[논문]MPN-PCR 방법을 이용한 Vibrio vulnificus 균수 정량분석

장유미; 박슬기; 정희진; 이장원; 윤요한; 박권삼; 신일식; 김영목

doi:10.13103/jfhs.2018.33.5.412

MPN-PCR 방법을 이용한 Vibrio vulnificus 균수 정량분석
Quantitative Cell Count of Vibrio vulnificus Cells Based on MPN-PCR Method 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.33 no.5, 2018년, pp.412 - 415

장유미 (부경대학교 식품공학과) , 박슬기 (부경대학교 식품공학과) , 정희진 (부경대학교 식품공학과) , 이장원 (부경대학교 식품공학과) , 윤요한 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 박권삼 (군산대학교 식품생명공학과) , 신일식 (강릉원주대학교 해양식품공학과) , 김영목 (부경대학교 식품공학과)

초록
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V. vulnificus는 그람음성의 호염성균으로 감염 되었을 경우, 복통과 발열 등의 급성 위장염을 일으키며 만성질환자에게 급성 패혈증을 일으키는 매우 높은 치사율의 식중독균이다. 식품 중에서 V. vulnificus를 분석하는 방법으로는 TCBS agar와 같은 선택배지를 이용하는 방법과 PCR을 이용한 방법이 있으나 온도, 염 및 pH 등과 같은 환경 요인에 민감한 V. vulnificus의 특성을 고려하였을 때 정확한 균수 정량을 위한 정량분석법 확립의 필요성이 요구된다. 본 연구에서는 배지 및 염 차이에 따른 V. vulnificus 생육 특성 차이에 대한 연구를 진행하였다. 그 결과, V. vulnificus 균수 정량분석에 APW 증균 배양을 이용한 MPN-PCR 방법이 적합하였다. 본 연구에서 제시된 방법은 해수뿐만 아니라 어패류 등의 시료에서 V. vulnificus 균수 정량분석에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study was to establish a quantitative count method of Vibrio vulnificus cells. Plate count method is often used to count the number of V. vulnificus cells using thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) agar plate. However, this method is unsuitable for counting V. vulnificus cells due to growth inhibition and cell injuries in TCBS medium. In this study, we suggested a most probable number-polymerase chain reaction (MPN-PCR) method using alkaline peptone water medium for the quantification of V. vulnificus. This MPN-PCR method showed 2 log higher cell number than TCBS agar plate method. Similar results were also found in the control using, Luria-Bertani agar containing 2% NaCl. Thus, this MPN-PCR method can be used a sensitive method for quantitative count of viable V. vulnificus cells in fish and shellfish samples.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

vulnificus는 염, pH 그리고 온도 등의 환경인자 변화에 취약하여^4-9), TCBS를 이용한 균수 측정법으로는 정확한 균수 정량에 어려움이 있다고 보고되고 있다^11,12,16). 이에 본 연구에서는 심각한 식중독 감염 사고를 발생시키는 세균인 V. vulnificus의보다 정확한 균수 정량분석법을 확립하기 위하여 배양 배지와 희석수 등의 변수에 따른 V. vulnificus 균수 변화를 분석하였다.

제안 방법

vulnificus 균수 정량분석에 MPN-PCR 방법이 유용하게 적용될 수있다는 것을 의미한다. 이에 본 연구에서는 어패류 등의 시료에서 MPN-PCR을 이용한 V. vulnificus 균수 정량분석 법을 개발하기 위한 기초 자료를 얻기 위하여 희석수의 영향에 대해 조사하였다(Table 2). V.

대상 데이터

본 연구에서 사용한 균주는 한국미생물자원센터[Korea Collection for Type Cultures (KCTC), Daejeon, Korea]에서 분양받은 V. vulnificus KCTC 41665 균주를 사용하였으며, 2% NaCl이 첨가된 Luria-Bertani broth (LB; Difco, Detroit, MI)에 접종하여 35℃에서 12시간 동안 배양 후 사용하였다.

데이터처리

본 연구에서 얻어진 모든 결과는 3회 반복하였으며, 그결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 3회에 걸쳐 시행된 실험 결과들의 유의성 검정을 위하여 분산분석(ANOVA) 을 실시한 후, P < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 행하였고 SPSS (v.23.0, SPSS Ine., Chicago, USA) 통계프로그램을 이용하여 통계 분석을 실시하였다.

이론/모형

처리된 현탁액을 LB-Na agar와 TCBS agar에 도말하여 균수를 측정하였다. 또한, MPN-PCR 방법을 이용한 V. vulnificus 균수 측정은 단계별로 희석된 APW를 35^o C 에서 12 ± 2시간 증균 배양한 후 PCR을 통해 V. vulnificus 양성 band를 확인하여 MPN 표로 균수를 측정하였다. PCR에 사용된 V.
vulnificus 양성 band를 확인하여 MPN 표로 균수를 측정하였다. PCR에 사용된 V. vulnificus 분석용 primer와 PCR 조건은 Han and Ge (2015)의 보고에 따라 수행되었으며¹⁷⁾, V. vulnificus 의 특이 primer (sense 5'-CAGCCGGACGTCGTCCATTTTG-3'; antisense 5'-ATGAGTAAGCGTCCGACGCG T-3')를 사용하였다. 또한 94℃에서 5분간 열 변성(denaturation) 후, 94 ℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초간 순환반응(annealing)을 25 회 실시하고, 최종적으로 72℃에서 10 분간 신장반응(elongation)을 수행하였다.
일반균수측정법으로 진행한 V. vulnificus 균수 측정에는 LB-Na agar와 TCBS (Difco, Detroit, MI; pH 8.6 ± 0.2) agar가 사용되었고, 최확수법(MPN)에 따른 V. vulnificus 증균에는 APW (pH 8.4 ± 0.2)가 사용되었다.

성능/효과

의 분리를 위한 선택배지로 다른 균의 증식을 억제하는 선택성이 강하여 손상된 세포의 경우는 해당 배지에서 배양이잘 되지 않는 것으로 판단된다^11,12,18). 본 연구에서 얻어진 결과를 종합해 보면, NaCl이 포함된 PBS 희석수와 APW 배지를 이용한 MPN-PCR 방법이 V. vulnificus 균수 정량 분석에 유용한 것으로 분석되었다. 향후, 본 연구에서 제시된 V.

후속연구

vulnificus 균수 정량 분석에 유용한 것으로 분석되었다. 향후, 본 연구에서 제시된 V. vulnificus 균수 정량분석 방법은 해수뿐만 아니라 어패류 등의 시료에서 V. vulnificus의 정량분석에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	V. vulnificus는 무엇인가	V. vulnificus는 그람음성의 호염성균으로 감염 되었을 경우, 복통과 발열 등의 급성 위장염을 일으키며 만성질환자에게 급성 패혈증을 일으키는 매우 높은 치사율의 식중독균이다. 식품 중에서 V.
	식품 중에서 V. vulnificus를 분석하는 방법에는 무엇이 있는가	식품 중에서 V. vulnificus를 분석하는 방법으로는 TCBS agar와 같은 선택배지를 이용하는 방법과 PCR을 이용한 방법이 있으나 온도, 염 및 pH 등과 같은 환경 요인에 민감한 V. vulnificus의 특성을 고려하였을 때 정확한 균수 정량을 위한 정량분석법 확립의 필요성이 요구된다.
	비브리오 패혈증은 어떤 환자의 경우 높은 치사율을 보이는가	vulnificus에 오염된 어패류를 가열조리 없이 섭취하거나 피부 상처 부위를 통한 감염에 의해 발생하며 일반적으로 구토, 설사, 복통 등의 증상이 발생한다. 하지만, 간질환과 당뇨병 등의 만성질환자, 장기 이식환자 및 면역 결핍환자의 경우 패혈성 쇼크에 의해 약 50%의 높은 치사율을 일으키기 때문에 증상 발증 시 신속한 확인과 조치가 필요하다1-3). V.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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