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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 보고된 이들 4가지 곤충병원성 균주들의 효율적인 배양 배지 선발과 동시에 식물병원균에 대한 확대 적용 가능성을 검정하여 이들 균주들의 유용성을 더욱 높이고자 하였다. 효율적인 배양 배지 선발을 위하여 일반적으로 많이 이용되는 4가지 배지를 대상으로 살충성의 원인이 되는 포자 생산능력과 더불어 배양액에 의한 항진균 능력을 동시에 비교 평가하였다.
- 본 연구에서는 살충 및 살균 활성을 지닌 이들 4가지 곤충병원성 곰팡이 균주에 대해서 포자 및 배양액의 생산을 위한 최적 배양 배지에 대한 탐색과 더불어, 적용할 수 있는 식물병의 확장을 위하여 다양한 식물병원균에 대한 항균활성을 평가하였다.
제안 방법
- PDA 배지에서 5일간 배양한 식물병원균 균총의 가장자리를 corkborer를 이용하여 6mm로 자른 후, 새로운 PDA 배지(pH 5.6) 중앙을 기준으로 15 mm 좌측에 접종하고, 우측 15 mm에 PDA 배지에서 7일간 배양한 곤충병원성 곰팡이 균주의 가장자리 6 mm 균총을 접종하였다. 접종 후, 25℃, 암 조건에서 4일간 배양하여 형성되는 inhibition zone의 크기를 측정하였다.
- michiganenesis 현탁액(1× 108 CFU/mL)을 도말 막대를 사용하여 곰팡이를 접종한 배지 중앙에 도말하고, 25℃, 암 조건에서 3일간 배양하여 형성되는 inhibition zone의 크기를 측정하였다.
- michiganensis를 배양하면서 KB 배지(pH 7.4)에서 650nm로 흡광도(O.D)를 측정하여 균수를 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 배양한 후, 2 X KB 배지(pH7.4)를 이용하여 약 5 × 105 CFU/mL로 조절한 뒤 96 well plate에 100 µL를 접종하였다.
- 포자현탁액은 실험에 사용 시까지 4℃에 보관하였고, 보관기간은 3일을 넘기지 않았다. 고체 배양을 통해 얻어진 포자현탁액은 액체배지에 접종하기 전 Sabourauddextroseagar (SDAY, supplementedwith1% Yeastextract, pH 5.6) 배지에 0.05% benomyl(95% active ingredient; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 SDAY+B 배지에서 포자의 발아 여부를 확인하여, 90% 이상 viability를 보이는 경우만 사용하였다. 포자현탁액 50 µL (9 × 105 conidia/mL)를 30mL의 potato dextrose broth (PDB, pH 5.
- 접종 후, 25℃, 암 조건에서 4일간 배양하여 형성되는 inhibition zone의 크기를 측정하였다. 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액의 항진균 활성 검정은 PDA 배지에서 식물병원성 진균을 배양하고 포자형성을 유도한 후, 곰팡이 표면을 긁어 수확된 포자를 10% PDB 배지를 이용하여 포자현탁액을 만들었다. 수거한 포자 현탁액을 멸균된 거즈를 이용하여 균사를 제거하였으며, 포자를 hemocytometer로 계수하고 2 X PDB 배지(pH 5.
- 따라서, 곤충병원성 곰팡이가 해충과 식물병에 대해서 동시에 높은 방제 능력을 지닌다면 높은 습도로 인한 식물병의 발생 문제도 극복할 수 있을 것이며, 작물보호제로서 좋은 대안이 될 수 있을 것이다. 그에 따라 잿빛곰팡이병균에 대해 활성이 검정된 4가지 균주에 대해 그 적용범위의 확대를 위하여 4가지의 주요 식물병원성 진균과 더불어 식물병원성 세균에 대해서 항균능력을 검정하였다. 그 결과 4가지 곤충병원성 곰팡이 균주에 따라 식물병원성 진균과 세균에 대해 서로 다른 확대된 항균 능력을 보여주었다(Figs.
- 높은 살충력 및 항진균 활성을 가진 4가지 곤충병원성 곰팡이 균주들의 효율적인 배양 배지를 선발하기 위해서, 일반적으로 많이 이용되는 PDB, SDB, GY, Adamek's 배지에 각각의 병원성 곰팡이를 배양하여 배지별 출아포자의 생산량과 항진균 활성을 비교 평가하였다.
- 대치배양 검정은 PDA 배지에서 7일간 배양한 곤충병원성 곰팡이 균주 균총의 가장자리를 cork borer를 이용하여 6 mm로 자르고 새로운 PDA 배지 양쪽 가장자리에 접종하여 2일간 25℃, 암조건에서 배양하였다. 2일 후, King’s B 배지에서 배양한 C.
- 선발된 균주들의 배지에 따른 출아포자(blastospore)의 생산 효율과 항균활성을 비교하고자, 각각PDB, Sabouraud dextrose broth (SDB; 0.5% peptic digest of animal tissue, 0.5% pancreatic digest of casein, 2% dextrose, pH 5.5), GY (2% glucose, 0.2% yeast extract, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.1% K2HPO4, pH 5.5), Adameks's 배지(4% glucose, 4% yeast extract, 3% corn steep liquor, pH 5.5) 100mL을 250mL 플라스크에 분주하고, 각각의 균주를 100 µL (1 × 108 conidia/mL)씩 접종하여 25℃, 150 rpm, 암조건에서 7일간 배양하여 출아포자 생산량과 항균활성을 확인하였다.
- 수거한 포자 현탁액을 멸균된 거즈를 이용하여 균사를 제거하였으며, 포자를 hemocytometer로 계수하고 2 X PDB 배지(pH 5.6)를 이용하여 약 2 × 104 conidia/mL이 되도록 조절한 후, 96 well plate에 100 uL 접종하였다.
- 출아포자 생산량 측정은 7일간 배양한 산물을 원심 분리하여 분리된 균체에 멸균수를 2회 처리하여 배양액을 제거하고, 멸균수를 다시 1X의 농도로 첨가하고 vortexing하여 현탁액을 제조하였다. 이후 멸균된 거즈를 이용하여 균체를 제거하고, 출아포자를 수거하여 hemocytometer로 계수하였다. 항진균 활성 측정은 배양산물을 원심분리 후 얻어진 배양액을 filter paper로 1차 여과한 후, 다시 0.
- 잿빛곰팡이병균에 대한 항진균 활성이 검증된 4가지 곤충병원성 곰팡이의 식물병에 대한 적용 범위를 확대하고자, 여러 가지 다른 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성을 검정하였다. 그 결과, 점박이응애 병원성 곰팡이 중 M.
- 접종 후, 100% 곰팡이 배양액과 멸균수로 희석한 1%, 10% 배양액을 100 µL씩 접종하고, 22℃, 암조건에서 48시간 배양 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 식물병원균의 생장을 관찰하였다.
- 6) 중앙을 기준으로 15 mm 좌측에 접종하고, 우측 15 mm에 PDA 배지에서 7일간 배양한 곤충병원성 곰팡이 균주의 가장자리 6 mm 균총을 접종하였다. 접종 후, 25℃, 암 조건에서 4일간 배양하여 형성되는 inhibition zone의 크기를 측정하였다. 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액의 항진균 활성 검정은 PDA 배지에서 식물병원성 진균을 배양하고 포자형성을 유도한 후, 곰팡이 표면을 긁어 수확된 포자를 10% PDB 배지를 이용하여 포자현탁액을 만들었다.
- 접종 후, pH7.4로 조절한 100% 곰팡이 배양액과 멸균수로 희석한 1%, 10% 배양액을 100 uL씩 각각 접종하고 27℃에서 36시간 배양 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구는 배양액 대신 100 µL의 멸균수를 사용하였다.
- 5) 100mL을 250mL 플라스크에 분주하고, 각각의 균주를 100 µL (1 × 108 conidia/mL)씩 접종하여 25℃, 150 rpm, 암조건에서 7일간 배양하여 출아포자 생산량과 항균활성을 확인하였다. 출아포자 생산량 측정은 7일간 배양한 산물을 원심 분리하여 분리된 균체에 멸균수를 2회 처리하여 배양액을 제거하고, 멸균수를 다시 1X의 농도로 첨가하고 vortexing하여 현탁액을 제조하였다. 이후 멸균된 거즈를 이용하여 균체를 제거하고, 출아포자를 수거하여 hemocytometer로 계수하였다.
- 6) 배지에 접종하고, 25℃에서 2주간 배양하였다. 포자를 수거하기 위해, 배양된 곰팡이 표면을 긁어 수확된 포자를 0.02% tween 80을 이용하여 포자현탁액을 만들고, 멸균된 탈지면으로 균사를 제거한 후 hemocytometer로 계수하여 실험에 이용하였다. 포자현탁액은 실험에 사용 시까지 4℃에 보관하였고, 보관기간은 3일을 넘기지 않았다.
- 항진균 활성 측정은 배양산물을 원심분리 후 얻어진 배양액을 filter paper로 1차 여과한 후, 다시 0.45 µm filter를 이용한 2차 여과로 얻은 순수한 배양액을 각각 농도별(1, 10, 20, 40, 60, 80, 100% with sterile distilled water)로 희석한 후 항진균 활성에 이용하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 보고된 이들 4가지 곤충병원성 균주들의 효율적인 배양 배지 선발과 동시에 식물병원균에 대한 확대 적용 가능성을 검정하여 이들 균주들의 유용성을 더욱 높이고자 하였다. 효율적인 배양 배지 선발을 위하여 일반적으로 많이 이용되는 4가지 배지를 대상으로 살충성의 원인이 되는 포자 생산능력과 더불어 배양액에 의한 항진균 능력을 동시에 비교 평가하였다. 그 결과 배지에 따라 포자생산능력과 배양액에 의한 항진균 활성은 다양하게 나타났으며(Figs.
대상 데이터
- 곤충병원성 곰팡이 균주는 국내 토양에서 분리한 342개 균주들 가운데에서 점박이응애와 잿빛곰팡이병균에 대해 동시에 높은 활성을 보인 B. bassiana 2R-3-3-1 (NCBI GenBank accession no. KX756085), M. anisopliae 4-2 (NCBI GenBank accession no. KX756078) 균주들[3]과 복숭아혹진딧물과 잿빛곰팡이병균에 대해 동시에 높은 활성을 보인 B. bassiana SD15 (NCBI GenBank accession no. KC551951), M. anispoliae SD3 (NCBI GenBank accession no. KC551963) 균주들을[8] 각각 실험에 이용하였다.
- 항세균 활성 검정에 이용된 토마토 궤양병균(Clavibactermichiganensis subsp. michiganensis LMG 7333)은 충북대학교 식물세균병학 연구실에서 분양받아 King's B 배지(2% proteose peptone no.3, 1% glycerol, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, pH7.4)에서 27℃ 조건으로 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 항진균 활성 검정을 위한 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytiscinerea T3-4), 고추 탄저병균(Colletotrichum acutatum 15AS32), 고추 역병균(Phytophthora capsici P13-1), 딸기 탄저병균(Colletotrichum fructicola CGF160401), 토마토 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum 11-49)은 충북대학교 식물진균병학 연구실에서 분양 받았으며, 이들 균주들은 PDA 배지에 접종하고 P. capsici P13-1는 22℃, 나머지 균주는 25℃ 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다. 항세균 활성 검정에 이용된 토마토 궤양병균(Clavibactermichiganensis subsp.
데이터처리
- 데이터는 일원분산분석(ANOVA)으로 수집하였고, 그룹 간의 비교는 Tukey’s studentized range (honestly significant difference)로 수행하였다.
- 자료는 평균 ± 표준오차(SE)로 표시하였고, 통계적 유의성은 p < 0.05 수준으로 설정하였다
- 항균활성은 SPSS ver. 24 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하여 분석하였다. 데이터는 일원분산분석(ANOVA)으로 수집하였고, 그룹 간의 비교는 Tukey’s studentized range (honestly significant difference)로 수행하였다.
성능/효과
- 4). 4개 균주 모두 C. acutatum과 S. sclerotiorum에 대해서는 항진균 활성을 나타냈으나, P. capsici와 C. fructicola에 대해서는 M. anisopliae SD3가 P. capsici에 대한 7.7 mm의 높은 항진균 활성을 나타낸 것을 제외하고는 낮은 활성을 보이거나 활성이 없었다.
- 2B). 4개 균주의 포자 생산량과 항진균 활성을 종합한 결과, B. bassiana SD15를 제외한 다른 균주들은 포자 생산량의 향상을 보이면서 높은 항진균 활성을 보인 GY 배지를, 그리고 B. bassiana SD15의 경우 포자생산량은 높지 않지만 높은 항진균 활성을 보인 PDB 배지를 최적 배지로 선택할 수 있었다.
- 3). Beauveria bassiana 2R-3-3-1은 S. sclerotiorum과 C. acutatum에 대해 높은 항진균 활성을 나타냈으나, C. fructicola와 P. capsici에는 높은 활성을 보이지 않았다(Fig. 3). 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이 중 M.
- 4). Beauveria bassiana SD15의 경우에는 M. anisopliae 1-5와 비교하였을 때, C. acutatum, P. capsici 및 C. fructicola에는 낮은 항진균 활성을 보였고, S. sclerotiorum에 대해서는 비교적 높은 항진균 활성을 나타내었다(Fig. 4). 4개 균주 모두 C.
- michiganensissubsp. michiganensis에 대한 항세균 활성을 검정한 결과, 점박이응애 병원성 곰팡이 배양액의 경우, M. anisopliae 4-2가 100% 배양액에서 낮은 항세균 활성을 보였으며, 낮은 농도에서는 활성을 나타내지 않았다(Fig. 6B). 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이 배양액의 경우 M.
- michiganensissubsp. michiganensis에 대한 활성을 검정한 결과, M. anisopliae와 B. bassiana 간에 항세균 활성의 차이가 명확히 나타났다(Fig. 6A). Metarhizium anisopliae 4-2와 M.
- bassiana SD15의 경우 100%에서는 중간의 항세균 활성을 보였고, 낮은 농도의 배양액은 항세균 활성을 나타내지 않았다. 균주와 배양액의 항세균 활성을 비교하였을 때, 균주에서 높은 항세균 활성을 보였던 M. anisopliae도 배양액에서는 높은 항세균 활성을 나타내지 않았다.
- 3)와 다르게 항진균 활성을 나타내었다. 균주의 항진균 활성 결과로는 M. anisopliae SD3와 B. bassiana 2R-3-3-1가 비슷한 항진균 활성을 보였지만(Figs. 3, 4), 배양액의 항진균 활성에서는 상당한 차이를 보였다(Fig. 5).
- 그에 따라 잿빛곰팡이병균에 대해 활성이 검정된 4가지 균주에 대해 그 적용범위의 확대를 위하여 4가지의 주요 식물병원성 진균과 더불어 식물병원성 세균에 대해서 항균능력을 검정하였다. 그 결과 4가지 곤충병원성 곰팡이 균주에 따라 식물병원성 진균과 세균에 대해 서로 다른 확대된 항균 능력을 보여주었다(Figs. 3-6). 이러한 결과는 이들 4가지 균주가 잿빛곰팡이병균을 대상으로 선발되었으나 그들의 항균활성물질이 서로 다르며 그에 따라 서로 다른 항균활성을 보인 것으로 여겨진다.
- 효율적인 배양 배지 선발을 위하여 일반적으로 많이 이용되는 4가지 배지를 대상으로 살충성의 원인이 되는 포자 생산능력과 더불어 배양액에 의한 항진균 능력을 동시에 비교 평가하였다. 그 결과 배지에 따라 포자생산능력과 배양액에 의한 항진균 활성은 다양하게 나타났으며(Figs. 1, 2) 최종적으로 GY 배지와 PDB 배지를 선발할 수 있었다. 출아포자 생산량의 경우 탄소원과 질소원의 함량 차이에 따라 다를 수 있으며[16], 여러 대사산물의 생산 또한 균주마다 배지에 따른 차이를 보이므로[10] 균주별 최적 조건 탐색이 필요하다는 기존의 연구와 일치하는 결과였다[17].
- 그 결과, 배지에 따라 출아포자 생산량과 항진균 활성의 차이를 확인할 수 있었으며(Figs. 1, 2), 점박이응애 병원성 곰팡이의 경우에 있어 출아포자 생산량은 M. anisopoliae 4-2의 경우 GY 배지와 Adamek's 배지에서 모두 큰 증대와 더불어 비슷한 포자 생산량을 보였으나, B. bassiana 2R-3-3-1의 경우는 GY 배지보다 Adamek’s 배지에서 더 높은 포자 생산량을 보였다(Fig. 1A).
- 잿빛곰팡이병균에 대한 항진균 활성이 검증된 4가지 곤충병원성 곰팡이의 식물병에 대한 적용 범위를 확대하고자, 여러 가지 다른 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성을 검정하였다. 그 결과, 점박이응애 병원성 곰팡이 중 M. anisopliae 4-2는 P. capsici와 Colletotrichum fructicola에 대해서는 항진균 활성을 나타내지 못 하였고, C. acutatum과 S. sclerotiorum에 대해서는 0.5~1.4 mm 내외의 낮은 항진균 활성을 보였다(Fig. 3). Beauveria bassiana 2R-3-3-1은 S.
- 그러나 배양액의 항진균 활성 결과에서는 이와는 다르게 PDB 배지와 SDB 배지에서 보다 높은 활성을 보였으며, Adamek’s 배지의 경우는 항진균 활성이 크게 낮아졌다(Fig. 2A).
- 대치 배양에 의한 결과를 기초로 배양액에 의한 항진균 활성을 C. fructicola와 C. acutatum에 대하여 추가 검정한 결과, 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이인 B. bassiana SD15를 제외한 모든 배양액의 항진균 활성은 농도가 높을수록 활성이 증가되었으며, 1% 농도에서는 거의 활성을 보이지 않았다(Fig. 5). 대치배양과 배양액의 항진균 활성을 비교하였을 때, 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이인 B.
- 5). 대치배양과 배양액의 항진균 활성을 비교하였을 때, 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이인 B. bassiana SD15는 균주의 대치배양 결과(Fig. 4)와 같이 항진균 활성을 나타내지 않았으나, 그와 반대로 점박이응애 병원성 곰팡이인 M. anisopliae 4-2는 균주의 대치배양 결과(Fig. 3)와 다르게 항진균 활성을 나타내었다. 균주의 항진균 활성 결과로는 M.
- 6B). 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이 배양액의 경우 M. anisopliae SD3는 100%와 10% 배양액에서 항세균 활성을 나타내었으며(Fig. 6B), B. bassiana SD15의 경우 100%에서는 중간의 항세균 활성을 보였고, 낮은 농도의 배양액은 항세균 활성을 나타내지 않았다. 균주와 배양액의 항세균 활성을 비교하였을 때, 균주에서 높은 항세균 활성을 보였던 M.
- 3). 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이 중 M. anisopliae SD3가 모든 식물병원균에 항진균 활성을 나타내었으며, 특히 P. capsici과 C. acutatum에 대해 매우 높은 항진균 활성을 보였다(Fig. 4). Beauveria bassiana SD15의 경우에는 M.
- 복숭아혹진딧물 병원성 곰팡이는 M. anisopliae SD3와 B. bassiana SD15 두 균주 모두 SDB, PDB, GY, Adamek’s 배지 순으로 포자 생산량이 증가하였으며(Fig. 1B), 항진균 활성은 M. anisopliae SD3의 경우 모든 배양액에서 매우 높은 항진균 활성을 보였으나, B. bassiana SD15의 경우에는 GY 배지에서 농도에 비례하여 항진균 활성 또한 낮아지는 경향을 보였고, Adamek’s 배지 배양액의 경우는 활성이 전혀 나타나지 않았다(Fig. 2B).
- 6A). 항세균 활성을 B. cinerea의 항진균 활성과 비교하였을 때, 항진균과 항세균 활성의 연관성은 확인되지 않았다. 배양액의 C.
후속연구
- 이러한 높은 습도의 요구는 곤충병원성 곰팡이뿐만 아니라 흰가루병이나 잿빛곰팡이병과 같은 식물병원성 곰팡이에 대해서도 발병력을 높일 수 있기 때문에, 식물병의 발생이라는 부작용이 있을 수 있다[19]. 따라서, 곤충병원성 곰팡이가 해충과 식물병에 대해서 동시에 높은 방제 능력을 지닌다면 높은 습도로 인한 식물병의 발생 문제도 극복할 수 있을 것이며, 작물보호제로서 좋은 대안이 될 수 있을 것이다. 그에 따라 잿빛곰팡이병균에 대해 활성이 검정된 4가지 균주에 대해 그 적용범위의 확대를 위하여 4가지의 주요 식물병원성 진균과 더불어 식물병원성 세균에 대해서 항균능력을 검정하였다.
- 이상의 연구 결과를 통해 점박이응애와 복숭아혹진딧물 그리고 잿빛곰팡이병균에 효과적인 4가지 곤충병원성 곰팡이 균주들의 출아포자 및 배양액의 효율적인 배양 배지를 선발할 수 있었으며, 또한 이들 곰팡이 균주들의 다른 식물병원성 진균 및 세균에 대해서도 항균활성을 가짐이 확인됨으로써 이들 균주들을 이용한 효율적인 친환경 작물보호제의 개발이 기대된다.
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