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문제 정의
- glutamicum을 사용하는 것은 매우 의미가 있다고 사료된다. 따라서, 본 연구에서는 C. glutamicum ATCC 13032에서 대사공학을 통해 GlcNAc 생산에 필요한 glmS와 gna1 유전자를 과발현하고 GlcNAc의 분해반응과 부반응으로 가는 대사경로를 차단하여 포도당으로부터 GlcNAc를 생산하는 균주를 개발하여 보고한다.
- 1)[21]. 이 경로를 차단하기 위하여 염색체상에서 nanE 유전자를 결손한 균주를 개발하였다. 먼저 nanE 유전자의 상류 및 하류 부분의 DNA 단편을 함유한 pK19-ΔnanE를 제작하고, 이를 KB110에 형질전환하여 nanE 유전자가 결손된 KG208 균주를 제작하였다(Table 1).
제안 방법
- glutamicum KG110(ΔnagAB) 균주에 제작된 플라스미드를 도입하고, 위에서 기술한 동일한 방법으로 1차, 2차 상동성 재조합을 유도하여 nanE 유전자가 결손된 KG208을 제작하였다. 1차 상동성 재조합을 통해 염색체내 nanE 상류부위 또는 하류부위로 삽입되었는지는 프라이머 P13-P14, P15-P16를 사용하여 PCR하여 확인하였으며, 2차 상동성 재조합을 통해 nanE 유전자가 결손된 것은 P13-P16 프라이머를 사용하여 PCR하여 확인하였다.
- C. glutamicum ATCC 13032를 주형 DNA로, P1-P2와P3-P4 프라이머 세트(primer set)를 사용하여 PCR을 통해 nagA 유전자의 상류부위(upstream region)와 nagB 유전자의 하류부 위(downstream region)의 0.4 kb DNA 단편들을 각각 얻은 다음, 다시 P1−P4를 사용하여 중첩(overlap) PCR하여 0.8 kb 단편을 얻어 정제한 후 HindIII와 EcoRI으로 처리하였다(Table 2).
- C. glutamicum KG110(ΔnagAB) 균주에 제작된 플라스미드를 도입하고, 위에서 기술한 동일한 방법으로 1차, 2차 상동성 재조합을 유도하여 nanE 유전자가 결손된 KG208을 제작하였다.
- 유전자 클로닝과 발현을 위한 플라스미드는 pCX 시리즈 발현벡터(pCXT20, pCXS30, pCXS35, pCSI40, pCXI43, pCXI45)와 pCES208을 사용하였다[16]. C. glutamicum 염색체에 존재하는 유전자를 결손하기 위한 목적으로 pK19mobsacB 벡터를 사용하였다[17]. 특정한 DNA 단편은 Pfu-X DNA polymerase(SolGent, Korea)를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻었으며, 클로닝 후 염기서열을 분석하여 DNA 염기서열을 확인하였다.
- 1) [3, 12]. C. glutamicum 유래의 glucosamine-6-phosphate synthase를 암호화하는 glmS 유전자를 잘 발현하기 위하여 C. glutamicum에서 작동하는 6가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다(Table 1). 제작된 벡터들을 각각 C.
- 최근, Deng 등[12]과 Liu 등[13, 14]은 대사공학을 통해 Escherichia coli와 Bacillus subtilis에서 매우 높은 농도의 GlcNAc를 생산하는 연구 결과를 보고하였다. E. coli에서 fructose-6-phosphate을 N-acetylglucosamine-6-phosphate(GlcNAc-6-P)로 단계적으로 전환하는 데 관여하는 효소들인 glucosamine-6-phosphate(GlcN-6-P) synthase와 glucosamine6-phosphate N-acetyl transferase를 암호화하는 유전자 glmS와 gna1을 발현하고, GlcN-6-P에 의한 생산물 저해(product inhibition)가 해제된 변이 glucosamine synthase를 암호화하는 glmS를 과발현시키고, GlcNAc-6-P의 분해에 관여하는 nagBACD를 염색체에서 결손하고, 배출된 GlcN과 GlcNAc를 세포 내로의 재 유입을 방지하기 위해 manXYZ와 nagE를 결손한 균주를 개발하여 1-L 발효조에서 72시간 배양한 결과 110 g/l의 GlcNAc가 축적되는 것을 확인하였다[12]. B.
- 07 kb DNA 단편을 얻어 후, T-Blunt 벡터에 클로닝 하여 플라스미드 T-Blunt-glmS를 제작하였다(Table 1, 2). EcoRI과 KpnI 제한효소로 처리하여 다시 2.07 kb의 단편을 정제한 후, 이를 pCX 시리즈의 발현 벡터인 pCXT20, pCXS30, pCXS35, pCXI40, pCXI43, pCXI45를 동일한 제한효소로 처리하고 정제한 플라스미드들과 DNA 접합(ligation)하여,최종적으로 플라스미드 pCXT20-glmS, pCXS30-glmS, pCXS35-glmS, pCXI40-glmS, pCXI43-glmS, pCXI45-glmS를 각각 제작하였다(Table 1). gna1 유전자의 경우,Saccharomyces cerevisiae 염색체를 주형 DNA로 사용하고, 프라이머 P19-P20를 넣고 PCR을 수행하여 0.
- 효소가 불용성의 봉입체(inclusion body) 형태로 생산되는지를 확인하기 위하여 원심분리하여 얻은 조효소액의 침전물을 SDS-PAGE로 분석한 결과에서도 발현의 차이를 확인할 수 없었다(결과는 제시하지 않음). GNA1 효소 생산이 미생물 숙주 차이에 기인되는지를 확인하기 위하여 제작된 플라스미드를 E. coli에 형질전환하여 제조된 조효소액을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다(Fig. 4B). 그 결과, 플라스미드 pCXI40-gna1과 pCXI45-gna1을 함유한 E.
- cerevisiae 유래의 gna1 유전자를 PCR로 증폭하여 4가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다(Table 1) [22]. GNA1 효소가 잘 생산되는지를 확인하기 위하여, 제작된 벡터를 C.glutamicum ATCC13032에 도입하고, SDS-PAGE를 통해 GNA1 단백질의 합성 정도를 분석하였다(Fig. 4A). 이론적인 분자량인 18,134 Da 부위에서 대조균의 조효소액과 비교하여 특별한 차이를 확인할 수 없었다.
- 세포 생장은 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, 일본)를 사용하여 600 nm에서 관찰하였으며, 포도당 농도는 ACCUCHEK (서울, 한국)을 사용하여 측정하였다. GlcNAc와 GlcN의 농도는 HPLC (Shiseodo, Japan)로 분석하였다. 5 ml의 발효 배양액을 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리하고 그 상등액을 acetonitrile로 적절히 희석한 후 0.
- glutamicum 셔틀벡터(shuttle vector)인 pCES208 벡터에gna1 유전자를 서브클로닝하여 4가지 종류의 pCES208-gna1 시리즈 벡터를 제작하였다(Table 1) [16]. KG343 균주에 이들 플라스미드를 각각 도입한 후 삼각플라스크에서 48시간 발효하여 GlcN과 GlcNAc의 생산농도를 측정하였다(Table 3). 플라스미드 pCXI40-glmS을 함유한 KG343의 경우, 기대와는 달리 GlcN이 생산되지 않았다.
- SDS-PAGE 분석결과에서 GlmS 효소합성이 가장 우수한 것으로 판단된 플라스미드 pCXI40-glmS를 기반균주인 KG208에 형질전환하여 재조합 균주 KG343을 제작하였다. 한편, 유전자 glmS와 gna1은 모두 동일한 복제원점을 함유한 발현벡터에 클로닝되어 있기 때문에 두 플라스미드를 C.
- glutamicum에서는 잘 생산이 안 되는 것으로 추정된다. SDS-PAGE 실험에서 가장 우수한 GNA1 생산을 나타내는 플라스미드를 선택할 수 없어, GlcN과 GlcNAc의 생산능력을 평가하는 실험에는 4가지 재조합 플라스미드를 모두 이용하였다.
- nagA 상류와 nagB 하류부분의 DNA 단편이 연결된 벡터 pK19-ΔnagAB를 제작한 후, 야생형 C. glutamicum에 도입하고 2회의 상동성 재조합을 유도하여 최종적으로 nagAB 유전자가 결손된 KB110 균주를 제작하였다(Table 1).
- 염색체내에서 nagA 상류부위 또는 nagB 하류부위로 삽입되었는지는 P5-P6, P7-P8로 PCR하여 확인하였으며, 삽입이 확인된 균주를 LB 액체배지에서 16시간 배양하여 희석한 다음 10% sucrose LB 한천배지에 도말하여 2차 상동성 재조합을 유도하고 kanamycin 내성이 없는 균을 선별하였다. nagAB가 결손 되었는지는 P5-P8 프라이머를 사용하여 PCR한 후 전기 영동으로 확인하여, 최종적으로 균주 KG110을 제작하였다. 한편, C.
- 대사공학을 이용하여 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 생산하는 재조합 Corynebacterium glutamicum을 개발하였다. 먼저 GlcNAc를 생산하는 기반 균주를 제작하기 위하여, N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase와 glucosamine6-phosphate deaminase를 암호화하는 nagAB와 Nacetylmannosamine-6-phosphate epimerase를 암호화하는 nanE를 C.
- glutamicum ATCC 13032에서 순차적으로 결손하여, 최종적으로 KG208 균주를 제작하였다. 또한, glucosamine-6-phosphate synthase를 암호화하는 C.glutamicum 유래의 glmS와 glucosamine-6-phosphate Nacetyltransferase를 암호화하는 Saccharomyces cerevisiae유래의 gna1을 각각 여러 발현벡터에 클로닝하였다. 여러 발현 조합의 플라스미드들 중에서 pCXI40-glmS와 pCEI40-gna1을 함유한 제조합균주 KG440은 삼각플라스크 발효에서1.
- 대사공학을 이용하여 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 생산하는 재조합 Corynebacterium glutamicum을 개발하였다. 먼저 GlcNAc를 생산하는 기반 균주를 제작하기 위하여, N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase와 glucosamine6-phosphate deaminase를 암호화하는 nagAB와 Nacetylmannosamine-6-phosphate epimerase를 암호화하는 nanE를 C. glutamicum ATCC 13032에서 순차적으로 결손하여, 최종적으로 KG208 균주를 제작하였다. 또한, glucosamine-6-phosphate synthase를 암호화하는 C.
- 먼저 nanE 유전자의 상류 및 하류 부분의 DNA 단편을 함유한 pK19-ΔnanE를 제작하고, 이를 KB110에 형질전환하여 nanE 유전자가 결손된 KG208 균주를 제작하였다(Table 1).
- glutamicum에는 존재하지 않기 때문에 이종의 미생물에서 도입하여야 한다[22]. 본 연구에서는 S.cerevisiae 유래의 gna1 유전자를 PCR로 증폭하여 4가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다(Table 1) [22]. GNA1 효소가 잘 생산되는지를 확인하기 위하여, 제작된 벡터를 C.
- 세포 생장은 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, 일본)를 사용하여 600 nm에서 관찰하였으며, 포도당 농도는 ACCUCHEK (서울, 한국)을 사용하여 측정하였다. GlcNAc와 GlcN의 농도는 HPLC (Shiseodo, Japan)로 분석하였다.
- glutamicumATCC 13032에 도입하여 1차 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 염색체에 삽입된 kanamycin 내성 형질 전환주를 얻었다. 염색체내에서 nagA 상류부위 또는 nagB 하류부위로 삽입되었는지는 P5-P6, P7-P8로 PCR하여 확인하였으며, 삽입이 확인된 균주를 LB 액체배지에서 16시간 배양하여 희석한 다음 10% sucrose LB 한천배지에 도말하여 2차 상동성 재조합을 유도하고 kanamycin 내성이 없는 균을 선별하였다. nagAB가 결손 되었는지는 P5-P8 프라이머를 사용하여 PCR한 후 전기 영동으로 확인하여, 최종적으로 균주 KG110을 제작하였다.
- 유전자 glmS는 C. glutamicum 염색체를 주형 DNA로 사용하고 프라이머 P17-P18을 첨가하여 PCR을 수행하여 2.07 kb DNA 단편을 얻어 후, T-Blunt 벡터에 클로닝 하여 플라스미드 T-Blunt-glmS를 제작하였다(Table 1, 2). EcoRI과 KpnI 제한효소로 처리하여 다시 2.
- 이를 HindIII와 EcoRI으로 효소처리 후 pK19mobsacB/HindIII/EcoRI에 클로닝하여, 최종적으로 플라스미드 pK19-ΔnanE를 제작하였다(Table 1).
- 48 kb의 DNA 단편을 정제한 다음, EcoRI/HindIII 효소 처리된 pCXS30, pCXI40, pCXI43, pCXI45와DNA 접합하여, 최종적으로 플라스미드 pCXS30-gna1, pCXI40-gna1, pCXI43-gna1, pCXI45-gna1을 각각 제작하였다(Table 1). 이를 다시 복제원점이 다른 플라스미드 PECS 208에 서브 클로닝(subcloning)하기 위하여, 각각 제한효소 NotI과 KpnI으로 처리 후 1.2 kb를 회수하여 pCES208/NotI/KpnI과 접합하여, 최종적으로 pCES30-gna1, pCEI40-gna1, pCEI43-gna1, pCEI45-gna1을 제작하였다.
- 이를 벡터 pK19mobsacB/HindIII/EcoRI에 클로닝 하여, 최종적으로 플라스미드 pK19-ΔnagAB를 제작하였다(Table 1).
- glutamicum에서 작동하는 6가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다(Table 1). 제작된 벡터들을 각각 C. glutamicum ATCC 13032에 도입하고, 조효소액을 제조하여 SDS-PAGE를 통해 단백질의 생산을 비교 분석하였다(Fig. 3). 그 결과 이론적인 단백질 분자량인 67,214 Da보다 약간 높은 위치에서 pCXI40-glmS, pCXI45-glmS 플라스미드를 함유한 재조합 C.
- 48 kbDNA 단편을 얻어 T-Blunt와 접합하여 플라스미드 T-Bluntgna1을 제작하였다(Table 1, 2). 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리 후 0.48 kb의 DNA 단편을 정제한 다음, EcoRI/HindIII 효소 처리된 pCXS30, pCXI40, pCXI43, pCXI45와DNA 접합하여, 최종적으로 플라스미드 pCXS30-gna1, pCXI40-gna1, pCXI43-gna1, pCXI45-gna1을 각각 제작하였다(Table 1). 이를 다시 복제원점이 다른 플라스미드 PECS 208에 서브 클로닝(subcloning)하기 위하여, 각각 제한효소 NotI과 KpnI으로 처리 후 1.
- 45 mm 막여과기(membrane filter)로 여과하여 분석용 샘플을 준비하였다. 컬럼(column)은 Asahipak-NH2P50을, 검출기(detector)는 Shod ex RI-104 (Shiseodo, Japan)를 사용하였으며, 이동상으로 80% acetonitrile을 사용하여 유속 0.5 ml/min, 온도 40℃조건에서 분석하였다. 세포 배양액 15 ml을 원심 분리하여 회수 후 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2회 세척하고, 그 침전물에 PBS 1 ml을 넣고 현탁 하였다.
- glutamicum 염색체에 존재하는 유전자를 결손하기 위한 목적으로 pK19mobsacB 벡터를 사용하였다[17]. 특정한 DNA 단편은 Pfu-X DNA polymerase(SolGent, Korea)를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻었으며, 클로닝 후 염기서열을 분석하여 DNA 염기서열을 확인하였다. C.
- nagAB가 결손 되었는지는 P5-P8 프라이머를 사용하여 PCR한 후 전기 영동으로 확인하여, 최종적으로 균주 KG110을 제작하였다. 한편, C. glutamicumATCC 13032를 주형 DNA로, P9-P10, P11-P12를 프라이머세트로 사용하여 PCR 하여 nanE 유전자의 상류부위와 하류부위 0.4 kb DNA 단편들을 얻고, P9-P12를 이용하여 다시 중첩 PCR하여 0.8 kb DNA 단편을 정제하였다(Table 2). 이를 HindIII와 EcoRI으로 효소처리 후 pK19mobsacB/HindIII/EcoRI에 클로닝하여, 최종적으로 플라스미드 pK19-ΔnanE를 제작하였다(Table 1).
- SDS-PAGE 분석결과에서 GlmS 효소합성이 가장 우수한 것으로 판단된 플라스미드 pCXI40-glmS를 기반균주인 KG208에 형질전환하여 재조합 균주 KG343을 제작하였다. 한편, 유전자 glmS와 gna1은 모두 동일한 복제원점을 함유한 발현벡터에 클로닝되어 있기 때문에 두 플라스미드를 C.glutamicum에 동시에 도입할 수 없어 또 다른 E. coli/C.glutamicum 셔틀벡터(shuttle vector)인 pCES208 벡터에gna1 유전자를 서브클로닝하여 4가지 종류의 pCES208-gna1 시리즈 벡터를 제작하였다(Table 1) [16]. KG343 균주에 이들 플라스미드를 각각 도입한 후 삼각플라스크에서 48시간 발효하여 GlcN과 GlcNAc의 생산농도를 측정하였다(Table 3).
대상 데이터
- DNA 제한효소는 New England Bio labs (USA)와Enzynomics (Korea) 회사 제품을 사용하였다. DNA plasmid prep kit, Gel extraction kit, PCR premix kit, Pfu-XDNA polymerase kit는 Intron (Korea), GeneAll (Korea),Enzynomics (Korea), SolGent (Korea)에서 각각 구입하였다. N-Acetylglucosamine, glucosamine 등의 고순도 시약은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하였으며, 일반 시약은 Junsei(Japan)와 Duksan (Korea) 제품을 사용하였다.
- DNA 제한효소는 New England Bio labs (USA)와Enzynomics (Korea) 회사 제품을 사용하였다. DNA plasmid prep kit, Gel extraction kit, PCR premix kit, Pfu-XDNA polymerase kit는 Intron (Korea), GeneAll (Korea),Enzynomics (Korea), SolGent (Korea)에서 각각 구입하였다.
- DNA plasmid prep kit, Gel extraction kit, PCR premix kit, Pfu-XDNA polymerase kit는 Intron (Korea), GeneAll (Korea),Enzynomics (Korea), SolGent (Korea)에서 각각 구입하였다. N-Acetylglucosamine, glucosamine 등의 고순도 시약은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하였으며, 일반 시약은 Junsei(Japan)와 Duksan (Korea) 제품을 사용하였다. Tryptone과yeast extract는 Difco (USA) 제품을 사용하였다.
- N-Acetylglucosamine, glucosamine 등의 고순도 시약은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하였으며, 일반 시약은 Junsei(Japan)와 Duksan (Korea) 제품을 사용하였다. Tryptone과yeast extract는 Difco (USA) 제품을 사용하였다.
- glutamicum에서 GlmS 단백질이 잘 생산된 것으로 추정되며, 특히 pCXI40-glmS를 함유한 균주에서 가장 높은 수준의 단백질이 생산되는 것으로 추정된다. 따라서, ilvC 프로모터(promoter)에 결합된 glmS 유전자를 함유한 플라스미드 pCXI40-glmS를 다음 연구에 사용하였다. Glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase (GNA1, EC 2.
- glutamicum ATCC 13032를 사용하였다. 유전자 클로닝과 발현을 위한 플라스미드는 pCX 시리즈 발현벡터(pCXT20, pCXS30, pCXS35, pCSI40, pCXI43, pCXI45)와 pCES208을 사용하였다[16]. C.
- 연구에 사용한 균주와 플라스미드는 Table 1에 표시하였다. 일반적인 유전자조작은 E. coli Top10 (Invitrogen,USA)을 사용하였으며, GlcNAc을 생산하기 위한 모균주는 C. glutamicum ATCC 13032를 사용하였다. 유전자 클로닝과 발현을 위한 플라스미드는 pCX 시리즈 발현벡터(pCXT20, pCXS30, pCXS35, pCSI40, pCXI43, pCXI45)와 pCES208을 사용하였다[16].
데이터처리
- 30 ml의 발효배지를 함유한 250 ml 삼각플라스크에 LB 한천배지에서 1일간 배양된 균을 백금이로 직접 접종하고 진탕 배양기에서 32℃, 2일간 240 rpm으로 배양하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하여 그 평균치를 계산하여 표시하였다.
이론/모형
- 특정한 DNA 단편은 Pfu-X DNA polymerase(SolGent, Korea)를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻었으며, 클로닝 후 염기서열을 분석하여 DNA 염기서열을 확인하였다. C. glutamicum의 형질전환용 세포(competent cell)의 제조와 전기천공법(electroporation)은 이전 논문에 기술된 방법에 준하여 실시하였다[18].
- 이를 벡터 pK19mobsacB/HindIII/EcoRI에 클로닝 하여, 최종적으로 플라스미드 pK19-ΔnagAB를 제작하였다(Table 1). 이를 전기천공법으로 C. glutamicumATCC 13032에 도입하여 1차 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 염색체에 삽입된 kanamycin 내성 형질 전환주를 얻었다. 염색체내에서 nagA 상류부위 또는 nagB 하류부위로 삽입되었는지는 P5-P6, P7-P8로 PCR하여 확인하였으며, 삽입이 확인된 균주를 LB 액체배지에서 16시간 배양하여 희석한 다음 10% sucrose LB 한천배지에 도말하여 2차 상동성 재조합을 유도하고 kanamycin 내성이 없는 균을 선별하였다.
성능/효과
- 먼저 nanE 유전자의 상류 및 하류 부분의 DNA 단편을 함유한 pK19-ΔnanE를 제작하고, 이를 KB110에 형질전환하여 nanE 유전자가 결손된 KG208 균주를 제작하였다(Table 1). Fig. 2B에서 보는 봐와 같이 KG110 균주와 비교하여 KG208 균주는 nanE 유전자가 결손되어 DNA 단편이 약 0.74 kb 감소된 것을 PCR로 확인하였다.
- glutamicum에 도입하고 2회의 상동성 재조합을 유도하여 최종적으로 nagAB 유전자가 결손된 KB110 균주를 제작하였다(Table 1). PCR을 이용하여 분석한 결과, KB110 균주의 경우 야생형 균주와 비교하여 약 1.95 kb 크기의 DNA단편이 감소하였으며, 이는 nagAB 유전자가 결손되었음을 보여준다(Fig. 2A). N-Acetylglucosamine-6-phosphate는 N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase (유전자nanE) 효소촉매에 의해 N-acetylmannosamine-6-phosphate로 전환되는 곁가지 경로가 C.
- 3). 그 결과 이론적인 단백질 분자량인 67,214 Da보다 약간 높은 위치에서 pCXI40-glmS, pCXI45-glmS 플라스미드를 함유한 재조합 C. glutamicum에서 GlmS 단백질이 잘 생산된 것으로 추정되며, 특히 pCXI40-glmS를 함유한 균주에서 가장 높은 수준의 단백질이 생산되는 것으로 추정된다. 따라서, ilvC 프로모터(promoter)에 결합된 glmS 유전자를 함유한 플라스미드 pCXI40-glmS를 다음 연구에 사용하였다.
- 4B). 그 결과, 플라스미드 pCXI40-gna1과 pCXI45-gna1을 함유한 E. coli에서 GNA1 효소 생산이 잘되는 것을 확인하였다. 따라서, GNA1 효소는 숙주세포의 차이에 기인하여 C.
- 또한, Bacillus는 아직 그 생산농도가 낮은 수준으로 추가적인 생산연구가 더 요구된다. 본 연구에서 개발된 Corynebacterium은 GlcNAc 생산농도는 매우 낮은 수준이지만, GRAS(generally regarded as safe) 미생물에서 GlcN과 GlcNAc를 처음으로 생산할 수 있음을 증명한 것에 그 의미를 부여할 수 있다. 한편, 생산농도가 매우 낮은 원인은 본 연구에 도입된 C.
- 8 g/l 생산되었으며, KG440과 KG443은 GlcN도 함께 생산되었다. 특히, KG440은 총 GlcNAc와 GlcN 생산량 측면에서 가장 우수한 결과를 나타내었다. 한편, GlcNAc-6-P와 GlcN-6-P의 탈 인산화와 세포 외 배출에 관한 기작은 알려져 있지 않지만, alkaline phosphatase와 sugar phosphatases의 촉매에 의해 탈 인산화되어 배출되는 것으로 추정된다.
후속연구
- 65 g/l의 GlcNAc을 생산하였다[13, 14]. 그러나, E. coli는 GRAS (generally regarded as safe) 미생물이 아니기 때문에 의약용 및 기능성 건강보조식품용으로는 많은 제한이 따르며, B. subtilis를 이용한 방법은 생산물의 농도가 낮아 추가적인 연구가 더 요구된다.
- coli를 생산 숙주로 사용하여 건강기능성 식품용도로 GlcNAc를 생산하는 것은 부적절한 것으로 사료된다. 또한, Bacillus는 아직 그 생산농도가 낮은 수준으로 추가적인 생산연구가 더 요구된다. 본 연구에서 개발된 Corynebacterium은 GlcNAc 생산농도는 매우 낮은 수준이지만, GRAS(generally regarded as safe) 미생물에서 GlcN과 GlcNAc를 처음으로 생산할 수 있음을 증명한 것에 그 의미를 부여할 수 있다.
- glutamicum 유래의 glucosamine-6-phosphatesynthase가 그 생산물인 glucosamine-6-phosphate에 의해 효소 활성이 강하게 저해를 받기 때문인 것으로 추정되므로, 향후 효소 개량을 통해 생산물 저해를 받지 않는 glucosamine6-phosphate synthase를 개발하거나 이미 개발된 다른 미생물 유래의 이종의 glmS를 도입하면 이 문제를 해결할 수 있을 것으로 판단된다[23]. 또한, 본 연구에서 개발된 균주를 사용하여 향후 GlcNAc의 유입 차단, 배출 강화와 같은 추가적인 대사공학과 배지 및 배양공정 최적화를 통해 고농도의 GlcNAc를 생산하는 기술을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서 개발된 Corynebacterium은 GlcNAc 생산농도는 매우 낮은 수준이지만, GRAS(generally regarded as safe) 미생물에서 GlcN과 GlcNAc를 처음으로 생산할 수 있음을 증명한 것에 그 의미를 부여할 수 있다. 한편, 생산농도가 매우 낮은 원인은 본 연구에 도입된 C. glutamicum 유래의 glucosamine-6-phosphatesynthase가 그 생산물인 glucosamine-6-phosphate에 의해 효소 활성이 강하게 저해를 받기 때문인 것으로 추정되므로, 향후 효소 개량을 통해 생산물 저해를 받지 않는 glucosamine6-phosphate synthase를 개발하거나 이미 개발된 다른 미생물 유래의 이종의 glmS를 도입하면 이 문제를 해결할 수 있을 것으로 판단된다[23]. 또한, 본 연구에서 개발된 균주를 사용하여 향후 GlcNAc의 유입 차단, 배출 강화와 같은 추가적인 대사공학과 배지 및 배양공정 최적화를 통해 고농도의 GlcNAc를 생산하는 기술을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
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