산 복령은 강원도산림과학연구원(강원도, 춘천)에서 제공 받은 강원도산을 이용하였다.
데이터처리
- Letters with different superscripts are significantly different by ANOVA with Duncan’s multiple range test at p < 0.05 at each time point.
- Letters with different superscripts are significantly different by ANOVA with Duncan’s multiple range test at p < 0.05.
- 시험결과는 평균값과 표준편차로 표기하였으며, 통계학적 분석은 일원배치분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 실시하였으며 통계학적 유의성이 관찰되는 Duncan’s multiple comparison test를 실시하였다.
이론/모형
- 국내산 50% 에탄올 복령추출물(KPE)에 의한 지방축적 억제활성은 3T3-L1 지방세포모델을 이용하여 평가하였다. KPE의 세포독성 결과를 바탕으로 세포생존율에 영향을 미치지 않는 농도범위 (1~300 μg/mL)에서 분화 완료된 후 24, 48, 72, 96, 144시간까지 전 기간 동안 KPE를 처리한 후 세포 내 지방축적 억제활성을 확인하였다.
- 마우스 유래의 섬유아세포인 3T3-L1 세포 내에서 지방축적 억제활성을 실시하기 전에 적절한 농도를 설정하기 위하여 KPE에 대한 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2y-1)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)법으로 세포독성평가를 먼저 실시하였다[8]. 세포독성은 KPE 1, 10, 100, 300 그리고 1,000 μg/mL의 농도에서 실시하였다.
- CPE와 KPE의 지방축적 억제활성 비교시험은 300 μg/mL 농도에서 배양시간을 달리하여 비교하였다. 지방축적의 측정은 지방측정키트 (AdipoRed assay Reagent; Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하였고 측정법은 제조사의 지시서를 참조하였다. 간략하게 설명하면 배지는 2일마다 교체하였고 주어진 시간마다 세포 내 지방의 양을 측정하였다.
- 배양 및 유지는 RPMI1640 배지를 이용하였고 배지는 fetal bovine serum (FBS) 10%를 첨가하고, penicillin과 streptomycin을 각각 100 units/mL와 100 μg/mL의 농도가 되게 배양액에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다. 항암활성은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 SRB (sulforhodamine B) assay으로 측정하였다[12]. Sarcoma 180에 대한 시험물질의 효과를 평가하기 위하여 세포수의 측정은 시험물질을 처리한 well의 흡광도를 시험물질을 처치하지 않은 음성대조군 well의 흡광도로 나누어 %로 나타내었다.
성능/효과
- 300 μg/ mL의 농도에서 96시간 배양을 실시한 결과 CPE와 KPE는 3T3-L1 세포 내에서 각각 65%와 63%의 유사한 억제활성을 보였다.
- CPE와 KPE를 3T3-L1 세포에 처리 후 48시간 이후에 대조군과 비교 시 지방축적 억제를 보였으나(p< 0.05), CPE와 KPE 사이에서는 지방축적 억제활성의 차이가 없었다.
- Fig. 5에서 보여주는 것처럼 100 μg/mL에서 CPE와 KPE의 항암활성은 대조군과 그것과 비교할 때 64%와 66%의 암세포 성장 억제를 보였지만 유의한 수준은 아니었다.
- Sarcoma 180에 대한 CPE와 KPE의 항암활성을 비교할 때 시험한 농도에서 유사한 활성을 보였지만 300μg/mL의 고농도에서는 KPE가 CPE보다 높은 항암활성을 보였다(p < 0.05).
- 그 결과 300 μg/mL까지 90% 이상의 생존율을 보여 세포독성이 없음을 확인하였지만 1,000 μg/mL에서는 CPE는 79%, KPE는 77%의 세포의 생존율을 보였다.
- 그 결과 KPE는 처리 하지 않은 대조군의 세포생존율과 비교하여 1,000 μg/mL에서는 48시간 배양에서 80%의 생존율(p < 0.05), 72시간에서는 78%의 생존율(p < 0.05)을 보였지만, 300 μg/mL이하 의 농도에서는 72시간에 94%의 생존율을 보여 3T3-L1 전지방 세포의 생존율에 유의적인 영향을 미치지 않았다.
- 또한 유통 중인 중국산 복령과 국내산 복령을 단회 경구 독성시험을 실시하였다. 그 결과를 종합하면 중국산 복령과 국내산 복령은 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 억제작용의 차이점은 없었으나 Sarcoma 180 암세포주에 대하여 국내산 복령의 일정 농도에서 항암활성이 높은 것이 확인되었다. 또한 인공재배로 생산되는 노지재배 복령과 시설재배 복령의 수확시기별로 Sarcoma 180 암세 포주에 대한 항암활성은 차이가 없었다.
- 그 결과를 종합하면 중국산 복령과 국내산 복령은 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 억제작용의 차이점은 없었으나 Sarcoma 180 암세포주에 대하여 국내산 복령의 일정 농도에서 항암활성이 높은 것이 확인되었다. 또한 인공재배로 생산되는 노지재배 복령과 시설재배 복령의 수확시기별로 Sarcoma 180 암세 포주에 대한 항암활성은 차이가 없었다. 특히 유통되는 중국산 복령과 국내산 복령의 추출물은 ICR 계통의 마우스에서 단회 경구투여 시 2,000 mg/kg 이하의 용량에서 어떠한 독성 영향도 유발하지 않아 LD50는 최소한 2,000 mg/kg 이상이라는 것으로 나타났다.
- KPE와 CPE을 마우스에 경구투여 후 관찰기간 14일 동안 모든 시험군에서 시험기간 동안 시험물질에 의한 독성증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았다. 시험 종료 후 생존동물의 검시 KPE 그리고 CPE 투여군과 대조군 모두 내부 장기는 육안 상 이상소견이 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합하여 보면, KPE와 CPE를 마우스에 단회 경구투여 하였을 때 시험물질에 기인한 사망은 관찰되지 않았고 LD50 수치는 암‧수 모두에서 2,000 mg/kg 이상이었다(Table 2).
- 300 μg/ mL의 농도에서 96시간 배양을 실시한 결과 CPE와 KPE는 3T3-L1 세포 내에서 각각 65%와 63%의 유사한 억제활성을 보였다. 이러한 결과는 국내산과 중국산 복령은 모두 자연산으로 소나무 뿌리의 지하부에서 성장하는 버섯이라는 측면에서 자연환경에 크게 영향을 받지 않음으로 유사한 생리활성을 보여준 것으로 추정이 되고 결과적으로, 지방세포 내에서 지방의 축적 예방의 효과는 중국산 복령과 국내산 복령 모두 차이가 없어 원산지 구분에 대한 생리활성법으로는 부적절하였다.
- 이러한 결과에 대하여 50% 복령추출물에 대한 근거 자료가 부족하여 최근에 전보 [14]에서 보고한 에탄올 목이버섯추출물을 이용하여 3T3-L1 세포주에서 세포독성을 확인한 결과 300 μg/mL까지는 세포독성이 없는 것과 일치하였다.
- 05). 이러한 결과에서 인공재배인 노지재배 1년산과 2년산 복령 그리고 시설재배 1년산과 2년산 복령의 항암활성은 차이를 보이지 않음으로 재배농가는 사용목적에 따라서 생산량과 원가를 기반으로 복령의 수확시기를 설정할 수 있을 것으로 생각되었다. 하지만 수확 시기별로 19개월 이상 재배한 복령의 추출물이 폐암, 난소암, 피부암 등의 암세포주에서 200 μg/mL 농도에서 상대적으로 높은 항암활성을 보인다고 보고된 바 있다[19].
- 시험 종료 후 생존동물의 검시 KPE 그리고 CPE 투여군과 대조군 모두 내부 장기는 육안 상 이상소견이 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합하여 보면, KPE와 CPE를 마우스에 단회 경구투여 하였을 때 시험물질에 기인한 사망은 관찰되지 않았고 LD50 수치는 암‧수 모두에서 2,000 mg/kg 이상이었다(Table 2). 하지만 식품으로 적용 시에는 단회 섭취보다는 장기적인 꾸준한 섭취가 이루어지기 때문에 아급성 및 만성 독성 검사도 필요한 것으로 생각되었다.
- 동결 건조된 추출물은 3T3-L1 세포 내 지 방축적 억제활성과 Sarcoma 180 암세포주에 대한 항암활성을 구명하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 실험에 사용하였다. 중국산 및 국내산 복령추출물을 제조하기 전에 농약잔류 분석을 한국분석기술연구소에 의뢰하여 250여종의 농약잔류성분을 신속다성분 동시분석법으로 실시하여 잔류농약이 없음을 확인하였다.
- 중국산 복령을 대체하고자 인공재배에서 생산된 노지재배 복령(LPE)과 시설재배 복령(FPE)의 항암활성 비교에서 CPE의 항암활성보다 높게 나타났다(p < 0.05).
- 지방세포로 분화를 유도한 대조군에서는 다량의 지방이 축적되었고 이를 기준으로 KPE를 처리한 3T3-L1 지방세포 내의 지방축적은 10 μg/mL, 100 μg/mL 그리고 300 μg/mL에서 시간 및 농도-의존적으로 감소하였다(Fig. 2).
- 특히 300 μg/mL의 농도에서 3T3- L1 지방세포 내 축적 된 지방을 정량적으로 분석한 결과 300 μg/mL에서 48시간 55%, 72시간 64%, 96시간 55%, 144시간 50%의 지방축적량이 유의적으로 감소하였다(Fig. 3).
- 또한 인공재배로 생산되는 노지재배 복령과 시설재배 복령의 수확시기별로 Sarcoma 180 암세 포주에 대한 항암활성은 차이가 없었다. 특히 유통되는 중국산 복령과 국내산 복령의 추출물은 ICR 계통의 마우스에서 단회 경구투여 시 2,000 mg/kg 이하의 용량에서 어떠한 독성 영향도 유발하지 않아 LD50는 최소한 2,000 mg/kg 이상이라는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 50% 복령 에탄올 추출물은 in vitro에서 비만억제 작용 및 항암 작용이 있어 기능성 원료 소재 개발에 응용이 가능할 것으로 기대되었다.
- 하지만 200μg/mL에서는 10% 지방축적을 억제하여 본 연구의 그것과 비교 시 지방축적 억제율은 작지만 억제 경향은 같았다.
- 하지만 CPE와 KPE의 300 μg/mL 농도에서는 KPE는 20%의 생존율로 80%의 성장 억제를 보인 반면 CPE는 36% 의 세포 생존율로 64%의 성장 억제를 보여 KPE가 CPE보다 유의성 있는 암세포 성장 억제를 보였다(p < 0.05).
후속연구
- 위의 결과를 종합 시 암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용한 항암활성측정법은 중국산과 국내산의 원산지 검증의 생물활성검증의 보조수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되었다. 국내에서 인공재배되는 노지재배 복령 및 시설재배 복령은 중국산 복령을 대체하여 수입 감소의 효과를 기대할 수 있으며 지방축적 억제활성 및 항암활성의 기능성 원료로 활용이 가능할 것으로 생각되었다.
- 이러한 결과의 차이점은 추출 법, 자연에서 성장률과 인공재배에서의 성장률에서 오는 차이점으로 생각된다. 위의 결과를 요약하면 복령의 항암활성은 25-methoxyporicoic acid A와 triterpene 성분[15, 16]에서 기인한 것으로 알려져 있으므로 이들 성분 분석과 표준화된 항암활성측정법을 최적화시키면 원산지 검증의 보조 수단으로도 응용이 가능할 것으로 생각되었다.
- 단회 독성시험에서 CPE와 KPE의 LD50(반수치 사량)은 2,000 mg/kg 이상으로 추정되었다. 위의 결과를 종합 시 암세포주인 Sarcoma 180 세포주를 이용한 항암활성측정법은 중국산과 국내산의 원산지 검증의 생물활성검증의 보조수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되었다. 국내에서 인공재배되는 노지재배 복령 및 시설재배 복령은 중국산 복령을 대체하여 수입 감소의 효과를 기대할 수 있으며 지방축적 억제활성 및 항암활성의 기능성 원료로 활용이 가능할 것으로 생각되었다.
- 특히 유통되는 중국산 복령과 국내산 복령의 추출물은 ICR 계통의 마우스에서 단회 경구투여 시 2,000 mg/kg 이하의 용량에서 어떠한 독성 영향도 유발하지 않아 LD50는 최소한 2,000 mg/kg 이상이라는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 50% 복령 에탄올 추출물은 in vitro에서 비만억제 작용 및 항암 작용이 있어 기능성 원료 소재 개발에 응용이 가능할 것으로 기대되었다.
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